一种CTB/LTB多肽与VP8的融合蛋白及轮状病毒疫苗的制作方法

一种ctb/ltb多肽与vp8的融合蛋白及轮状病毒疫苗
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种ctb/ltb多肽与vp8的融合蛋白及轮状病毒疫苗。


背景技术：

2.轮状病毒引起的腹泻是5岁以下儿童最常见的疾病之一。一个孩子在5岁前的几个月里都患有腹泻，这些症状也与成长缓慢有关（glass r i ,lang d r ,ivanoff b n , et al. introduction: rotavirus-from basic research to a vaccine[j]. journal of infectious diseases(supplement_1):s1.）。这些数据引发了儿科医生和公共卫生专家的关注，预防和治疗轮状腹泻疾病成为提高儿童存活率的一个关键目标。
[0003]
早在1998年，wyeth推出了口服的轮状病毒疫苗rotashield，使用一年期间，发现接种的儿童发生肠套叠的风险增高，因此，产品不得不撤市。后来merck和gsk分别推出了口服轮状病毒活疫苗，这两个产品在全球80多个国家广泛应用，对控制轮状病毒造成的严重脱水性腹泻，以及其引起的住院和儿童死亡起到非常好的保护作用。由于口服轮状病毒活疫苗在低收入国家只有大约60%的保护作用，尽管如此，许多这些国家的疫苗覆盖率仍保持在大约70%（glass ri, jiang b, parashar u. the future control of rotavirus disease: can live oral vaccines alone solve the rotavirus problem. vaccine 2018; 36:2233
–
6），仅口服活疫苗无法完全控制轮状病毒疾病，人们未来想控制严重轮状病毒疾病的造成的公共卫生健康问题，新一代疫苗的研究将是非常必要的。


技术实现要素：

[0004]
为构建高可溶性的重组亚单位疫苗，本发明提供了一种ctb/ltb多肽与vp8的融合蛋白，此融合蛋白具有高免疫原性和较好的可溶性。还公开了一种轮状疫苗，能使得免疫机体产生较高的特异性抗体igg、igg1和igg2a。
[0005]
本发明通过下述技术方案实现：一种ctb/ltb多肽与vp8的融合蛋白，其氨基酸序列包括人轮状病毒vp8蛋白氨基酸片段和外源多肽片段组成，所述外源多肽片段为ctb-1，ctb-2和/或ltb-1，所述ctb-1的氨基酸序列如seq id no:1所示，ltb-1的氨基酸序列如seq id no:2所示，ctb-2的氨基酸序列如seq id no:6所示，所述vp8蛋白氨基酸片段是人轮状病毒wa株蛋白的氨基酸片段第64-223位氨基酸序列，其氨基酸序列如seq id no:3。
[0006]
融合蛋白为（1）ctb-vp8 p[8]，其氨基酸序列如seq id no:4所示；（2）ltb1-vp8 p[8]，其氨基酸序列如seq id no:5所示。3）ctb2-vp8 p[8]，其氨基酸序列如seq id no:7所示。
[0007]
一种轮状病毒疫苗，包含如前所述的融合蛋白。
[0008]
进一步的，所述融合蛋白为10-100微克。
[0009]
进一步的，还包含医学上可适用的佐剂。
[0010]
进一步的，所述融合蛋白和佐剂体积比为1：1。
[0011]
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明从ctb和ltb中筛选出多肽片段ctb-1、ctb-2和ltb-1，将多肽片段与轮状病毒的vp8蛋白进行融合表达，分别纯化得到3个多肽-vp8融合蛋白，具有较好的蛋白水溶性，并且能产生高免疫原性，所制备得到的疫苗能够使得小鼠产生较高的特异性抗体igg、igg1和igg2a。
附图说明
[0012]
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明融合蛋白合成图；图2为融合蛋白水溶性图；图3为纯化效果图；图4为免疫特异性结果图。
具体实施方式
[0013]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0014]
实施例1表达系统的构建。
[0015]
本发明通过对ctb和ltb蛋白的一级结构进行t细胞抗原表位分析筛选出2个多肽片段（如表一所示），其中一条来自ctb-1（含t细胞抗原表位），一条来自ltb-1（含t细胞抗原表位）。（ctb-1：霍乱肠毒素b亚单位；ltb-1：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位）。本发明还筛选出了一条不含t细胞抗原表位的多肽片段ctb-2，其氨基酸序列如seq id no：6。
[0016]
