钝齿棒杆菌表面蛋白ProH及其在表面展示系统中的应用

钝齿棒杆菌表面蛋白proh及其在表面展示系统中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种钝齿棒杆菌表面蛋白proh，及其作为锚定蛋白在钝齿棒杆菌表面展示系统中的应用。


背景技术：

2.微生物细胞表面展示技术利用分子生物学手段将外源靶蛋白或多肽基因与锚定蛋白基因融合导入宿主中，具体而言，是一种通过特定锚定蛋白将蛋白质或多肽在微生物细胞表面的固定化技术，被展示的靶蛋白可以保持原有的空间构象和生物活性。微生物细胞表面展示在全细胞催化剂、多肽分离、全细胞吸附剂、蛋白文库筛选、疫苗和抗体生产、生物修复、生物传感器等方面都有广阔的应用前景。
3.目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。钝齿棒杆菌是我国科学家从土壤中分离的一种革兰氏阳性菌，广泛应用于氨基酸、有机酸、醇等化合物的生产，属于食品级微生物，具有较低的细胞外蛋白酶活性等优点，具有非常广阔的在微生物细胞表面展应用前景。目前，钝齿棒杆菌的展示系统的研发极少。为增加钝齿棒杆菌细胞表面展示技术的多功能性，开发新的和有效的锚定蛋白非常必要。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种钝齿棒杆菌表面蛋白proh。
5.本发明的另一目的在于提供编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh的基因。
6.本发明的又一目的在于提供一种钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
7.本发明的再一目的在于提供所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：一种钝齿棒杆菌表面蛋白proh，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
9.所述的钝齿棒杆菌蛋白由56个氨基酸组成，大小约为6.02kda。
10.编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh的基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
11.所述的钝齿棒杆菌表面蛋白proh作为锚定蛋白在钝齿棒杆菌表面展示系统中的应用。
12.所述的表面展示系统为钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，所述的钝齿棒杆菌表面蛋白proh可用于构建钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统是以所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh为锚定蛋白将靶蛋白固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的。
13.一种钝齿棒杆菌细胞表面展示系统，是以所述的钝齿棒杆菌表面蛋白proh为锚定蛋白，将靶蛋白固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的。
14.所述的靶蛋白为荧光蛋白或任意一种蛋白质。
15.所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
(1)将编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh的基因与靶蛋白基因通过搭桥pcr得到融合片段；(2)将步骤(1)中得到的融合基因片段插入表达载体构建表达细胞表面展示蛋白的载体；(3)将步骤(2)构建的载体转化钝齿棒杆菌，然后根据表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
16.所述的钝齿棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，具体包括如下步骤：(i)将编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh的基因、靶蛋白的基因和表达载体通过同源重组的方式，构建得到重组质粒；(ii)将步骤(i)中得到重组质粒转化钝齿棒杆菌，挑取阳性克隆子，得到所述钝齿棒杆菌细胞表面展示系统。
17.步骤(i)中所述的编码所述钝齿棒杆菌表面蛋白proh的基因序列如seq id no:2所示。
18.步骤(i)中所述的靶蛋白为增强绿色荧光蛋白(sfgfp)或其他靶蛋白。
19.所述的增强绿色荧光蛋白(sfgfp)的核苷酸序列如seq id no:3所示。
20.步骤(i)中所述的表达载体为规带有氯霉素抗性的谷氨酸棒杆菌/钝齿棒杆菌表达载体；优选为钝齿棒杆菌表达载体pxmj19。
21.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明提供了一种钝齿棒杆菌表面蛋白proh，是钝齿棒杆菌的一个跨膜蛋白，经验证，钝齿棒杆菌表面蛋白proh与增强绿色荧光蛋白的融合蛋白在钝齿棒杆菌表面有非常高的表达量，因此，可将其用于构建高展示效率的钝齿棒杆菌表面展示系统；(2)本发明中钝齿棒杆菌表面展示系统是以钝齿棒杆菌表面蛋白proh为锚定蛋白，将靶蛋白(如荧光蛋白或其他蛋白)固定在钝齿棒杆菌细胞表面构成的，提高了钝齿棒杆菌表面展示系统的内源的锚定蛋白的表达效率。
附图说明
22.图1是sfgfp基因、钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因、sfgfp基因和钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因搭桥pcr连接产物。
23.图2是含有重组质粒pxmj19-proh-sfgfp菌株、含有重组质粒pxmj19-sfgfp菌株和阴性对照菌株荧光显微镜图。
