胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引物、探针及其试剂盒和应用的制作方法

技术特征：
1.一种胎儿染色体非整倍体多重数字pcr检测的引物和探针，其特征在于，包括：用于检测第21号染色体非整倍体的seq id no.1-40所示核苷酸序列的引物和seq id no.121所示核苷酸序列的探针；用于检测第18号染色体非整倍体的seq id no.41-80所示核苷酸序列的引物和seq id no.122所示核苷酸序列的探针；用于检测第13号染色体非整倍体的seq id no.81-120所示核苷酸序列的引物和seq id no.123所示核苷酸序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物和探针，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端淬灭基团连接；优选的，所述探针加入了lna修饰和/或mgb修饰；优选的，用于检测21号染色体的探针5’端标记为fam荧光修饰，3’端标记为bhq1淬灭修饰；优选的，用于检测18号染色体的探针5’端标记为hex荧光修饰，3’端标记为bhq1淬灭修饰；优选的，用于检测13号染色体的探针5’端标记为rox荧光修饰，3’端标记为bhq2淬灭修饰。3.根据权利要求1或2所述的引物和探针在制备胎儿染色体非整倍体多重数字pcr检测的试剂盒中的应用。4.一种胎儿染色体非整倍体多重数字pcr检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物和探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括pcr反应液；所述pcr反应液至少包括无核酸酶水、缓冲液buffer和taq酶。6.一种胎儿染色体非整倍体多重数字pcr检测的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：1)对待测样品进行处理，提取脱落细胞dna或血浆游离dna；2)利用权利要求4或5所述的试剂盒以及所述提取的dna，配制多重数字pcr扩增反应液；3)将所述反应液置于多重数字pcr设备中，生成液滴并进行pcr扩增、拍照以及数据分析；4)分别获得fam、hex和rox荧光通道检测结果，分别计算提取的dna中21、18和13号染色体的拷贝数比值，通过统计学方法判定胎儿是否存在13、18或21号染色体非整倍体疾病。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述待测样品为含有胎儿dna的样品，如孕周至少5周的孕妇宫颈脱落细胞或孕周至少10周的孕妇外周血，优选为孕周5-8周的孕妇宫颈脱落细胞。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述多重数字pcr扩增反应液中，每对所述引物的终浓度为100-400nm；所述探针的终浓度为100-400nm；优选的，按总体积25ul计算，所述多重数字pcr扩增反应液配方包括：缓冲液buffer 12.5ul、taq酶0.6ul、无核酸酶水5-7ul和提取的dna 1-2.5ul。9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所述多重数字pcr程序
为：95℃预变性10分钟；45个循环94℃变性10秒，58-60℃退火延伸1分钟；98℃酶灭活5分钟；35℃保温。10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)所述判定的方法为：阴性样本的判定：当13、18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在0.95-1.05时，则检测样本不存在13、18或21号染色体的拷贝数变异情况；阳性样本的判定：当13、18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在1.05-1.5时，则检测样本存在13、18或21号染色体的拷贝数变异情况。

技术总结
本发明提供了一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引物、探针及其试剂盒和应用，包括用于检测第21、18、13号染色体非整倍体的引物和探针。本发明克服了NGS技术平台耗时长、成本高和技术操作要求高，以及常规多重数字PCR需要设计和使用多条检测探针导致的成本高，设计难度高等缺点；本发明可使用但不限于使用孕周5～8周的宫颈脱落细胞或其他含有胎儿DNA的样本，避免有创取样导致的流产情况，是一种操作简单、成本低、时效快且准确度高的试剂盒及检测方法，可用于多重数字PCR平台检测胎儿染色体拷贝数变异现象。胎儿染色体拷贝数变异现象。胎儿染色体拷贝数变异现象。


技术研发人员：洪炯志 富继义
受保护的技术使用者：麦克奥迪（厦门）病理研究院有限公司
技术研发日：2022.04.02
技术公布日：2022/7/29