表一外源多肽序列多肽氨基酸序列ctb-1seqidno：1hgtpqnitdlcaeyhntqiltb-1seqidno：2gapqtitelcseyrntqictb-2seqidno：6tdlcaeyhntqiytlndkifs在本实施案例中，将ctb-1、ctb-2和ltb-1多肽与轮状病毒的vp8蛋白（aa64-223）进行融合表达，将得到如下融合蛋白（不含外源多肽的vp8p[8]本身作为对照）： 1）vp8p[8]2）ctb1-vp8p[8]融合蛋白，氨基酸序列如seq id no：4所示；3）ltb1-vp8p[8] 融合蛋白，氨基酸序列如seq id no：5所示；4）ctb2-vp8p[8] 融合蛋白，氨基酸序列如seq id no：7所示；表二轮状病毒vp8蛋白和融合蛋白的氨基酸序列轮状病毒毒株vp4p型vp8蛋白氨基酸序列wa株（genbank:mt025868）vp4p[8]seqidno：3其中vp8p[8]的序列来源于rotavirus a strain wa isolate rva/human-lab/
usa/g1p8/wa/virulent vp4 (vp4) gene（genbank:mt025868）的蛋白序列的氨基酸集团64-223。为了防止外源多肽影响vp8蛋白的2级和3级结构，在外源多肽和vp8之间增加了一个链接肽（gsgsg），链接肽由不带正电或负电荷的氨基酸组成，所以不影响蛋白的等电点。
[0017]
融合蛋白的dna序列交给北京擎科生物技术有限公司进行全序列合成，密码子按照大肠杆菌表达系统进行优化，优化后的序列：seq id no 8：霍乱肠毒素b亚单位（ctb1）多肽核酸序列；seq id no 9：霍乱肠毒素b亚单位（ctb2）多肽核酸序列；seq id no 10：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位（ltb）多肽核酸序列；seq id no 11：轮状病毒vp8 p[8]蛋白核酸序列（aa64-223）；seq id no 12： ctb1-vp8核酸序列；seq id no 13： ctb2-vp8核酸序列；seq id no 14： ltb-vp8核酸序列；seq id no 8：霍乱肠毒素b亚单位（ctb1）多肽核酸序列catggcaccccgcagaatattaccgatctgtgcgccgaatatcataatacccagatt；seq id no 9：霍乱肠毒素b亚单位（ctb2）多肽核酸序列accgatctgtgtgccgaatatcataatacccagatctataccctgaatgataaaattttc；seq id no 10：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位（ltb）多肽核酸序列ggtgcacctcagaccattaccgaactgtgcagtgaatatcgtaatacccagatt；seq id no 11：轮状病毒vp8 p[8]蛋白核酸序列（aa64-223）atgattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgttgtgtatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgccgttgtggccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagtaacaaatggaaatttctggagatgtttcgcagcagcagtcagaatgaattttataatcgtcgtaccctgaccagtgatacccgttttgtgggcattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggcgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagcagtagtaccgcaaatctgaataatattagcattaccatccacagcgaattttatattatcccgcgcagtcaggaaagtaaatgtaatgaatatatcaacaacggcctg；seq id no 12：ctb1-vp8核酸序列atgcatggcaccccgcagaatattaccgatctgtgcgccgaatatcataatacccagattggtagtggtagcggcattctggatggcccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagcaacaccaatggcgttgtttatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgcagttgttgccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagtaatgatagcaacaaatggaaatttctggaaatgtttcgcagtagtagtcagaatgaattttataatcgccgtaccctgaccagtgatacccgttttgttggcattctgaaatatggcggtcgcgtttggacctttcatggtgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagtagtagtaccgcaaatctgaataatattagtatcaccatccacagcgaattttatattattccgcgtagtcaggaaagcaaatgcaatgaatatattaacaacggtctgseq id no 13：ctb2-vp8核酸序列atgaccgatctgtgtgccgaatatcataatacccagatctataccctgaatgataaaattttcggtagtggtagtggtattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgtggtttatgaaagcaccaataatagtgatttctggaccgcagttgttgcaattgaaccgc
atgttaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagcaataagtggaaatttctggaaatgtttcgcagcagcagccagaatgaattttataatcgtcgcaccctgaccagcgatacccgttttgttggtattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggtgaaaccccgcgtgccaccaccgatagtagcagcaccgcaaatctgaataatattagtattaccatccacagtgagttttatattatcccgcgcagccaggaaagcaaatgtaatgaatatattaacaacggcctg；seq id no 14：ltb1-vp8核酸序列atgggtgcacctcagaccattaccgaactgtgcagtgaatatcgtaatacccagattggcagtggcagcggtattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgttgtgtatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgccgttgtggccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagtaacaaatggaaatttctggagatgtttcgcagcagcagtcagaatgaattttataatcgtcgtaccctgaccagtgatacccgttttgtgggcattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggcgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagcagtagtaccgcaaatctgaataatattagcattaccatccacagcgaattttatattatcccgcgcagtcaggaaagtaaatgtaatgaatatatcaacaacggcctg。
[0018]
将合成好的目的序列构建到pet30a的ndei和xhoi酶切位点之间（质粒构建过程由北京擎科生物科技有限公司完成），如图1所示。然后将有目标基因的质粒转化入bl21(de3)感受态菌体内，进行抗生素筛选。以t7启动子引物为测序引物，通过检测（北京擎科生物科技有限公司）证实目的片段插入pet30a载体的ndei和xhoi酶切位点之间（seq id no 12、seq id no 13和seq id no 14）。
[0019]
实施例2菌种培养和诱导表达。
[0020]
vp8蛋白是一个非糖基化的蛋白，因此，选择了大肠杆菌表达系统。所用的质粒为pet30a，宿主细胞e.coli bl21(de3)。挑取生长好的菌落在摇瓶中37 ℃，220rpm培养至od值约为0.5-0.8，然后把培养的温度降低到16 ℃，加入终浓度为0.2 mm的iptg诱导表达6-8个小时，诱导结束后将菌体收集，收集条件为4℃，4000 rpm离心30分钟。通过计算，1l的培养体积能够得到5-8g（湿重）的菌。sds-page（浓缩胶12.5%）检测分析证明菌体表达的蛋白都是可溶性蛋白，sds-page的结果显示目的蛋白大小与理论值相近，如图2所示。
[0021]
实施例3蛋白纯化。
[0022]
将收集的菌体（ltb1-vp8 /ctb1-vp8/ ctb2-vp8）用buffer a（10mm ph 8.0 tris-hcl 500mm nacl 30mm 咪唑）重悬，高压裂解后离心取上清。用buffer a平衡ni-nta nupharose ff层析柱子（纽龙，ni-nta nupharose ff，5ml），流速为1ml/min。将样品以1ml/min通过亲和柱，上样结束之后，用buffer a用冲洗亲和柱10个柱体积。蛋白的洗脱条件为：60%的buffer b（10mm ph 8.0 tris-hcl 500mm 咪唑）将目的蛋白洗脱下来。
[0023]
将蛋白通过10kda mwco的离心式过滤器（millipore）进行缓冲液的置换，将缓冲液置换成q buffer a（10mm ph 8.0 tris-hcl）。将置换缓冲液之后的样品以1ml/min的流速通过已经事先平衡好的阴离子交换q柱（cytiva，capto q，5ml）；目的蛋白洗脱条件是通过0-100% q buffer b（10mm ph 8.0 tris-hcl 0.5 m nacl）线性梯度进行洗脱10个柱体积。纯化之后的目的蛋白通过sds-page检测蛋白的纯化效果，如图3所示。
[0024]
实施例4抗原蛋白免疫原性研究。
[0025]
疫苗的配制。在本实施例中，在疫苗的配置中加入了氢氧化铝佐剂（invivogen, vac-alu-250）。配制的方法是用100微升的蛋白（分别含10微克、50微克和100微克蛋白）与100微升的氢氧化铝佐剂1：1混合乳化，然后放于4℃冰箱，准备免疫。
[0026]
