一种纯化质粒的方法与流程

一种纯化质粒的方法
1.技术领域
2.本发明描述了一种纯化质粒的方法。该方法主要应用于生物制药领域的中试和工业化生产中的质粒制备。
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背景技术：

4.质粒是一种染色体外遗传因子，广泛存在于自然界中。目前质粒作为遗传信息载体，已广泛应用于基因转移操作中。尤其是近年来，随着先进治疗方法（包括基因治疗和细胞治疗）的飞速发展，质粒的生产已由实验室逐步转向工业化大规模生产。
5.在质粒的工业化大规模生产中，面临了诸多挑战，其中包括提高质粒纯度，获得符合药用要求的质粒纯品。根据现行法规要求，质粒最终制品应当尽可能的去除细胞蛋白、dna、rna等污染物。然而，目前常用的一些方法，不能有效去除这些污染物，尤其是rna污染物，或者需要添加酶、去污剂等试剂，增加了去除成本。
6.本发明的主要目的，是获得一种可以在工业生产中经济高效去除rna污染的方法。
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技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本发明提供了一种新的纯化质粒的方法，其包括：（1）裂解包含待纯化质粒的细菌培养物，获得裂解物；（2）向裂解物中加入终浓度为0.5-1m的氯化钙溶液，获得粗提取物；（3）将粗提取物用膜过滤器进行过滤，获得滤液；（4）将滤液用阴离子交换柱进行层析，获得纯化质粒。所述方法优选用于工业化生产。
9.在一个实施方案中，步骤（1）使用碱裂解法裂解包含待纯化质粒的细菌培养物。碱裂解法提取质粒的方法是本领域技术人员已知的。一般而言，碱裂解法使用三种溶液：重悬缓冲液（te缓冲液，ph8.0）、裂解液（0.2m naoh 2% sds溶液）、中和液（3m 醋酸钾缓冲液，ph5.5）。使用时，先用重悬缓冲液将大肠杆菌培养物重悬均匀，然后加入等比例的裂解液，作用3-6分钟后，再加入等比例的醋酸钾缓冲液中和，即获得裂解物。本领域技术人员已知的其他碱裂解法也可用于本发明。
10.在一个实施方案中，步骤（2）中所用的氯化钙的ph为5.0-7.0。
11.在一个实施方案中，步骤（2）进一步包括在室温下静置20-40分钟，优选30分钟。
12.在一个实施方案中，本发明的纯化质粒的方法进一步在步骤（2）之后包括：将粗提取物进行离心，然后用膜过滤器进行过滤；优选于4℃下离心。
13.在一个实施方案中，步骤（3）所用的膜过滤器的孔径为1μm。
14.在一个实施方案中，本发明的纯化质粒的方法进一步在步骤（3）之后包括：调节滤液的电导率为15-40ms/cm，优选20-35 ms/cm，更优选35 ms/cm。优选地，用注射用水或超纯水调节滤液的电导率。虽然加入氯化钙能够去除rna污染物，但同时也会使溶液体系的电导
率升高，不利于后续的阴离子交换柱吸附质粒。因此，在用阴离子交换柱纯化之前，需要检测滤液的电导率并将其调节至合适水平。
15.在一个实施方案中，步骤（4）所用的阴离子交换柱是deae交换柱。deae可以起到增强rna去除效果的作用。deae是阴离子交换层析常用的填料配基之一，可用于质粒纯化。其原理是利用配基所带的正电荷吸附质粒所带负电荷，进而将质粒吸附到层析柱上。然后，采用梯度洗脱的方式，先将rna污染物从层析柱上冲洗下来，然后将质粒从层析柱上洗脱下来，使其与rna污染物进一步分离。
16.本发明的有益效果在于：与传统质粒纯化方法添加酶或者去污剂例如苯酚、氯化铯等以去除rna污染物相比，本发明的方法仅通过加入特定浓度的氯化钙即可去除大部分的rna污染物，不仅降低了成本，而且操作简单、不会产生污染或毒性。并且，由于本发明使用的氯化钙的ph值和温度与常规碱裂解一致，因此在裂解后无需进行额外的调节或纯化步骤即可直接加入氯化钙以完成rna污染物的去除。此外，使用特定的0.5-1m的氯化钙浓度并结合阴离子交换柱层析，不仅能最大程度地去除rna污染，而且能保证质粒含量，使得本发明的方法更加适合于工业化的质粒提取。
17.附图说明
