一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用与流程

1.本发明属于细胞分化技术领域，尤其涉及一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.终末期糖尿病仍是目前为止严重影响人类生存质量的重大慢性疾病，我国已经成为世界上糖尿病患病人数最多的国家。胰岛移植是目前治疗终末期糖尿病的一种有效选择方案，是具有吸引力的外科方法。胰岛移植目前采用同种异体移植方式。可以单独胰岛移植治疗糖尿病，也可和肾脏同时移植或者序贯移植治疗糖尿病并发尿毒症。然而，现阶段胰岛移植临床疗效仍不满意，其中主要的原因一是胰岛移植目前仍无法实现术后长期血糖的有效控制，只有40％-60％的患者在移植后5年不需要依赖胰岛素；二是胰岛移植的数量要求一般不低于30万个胰岛/次，对细胞数量要求较高；三是胰岛的制备过程成本较高，从单一胰腺提取胰岛的试剂成本目前约为10万元，且提取胰岛需要在专门的试验室进行，成本较高；四是目前胰岛来源多为同种异体，移植后仍需要终生使用免疫抑制剂。为解决以上问题，近年来利用干细胞作为细胞来源，分化成为胰岛细胞后进行胰岛移植成为研究的热点。例如，近期邓宏魁团队利用人多功能干细胞直接分化制备胰岛细胞，将其移植入非人灵长类糖尿病动物模型中，系统验证了人多能干细胞分化的胰岛治疗糖尿病的安全性和有效性。此外，临床上也在一直寻找来源更常规及更广泛的干细胞作为分化来源。
3.外周血就是除骨髓之外的血液。临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，这样的干细胞被称为外周血干细胞。利用细胞分离技术，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。一些已有研究表明利用来源于自身的外周血干细胞注射至胰腺局部，从而改善胰腺功能，治疗糖尿病，这种技术的原理是外周血干细胞可能会分泌一些细胞因子，可以改善和促进胰腺功能，可以绕过同种异体胰岛移植供体不足和免疫排斥两大障碍，短期疗效较好。但是长期效果未知。临床认为，干细胞如要获得胰岛功能，还是需要分化成稳定的胰岛细胞实现。
4.外周血干细胞具有细胞来源广，可直接从自身获得等特点，是一个非常具有应用前景的胰岛细胞来源。而近年来已有多篇文献报道干细胞向胰岛细胞的分化需要先将干细胞分化成内胚层细胞后再利用小分子进行胰岛细胞的定向分化。这是因为胰岛细胞就是一种内胚层来源的细胞类型。而目前从内胚层细胞分化成为胰岛细胞的技术已较为成熟，而将外周血干细胞分化成内胚层细胞尚无成熟技术。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
6.本发明是这样实现的，一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法，将外周血干细胞置于bm、activin a、wnt3a、tgf-b、lif、tnf-a、ifn-a、vinterferron-α,β,γ、b-27、n2存在条件下诱导培养，得到内胚层细胞。
7.进一步地，所述activin a的浓度为5-10ng/ml，所述wnt3a的浓度为50ng/ml，所述tgf-b的浓度为100ng/ml，所述lif的浓度为100ng/ml，所述tnf-a的浓度为60ng/ml，所述ifn-a的浓度为60ng/ml，所述vinterferron-α,β,γ的浓度为100ng/ml，所述b-27的含量为2％，所述n2的含量为1％。
8.进一步地，外周血干细胞分化过程中依次加入以下因子：
9.第1天：bm activin a 5ng/ml wnt3a 50ng/ml；
10.第2天-第5天：bm activin a 5ng/ml；
11.第6—第11天：tgf-b 100ng/ml lif 100ng/ml tnf-a 60ng/ml ifn-a 60ng/ml；
12.第12—18天：activin a 10ng/ml vinterferron-α,β,γ100ng/ml b-27 2％ n
2 1％。
13.进一步地，外周血干细胞培养浓度为每毫升1-3*106个细胞。
14.进一步地，诱导培养的条件为37℃，5％co2条件中培养。
15.进一步地，每隔一天更换新的培养液。
16.本发明还提供了如上述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法在诱导外周血干细胞分化成内胚层细胞中的应用。
17.本发明还提供了如上述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法在诱导外周血干细胞分化成胰岛细胞中的应用。
18.本研究为一项外周血干细胞分化成内胚层干细胞的关键技术，该技术有望解决胰岛细胞来源问题和胰岛移植的异源问题，提高胰岛移植的临床效果和移植物的长期存活。