动物实验的分组（本实验的动物小鼠均为健康的balb/c小鼠（mus musculus）（雄性），6-8周龄，22.5 g
ꢀ±ꢀ
2.5 g。），本试验中，小鼠采用随机区组法分成11组，每组6只，将小鼠分为对照组和实验组，其中对照组包含阴性对照组（0.01 m pbs，标号为：pbs组）和佐剂对照组（铝佐剂），分别选择融合蛋白ctb1-vp8组，ctb2-vp8组，ltb1-vp8 组和vp8组，不同的蛋白免疫剂量即10 μg、50 μg和100 μg免疫实验组。
[0027]
疫苗的免疫接种：免疫途径为后腿肌肉注射，免疫三次，一次基础免疫，两次加强免疫，每次免疫间隔两周。实验组中，每只小鼠每次免疫接种疫苗为200 μl（含100 μl融合蛋白稀释液和100 μl佐剂）。以相同途径免疫阴性对照pbs组（每只小鼠每次免疫接种200 μl的0.01 m pbs）和佐剂对照al组（每只小鼠每次免疫接种100 μl的0.01 m pbs和100 μl佐剂）。
[0028]
免疫接种后，观察并记录各组小鼠的情况，主要观察小鼠有无突发性死亡等情况。采血方式：采用断尾取血的方式进行收集小鼠血液，最后一次采血后可以直接将其处死。（注意：每只小鼠分别取样）血液样品的处理方式：（1）首先收集小鼠的尾部血液，盛于1.5 ml ep管内，至少满足每只每次得到的血清不低于100
ꢀµ
l。
[0029]
（2）收集血液后37 ℃放置1 h，取出放置4 ℃过夜，然后在4 ℃环境中，5000 rpm离心15 min。
[0030]
（3）仔细收集析出的上层血清，最后将血清分装（每只每次采血分装2管即可，每管50
ꢀµ
l）做好标记、置于-80 ℃保存。
[0031]
实施例5间接elisa法检测蛋白特异性抗体igg\igg1\igg2a。
[0032]
取保存于-80℃冰箱的免疫后血清，间接elisa法检测血清中各蛋白特异性抗体igg、igg1、gg2a。具体操作步骤如下：（1）、包被：用包被液稀释蛋白（抗原），稀释比例为1：200，每孔100 μl，4℃过夜。
[0033]
（2）、弃蛋白液，拍干，pbst洗3次，每次5 min（尽量加满，但不串孔）。
[0034]
（3）、封闭：5%脱脂奶粉封闭（加满），37℃，1h30min。
[0035]
（4）、pbst洗3次，每次5 min。
[0036]
（5）、待检血清样品稀释：选取阳性血清和阴性血清，用pbs稀释，稀释比例为1：400，每孔100 μl，37℃，1 h。
[0037]
（6）、pbst洗3次，每次5 min。
[0038]
（7）、加入相应的igg、igg1、gg2a的hrp二抗（按照说明书稀释），每孔100 μl，37℃，1 h。
[0039]
（8）、pbst洗5次，每次5 min。
[0040]
（9）、显色：每孔加入tmb，每孔100 μl，37℃，避光15-20 min。
[0041]
（10）、终止：加入2m h2so4，每孔100 μl，测od值（450nm）。
[0042]
注：igg二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg(h l)，a0216，上海碧云天生物技术有限公司）、igg1二抗（山羊抗小鼠igg1 (hrp)，ab97240，艾博抗（上海）贸易有限公司）、igg2a二抗（山羊抗小鼠igg2a heavy chain，ab97245，艾博抗（上海）贸易有限公司）。
[0043]
th1细胞分泌 ifn-γ，介导细胞免疫反应，th2细胞分泌il-4，促进体液免疫反应。但ifn-γ和il-4水平通常是反向调节的。il-4诱导th0细胞分化为th2细胞，th2细胞分泌的il-4促进th2细胞增殖，引起体液免疫，抑制th1增殖(chen, l. et al. il-4 induces differentiation and expansion of th2 cytokine-producing eosinophils. 2004, j immunol172, 2059-2066)，同时该因子能促进抗体向lgg1转换。ifn-γ及il-12促进th0向th1分化，th1细胞分泌ifn-γ，该细胞因子能促进抗体向lgg2a转换(prompetchara, e. et al. dna vaccine candidate encoding sars-cov-2 spike proteins elicited potent humoral and th1 cell-mediated immune responses in mice. plos one, 2021, 16, e0248007; ding, y. et al. a novel combined vaccine against classical swine fever and porcine epidemic diarrhea viruses elicits a significant th2-favored humoral response in mice. vaccine, 2021, 39, 4573-4576)。在小鼠体内，th1型会产生lgg2a型抗体，th2型会产生lgg1型抗体，通常使用lgg1/lgg2a来评价疫苗诱导的免疫应答中占主导地位的免疫应答(yue, x. et al. molecular characterization of a trichinella spiralis serine proteinase. vet res, 2020, 51, 125)。
