用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法及免疫传感器

1.本发明属于纳米材料在环境监测应用技术领域，尤其涉及一种用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法及免疫传感器。


背景技术：

2.随着现代工农业的快速发展，环境雌激素如杀虫剂、塑料、多氯联苯、双酚等已被广泛地应用。这些化学物质进入江河湖海以及土壤，导致环境污染。通过水果、蔬菜、肉类及水，这些雌激素在人或动物体内聚集，最终威胁人或动物健康，例如干扰内分泌系统，导致异常睾丸发育，性别比例偏离及其他不利现象，因而雌激素检测引起广泛关注。世界经济合作与发展组织(oecd)与美国epa建立了以鱼类为受试生物，以卵黄原蛋白(vitellogenin,vtg)为主要指标的筛选测试导则，推荐水生脊椎或无脊椎动物的卵黄原蛋白作为雌激素干扰的生物标志物之一。具有高灵敏度、高特异性、宽探测范围、低探测极限且测试速度快的传感检测方法对环境雌激素的检测具有重要意义。
3.卵黄原蛋白的准确测定是正确评价化合物雌激素活性的重要前提。由于抗原与抗体之间的免疫反应具有高特异性，因而免疫传感器具有固有的特异性。对于基于单克隆抗体的免疫传感器，一定的抗体能在许多物质中识别特定的抗原，因而基于单克隆抗体的免疫传感技术成为复杂环境监测的发展方向。
4.传统的免疫技术包括酶联免疫、辐射免疫法、western blots等，近年来又发展了电化学免疫传感器、光学传感方法、免疫胶体金技术等。然而鱼类卵黄原蛋白容易发生降解，会对定量结果造成误差，不适合用作定量检测实验的标准品。与卵黄原蛋白相比，卵黄原蛋白的主要降解产物—卵黄脂磷蛋白(lipovitellin，lv)在高温处理、-80℃长期保存以及反复冻融等条件下均未发生降解，表现出很好的稳定性；免疫学实验表明，lv与vtg具有相同的免疫原性，lv与vtg对抗-lv抗体具有相同的结合率(关于褐牙鲆vtg及lv与抗-lv抗体具有相同结合率的文献：zhenzhong zhang,jun wang,ming gao,xuefu li,yuqi cheng,xiaona zhang,hua tian,wei wang,shaoguo ru.new methods for purification of paralichthys olivaceus lipovitellin and immunoassay-based detection of vitellogenin,ecotoxicology and environmental safety 180(2019)624
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631.)，因此lv比vtg更适合作为标准品，以此建立的免疫传感器可以用于检测vtg。相对于多克隆抗体，单克隆抗体效果更好。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的免疫技术显示高特异性和灵敏度，但存在一些缺点，如酶联免疫方法必须使用酶，而酶的制备及保存对环境条件要求较高；辐射免疫法需要使用具有放射性的元素，可能对环境或人造成伤害；免疫western blots方法需要使用二抗。这些方法总体耗时多，不适合短时间内大规模检测。近年来，电化学及光学传感器被用于卵黄原蛋白浓度检测。基于阻抗谱的电化学免疫传感器显示宽的测量范围(1000-8000ng/ml)，但灵敏度较低(420ng/ml)；基于电流的电化学免疫传感器呈现低的检测限(0.09ng/ml)但线性范围小(0.25-7.8ng/ml)；光波导光谱传感器显示宽的测量
范围(100-10000ng/ml)和低的检测限(0.1ng/ml)，但对低于100ng/ml的vtg无法检测；表面增强拉曼散射技术检测限很低(5pg/ml)，但线性范围很窄(～0.2ng/ml)。免疫胶体金技术需要使用纳金，而金是一种贵金属，造价高。