具体实施方式
24.下面结合实施案例对本发明进行详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。除非特别说明，本发明涉及的试剂、方法及设备为本技术领域常规试剂、方法及设备。下列实施案例中未注明的具体试验方法及条件，通常按照常规实验方法及条件。除非特别说明，本发明所用材料及试剂均可通过市售获得。
25.实施案例：钝齿棒杆菌表面展示sfgfp(1) 钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因的克隆根据钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因序列(seq id no:2)，靶蛋白sfgfp基因以及
pxmj19上的序列特征，设计扩增引物：p1：5'-attaattaagcttgcatgcctatggatctttccgttctcaaggaa-3' (seq id no:4)；p2：5'-ctcctttgccgcttccttggcagcctcctttgctgcttcggaagagagcttatccaggt-3' (seq id no:5)。
26.以钝齿棒杆菌的基因组dna为模板，以p1和p2为引物，通过pcr方法扩增出钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因序列，扩增条件为：预变性95℃ 5分钟；再进行30个以下循环：95℃变性5秒、62℃退火5秒、72℃延伸5秒；最后72℃延伸10分钟。
27.(2)靶蛋白sfgfp基因的克隆根据靶蛋白sfgfp基因(seq id no:3)，钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因序列(seq id no:2)以及pxmj19上的序列特征，设计扩增引物：p3：5'-ccaaggaagcggcaaaggaggcggccaaggaggcagcaaagatgcataaacgagaagaa-3' (seq id no:6)；p4：5'-ctgaattcgagctcggtacccttattatttgtagagctcatccatgccatgt-3'(seq id no:7)。
28.以prsetb-sfgfp质粒为模板，以p3和p4为引物，通过pcr方法扩增出靶蛋白sfgfp基因，扩增条件为：预变性95℃5分钟；再进行30个以下循环：95℃变性10秒、60℃退火10秒、72℃延伸10秒；最后72℃延伸10分钟。
29.(3)载体pxmj19质粒的克隆根据质粒pxmj19上的序列特征，设计扩增引物：p5：5'-gggtaccgagctcgaattcagcttg-3' (seq id no:8)；p6：5'-aggcatgcaagcttaattaattctgt-3' (seq id no:9)。
30.以pxmj19为模板，以p5和p6为引物，通过pcr方法扩增出载体pxmj19的序列，扩增条件为：预变性95℃5分钟；再进行30个以下循环：95℃变性10秒、65℃退火10秒、72℃延伸1分钟；最后72℃延伸5分钟。
31.(4) proh-sfgfp基因融合片段的合成将步骤(1)中得到的钝齿棒杆菌表面蛋白proh基因的pcr产物与步骤(2)中得到的sfgfp绿色荧光蛋白基因的pcr产物作为模板，以p1和p4为引物，通过pcr方法扩增出proh-sfgfp基因融合片段，扩增条件为：预变性95℃5分钟；再进行30个以下循环：95℃变性10秒、62℃退火10秒、72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分钟。最后琼脂糖凝胶电泳检测，图1表明电泳条带大小符合预期，表明基因片段融合成果。
32.(5)载体pxmj19-proh-sfgfp的构建将步骤(3)中得到的质粒pxmj19的pcr产物与步骤(1)中得到的proh-sfgfp基因融合片段经过同源重组(该步骤使用novorec一步定向克隆试剂盒)连接，将连接体系转化大肠杆菌宿主dh5α(购自吐露港)。用含25mg/l氯霉素的lb平板筛选转化子，使用鉴定阳性的转化子，提取质粒，鉴定并测序，结果表明序列正确。
33.(6)重组钝齿棒杆菌表面展示体系pxmj19-proh-sfgfp的构建和鉴定用电转法将步骤(5)中得到的质粒pxmj19-proh-sfgfp转化钝齿棒杆菌后，涂布在含氯霉素12.5mg/l的lb平板上挑取阳性转化子。
34.(7)含有pxmj19-sfgfp质粒的对照菌株构建和鉴定
根据靶蛋白sfgfp基因(seq id no:3)以及pxmj19上的序列特征，设计扩增引物：p7：5'-attaattaagcttgcatgcctatgcataaacgagaagaactttt-3' (seq id no:10)。
35.①
含有pxmj19-sfgfp质粒的对照菌株构建：以sfgfp(seq id no:3)为模板，以p5和p4为引物，通过pcr方法扩增出sfgfp的基因序列；以质粒pxmj19为模板，以p5和p6为引物，通过pcr方法扩增出质粒pxmj19的序列；然后将sfgfp基因的pcr产物与质粒pxmj19的序列的pcr产物经过一步克隆法同源重组连接，最后构建含有pxmj19-sfgfp质粒的对照菌株，具体制备与鉴定方法参见上述步骤(1)~(6)；(8) 重组钝齿棒杆菌表面展示体系pxmj19-proh-sfgfp的荧光显微镜分析将含有pxmj19-proh-sfgfp重组菌接种于25ml含12.5mg/l和0.5 mm iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷)的lb液体培养基中，在30℃，220rpm条件下培养8小时，对样品进行离心和再悬浮，然后将其涂在显微镜载玻片上，最后通过荧光微镜进行观察，含有pxmj19-proh-sfgfp重组菌相较于对照菌表面荧光较强(图2)。
36.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。