19.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
20.1、外周血干细胞具有细胞来源广的特点，相较于其他类型干细胞更易于获得；
21.2、外周血干细胞易于从自身获得，从而移植后无需考虑排斥反应，无需终身服用免疫抑制药物；
22.3、该技术提供了一项将外周血干细胞分化成内胚层细胞的标准方案，是对内胚层细胞分化成胰岛细胞的技术补充，加大了干细胞分化成胰岛细胞并用于胰岛移植的临床应用范围。此外，该技术可以解决常规由人胚胎干细胞定向诱导分化为内胚层细胞技术中人胚胎干细胞的成瘤性问题，因此具有创新性。
附图说明
23.图1是分化方案示意图；
24.图2是相关因子质粒转染效果；质粒转染293t细胞24小时后荧光显微镜图像，a为显微镜下明视野(x200)，b为显微镜下绿色荧光视野(x200)，图1说明质粒转染效率达到要求；
25.图3是慢病毒介导相关因子转染效果；慢病毒介导nkx6.1转染外周血干细胞96小时后荧光显微镜图像，a为显微镜下明视野(x200)，b为显微镜下绿色荧光视野(x200)，图2说明慢病毒转染效率达到要求；
26.图4是内胚层细胞转化效率图；通过本技术成功将外周血干细胞转化成内胚层细胞的转化效率图和鉴定图，其中sox17是内胚层特异性marker。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
29.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
30.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
31.本发明披露了一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用，细胞分化步骤如图1所示。
32.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
33.实施例1
34.具体实验步骤：
35.①
外周血干细胞来源：使用药物动员剂促使造血干细胞从骨髓释放到外周血，然后通过血细胞分离机从循环血中收集造血干细胞。采集过程完全在密闭的环境下进行。具体获取及分离步骤如下：
36.i.对健康志愿者使用药物动员剂重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhg-csf)促使造血干细胞从骨髓释放到外周血，48小时后收集志愿者外周血，进一步对造血干细胞的分离与培养。造血干细胞的分离技术参考已有的标准技术。
37.ii.将获取的外周血按4:1比例加入6％羟乙基淀粉(hes)，自然沉降红细胞后，分离上层液体；分离细胞在4℃下，以1500r/min离心10分钟，将细胞沉淀物用1％白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
38.iii.接种与培养，将细胞以3x 106/ml密度接种于培养瓶中，加入imdm培养基于37℃5％co2孵箱中培养，每3天换液。
39.②
细胞分化及培养：分化的整个过程是在500ml旋转瓶生物反应器(康宁公司)中进行的。用0.25％胰蛋白酶-edta孵育细胞5分钟，然后将外周血干细胞分离成单细胞，重悬于500ml旋转瓶中，每毫升保持1-3x 106个细胞，置于300ml冰冷的干细胞培养液bm培养基
中(bm培养基配方：标准dmem培养基(gibco) 4.5g/l d-葡萄糖 2mm谷氨酰胺 110mg/l丙酮酸钠(gibco) fbs(gibco) 100u/ml盘尼西林 100mg/ml链霉素)。在分化过程中依次加入以下因子：
40.第1天：bm培养基 activin a(5ng/ml) wnt3a(50ng/ml)
41.第2天—第5天：bm activin a(5ng/ml)
42.第6—第11天：tgf-b(100ng/ml) lif(100ng/ml) tnf-a(60ng/ml) ifn-a(60ng/ml)
43.第12—18天：activin a(10ng/ml) vinterferron-(100ng/ml) b-27(2％) n2(1％)
44.以上过程中，利用移液器向培养瓶中按照时间依次加入以上因子，此外，细胞培养基每隔一天补充/更换一次，更换培养液时，先将细胞以1400rpm/min离心收集，再用移液器将细胞加入新的培养基中。
45.以上因子通过慢病毒或质粒进行转染，转染效果见图2和图3。第18天收集细胞，并进行内胚层细胞鉴定。
46.内胚层细胞的鉴定：根据目前已发表文献进行内胚层细胞的鉴定。一般来说，内胚层细胞包含roxi-阳性(表达roxi)，而非内胚层细胞roxi-阴性(不显著表达roxi的内胚层细胞)。据此，本技术中通过流式细胞分选法确定含roxi-阳性的细胞，确定分化比率，效果图如图4所示，分化比率接近75％。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。