18.图1：使用不同终浓度的氯化钙纯化质粒前后的电泳图。1-5：氯化钙终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、1m的粗提取物；p1-p5：氯化钙终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、1m的纯化质粒。方框示出了rna的凝胶电泳条带。
19.图2：纯化质粒的紫外吸收图谱。洗脱峰1主要成分是rna，洗脱峰2主要成分是质粒。
20.具体实施方式
21.下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
22.实施例1. 用本发明的方法纯化质粒1. 碱裂解大肠杆菌培养物：用重悬缓冲液（te缓冲液，ph8.0）将包含待纯化质粒的大肠杆菌培养物重悬均匀，然后加入等比例的裂解液（0.2m naoh 2% sds溶液），5分钟后，再加入等比例的3m醋酸钾缓冲液中和，获得3l裂解物；2. 将裂解物分成5份，每份600ml，向其中一份加入125ml超纯水（即，氯化钙浓度为0，样品1），并向其余4份裂解物分别加入125ml各种浓度的cacl2溶液（ph5.0-7.0），使体系中的氯化钙终浓度分别为0.1m（样品2）、0.3m（样品3）、0.5m（样品4）、1m（样品5）。
23.3. 在室温下静置30分钟后，取10μl上清液进行电泳（电泳结果参见图1中的1-5），并取400ml上清液，在4000rpm下于4℃离心20min，然后用1μm膜过滤器（科百特，货号a50bacht10a1p）过滤，获得滤液。
24.4. 检测滤液的电导率，根据电导率的不同，用超纯水调节电导率为35ms/cm，然后用deae阴离子交换柱（bia，货号411.5114-2）进行纯化，获得纯化质粒，同时检测纯化质粒
的紫外吸收值（结果如图2所示）。
25.5. 取10μl纯化质粒进行电泳，检测rna去除效果（电泳结果参见图1中的p1-p5）。
26.从图1可以看出，随着加入的氯化钙浓度的增加，粗提取物中的rna浓度逐渐降低，经过阴离子交换柱的纯化后，样品4和5中的rna几乎已经完全去除。
27.图2示出了纯化质粒的rna含量（洗脱峰1）和质粒含量（洗脱峰2）。可以看出，使用0.5-1m的氯化钙进行纯化后的质粒含量最高。
28.本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种纯化质粒的方法，其包括：（1）裂解包含待纯化质粒的细菌培养物，获得裂解物；（2）向裂解物中加入终浓度为0.5-1m的氯化钙溶液，获得粗提取物；（3）将粗提取物用膜过滤器进行过滤，获得滤液；（4）将滤液用阴离子交换柱进行层析，获得纯化质粒。2.权利要求1所述的方法，其中步骤（1）使用碱裂解法裂解大肠杆菌培养物。3.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中所用的氯化钙的ph为5.0-7.0。4.权利要求1所述的方法，其中步骤（2）进一步包括在室温下静置20-40分钟。5.权利要求1所述的方法，其中进一步在步骤（2）之后包括：将粗提取物进行离心，然后用膜过滤器进行过滤。6.权利要求1所述的方法，其中步骤（3）所用的膜过滤器的孔径为1μm。7.权利要求1所述的方法，其中进一步在步骤（3）之后包括：调节滤液的电导率为15-40ms/cm。8.权利要求7所述的方法，其中用注射用水或超纯水调节滤液的电导率。9.权利要求1所述的方法，其中步骤（4）所用的阴离子交换柱是deae交换柱。

技术总结
本发明涉及一种可用于工业化生产的质粒提纯方法，其包括以下步骤：（1）裂解包含待纯化质粒的细菌培养物，获得裂解物；（2）向裂解物中加入终浓度为0.5-1M的氯化钙溶液，获得粗提取物；（3）将粗提取物用膜过滤器进行过滤，获得滤液；（4）将滤液用阴离子交换柱进行层析，获得纯化质粒。化质粒。化质粒。


技术研发人员：李彦林 陈明曦 任江涛 贺小宏 王延宾 韩露
受保护的技术使用者：江苏浦珠生物医药科技有限公司
技术研发日：2020.09.10
技术公布日：2022/3/10