[0044]
结果表3和如图4所示，在特异性抗体指标和igg1指标中可以看出：ctb1-vp8和ltb1-vp8蛋白的免疫效果显著高于ctb2-vp8蛋白组、vp8蛋白组、pbs对照组和al佐剂对照组（p《0.001），然而ctb2-vp8蛋白和vp8蛋白免疫的效果与pbs对照组和al佐剂对照组没有明显的差异（p》0.001），其中ctb1-vp8蛋白免疫组的效果最好。在igg2a指标中可以看出：ctb1-vp8和ltb1-vp8蛋白的免疫效果于vp8蛋白免疫效果相比，ctb1-vp8和ltb1-vp8蛋白免疫效果在第二次免疫呈现上升的趋势，并在42 day时与ctb2-vp8蛋白组、vp8蛋白组、pbs对照组和al佐剂对照组有明显的差异（p《0.05），在特异性抗体指标、igg1指标和igg2a指标中，vp8蛋白组与pbs对照组和al佐剂对照组没有明显的差异（p》0.05）。总的来说：ctb1-vp8和ltb1-vp8能刺激小鼠产生较高的特异性抗体和igg1和igg2a，能引起小鼠体内产生较好的免疫应答。
[0045]
表3 动物免疫后血清中特异性抗体、igg1和igg2a数据
本发明涉及到的氨基酸序列表如下：seq id no 1：霍乱肠毒素b亚单位（ctb1）多肽氨基酸序列；seq id no 2：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位（ltb）多肽氨基酸序列；seq id no 3：轮状病毒vp8 p[8]蛋白氨基酸序列（aa64-223）；seq id no 4：ctb1-vp8氨基酸序列；seq id no 5：ltb-vp8氨基酸序列；seq id no 6：霍乱肠毒素b亚单位（ctb2）多肽氨基酸序列；seq id no 7：ctb2-vp8氨基酸序列；seq id no 8：霍乱肠毒素b亚单位（ctb1）多肽核酸序列；seq id no 9：霍乱肠毒素b亚单位（ctb2）多肽核酸序列；seq id no 10：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位（ltb）多肽核酸序列；seq id no 11：轮状病毒vp8 p[8]蛋白核酸序列（aa64-223）；seq id no 12：ctb1-vp8核酸序列；seq id no 13：ctb2-vp8核酸序列；seq id no 14：ltb1-vp8核酸序列；seq id no 1：hgtpqnitdlcaeyhntqi；
seq id no 2：gapqtitelcseyrntqi；seq id no 3：mildgpyqpttftppndywilinsntngvvyestnnsdfwtavvaiephvnpvdrqytifgeskqfnvsndsnkwkflemfrsssqnefynrrtltsdtrfvgilkyggrvwtfhgetprattdssstanlnnisitihsefyiiprsqeskcneyinngl；seq id no 4：mhgtpqnitdlcaeyhntqigsgsgildgpyqpttftppndywilinsntngvvyestnnsdfwtavvaiephvnpvdrqytifgeskqfnvsndsnkwkflemfrsssqnefynrrtltsdtrfvgilkyggrvwtfhgetprattdssstanlnnisitihsefyiiprsqeskcneyinngl；seq id no 5：mgapqtitelcseyrntqigsgsgildgpyqpttftppndywilinsntngvvyestnnsdfwtavvaiephvnpvdrqytifgeskqfnvsndsnkwkflemfrsssqnefynrrtltsdtrfvgilkyggrvwtfhgetprattdssstanlnnisitihsefyiiprsqeskcneyinngl；seq id no 6：tdlcaeyhntqiytlndkif；seq id no 7：mtdlcaeyhntqiytlndkifgsgsgildgpyqpttftppndywilinsntngvvyestnnsdfwtavvaiephvnpvdrqytifgeskqfnvsndsnkwkflemfrsssqnefynrrtltsdtrfvgilkyggrvwtfhgetprattdssstanlnnisitihsefyiiprsqeskcneyinngl；seq id no 8：霍乱肠毒素b亚单位（ctb1）多肽核酸序列catggcaccccgcagaatattaccgatctgtgcgccgaatatcataatacccagatt；seq id no 9：霍乱肠毒素b亚单位（ctb2）多肽核酸序列accgatctgtgtgccgaatatcataatacccagatctataccctgaatgataaaattttc；seq id no 10：大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位（ltb）多肽核酸序列ggtgcacctcagaccattaccgaactgtgcagtgaatatcgtaatacccagatt；seq id no 11：轮状病毒vp8 p[8]蛋白核酸序列（aa64-223）atgattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgttgtgtatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgccgttgtggccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagtaacaaatggaaatttctggagatgtttcgcagcagcagtcagaatgaattttataatcgtcgtaccctgaccagtgatacccgttttgtgggcattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggcgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagcagtagtaccgcaaatctgaataatattagcattaccatccacagcgaattttatattatcccgcgcagtcaggaaagtaaatgtaatgaatatatcaacaacggcctg；seq id no 12：ctb1-vp8核酸序列atgcatggcaccccgcagaatattaccgatctgtgcgccgaatatcataatacccagattggtagtggtagcggcattctggatggcccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagcaacaccaatggcgttgtttatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgcagttgttgccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagtaatgatagcaacaaatggaaatttctggaaatgtttcgcagtagtagtcagaatgaattttataatcgccgtaccctgaccagtgatacccgttttgttggcattctgaaatatggcggtcgcgtttggacctttcatggtgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagtagtagta
ccgcaaatctgaataatattagtatcaccatccacagcgaattttatattattccgcgtagtcaggaaagcaaatgcaatgaatatattaacaacggtctgseq id no 13：ctb2-vp8核酸序列atgaccgatctgtgtgccgaatatcataatacccagatctataccctgaatgataaaattttcggtagtggtagtggtattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgtggtttatgaaagcaccaataatagtgatttctggaccgcagttgttgcaattgaaccgcatgttaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagcaataagtggaaatttctggaaatgtttcgcagcagcagccagaatgaattttataatcgtcgcaccctgaccagcgatacccgttttgttggtattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggtgaaaccccgcgtgccaccaccgatagtagcagcaccgcaaatctgaataatattagtattaccatccacagtgagttttatattatcccgcgcagccaggaaagcaaatgtaatgaatatattaacaacggcctg；seq id no 14：ltb1-vp8核酸序列atgggtgcacctcagaccattaccgaactgtgcagtgaatatcgtaatacccagattggcagtggcagcggtattctggatggtccgtatcagccgaccacctttaccccgccgaatgattattggattctgattaatagtaacaccaacggcgttgtgtatgaaagcaccaataatagcgatttttggaccgccgttgtggccattgaaccgcatgtgaatccggttgatcgccagtataccatttttggcgaaagcaaacagtttaatgtgagcaatgatagtaacaaatggaaatttctggagatgtttcgcagcagcagtcagaatgaattttataatcgtcgtaccctgaccagtgatacccgttttgtgggcattctgaaatatggcggccgcgtttggacctttcatggcgaaaccccgcgtgcaaccaccgatagcagtagtaccgcaaatctgaataatattagcattaccatccacagcgaattttatattatcccgcgcagtcaggaaagtaaatgtaatgaatatatcaacaacggcctg。
[0046]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。