技术实现要素：

6.为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法及免疫传感器。
7.所述技术方案如下：一种用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法包括：
8.将氨基化的石墨烯量子点与单克隆抗体进行偶联，得到纯化的抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物作为荧光纳米探针；将氧化石墨烯还原获得水溶性石墨烯；利用荧光纳米探针发射的能量无辐射地转移到石墨烯片上进行荧光猝灭，荧光猝灭程度达到饱和时对应的石墨烯片浓度为石墨烯的最佳用量；向基于石墨烯最佳用量获得的多份抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液中加入不同浓度的抗原，孵育，抗原与抗体特异性反应使猝灭的荧光得以恢复，恢复荧光强度与抗原加入量成正相关，测量混合物荧光光谱，获得抗原对数浓度-荧光强度标准曲线。
9.在一个实施例中，所述用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法具体包括以下步骤：
10.步骤一，石墨烯量子点的氨基化；
11.步骤二，氨基化石墨烯量子点与单克隆抗体偶联；
12.步骤三，还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯；
13.步骤四，石墨烯的最佳用量确定；
14.步骤五，荧光恢复线性曲线的建立；
15.步骤六，重复性和抗干扰性测量；
16.步骤七，卵黄原蛋白浓度检测。
17.在一个实施例中，在步骤一中石墨烯量子点的氨基化具体包括：将石墨烯量子点(gqds)水溶液与氨水溶液混合，室温搅拌均匀混合；将溶液转移到聚四氟乙烯容器中加热，蒸发多余的氨，然后在纯净水中透析纯化，透析后的氨基化石墨烯量子点冷冻干燥，得到粉末样品。
18.在一个实施例中，在步骤二中氨基化石墨烯量子点与单克隆抗体偶联具体包括：分别取1-乙基-(3-二甲基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入到4-吗啉乙磺酸溶液中，混合搅拌，形成edc-nhs溶液待用；取抗体，加入edc-nhs试剂，搅拌活化抗体；将活化的抗体与氨基化石墨烯量子点(afgqds)溶液混合，孵育，形成抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物；离心，去除游离的未偶联抗体，在离心过程中，用pbs缓冲液洗涤偶联物；得到纯化的抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物作为荧光纳米探针。
19.在一个实施例中，在步骤三中还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯的具体步骤包括：配置1mg/10ml的氧化石墨烯水溶液，超声分散20分钟。在搅拌状态下加入质量分数为25％的氨水，调节ph值为9，再加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，使pvp与溶液的质量分数为1％，搅拌使pvp均匀分散在溶液中，滴加0.02mol/l抗坏血酸溶液，在磁力搅拌下水浴加热到80℃，还原80min。在此过程中溶液的颜色由棕褐色逐步加深，最终变为深黑色，表明氧化石墨
烯被还原成石墨烯。将所制得的溶液离心，水洗两次去除残留pvp，最后用乙醇离心清洗，将还原氧化石墨烯置于40℃恒温箱中干燥，得固体石墨烯粉末，该粉末样品能均匀分散到水中。
20.在一个实施例中，在步骤四中石墨烯的最佳用量具体包括：取同体积抗体-氨基化石墨烯量子点溶液多份，分别加入不同浓度石墨烯溶液，搅拌分散，再加入pbs水溶液，室温下孵育；然后测量以上溶液的荧光光谱，观测荧光猝灭；荧光猝灭程度达到饱和时对应的石墨烯浓度为石墨烯的最佳用量。
21.在一个实施例中，石墨烯最佳用量为4μg/ml。
22.在一个实施例中，在步骤五中荧光恢复线性曲线的建立具体包括：向多份抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液中加不同浓度的抗原，再加入pbs缓冲液，抗原的浓度在0-1500.0ng/ml；室温下孵育，测量混合物荧光光谱，重复三次；绘制抗原对数浓度-荧光强度标准曲线；从标准曲线读取线性范围、测量误差以及最低检测限。
23.在一个实施例中，抗原对数浓度-荧光强度标准曲线数学表达式为i＝26407.85log c lv 85145.31，回归系数(r2)为0.9994。
24.在一个实施例中，在步骤六中重复性和抗干扰性测量具体包括：以鸡蛋白和牛血清蛋白作为干扰物，重复荧光恢复实验；
25.在步骤七中卵黄原蛋白浓度检测具体包括：取卵黄原蛋白溶液加入抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液，再加入pbs缓冲液，室温下孵育，测量荧光光谱，读取荧光峰强度，从已建立的标准曲线获取卵黄原蛋白浓度。
26.本发明的另一目的在于提供一种基于抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯检测目标抗原的免疫传感器，所述免疫传感器实施所述用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法。
27.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
28.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：成功解决了现有方法中利用卵黄原蛋白作为标准品存在的易降解导致的检测方法精确度较差以及检测结果可能出现假阳性的问题。成功解决了通过还原氧化石墨烯获得石墨烯过程中石墨烯片容易团聚且不易溶于水的问题。本方法测量精度高，测量速度快。
29.第二，把技术方案看作一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
30.本发明弥补现有技术的不足，利用石墨烯量子点(石墨烯量子点是尺寸小于10nm的石墨烯片状物，其边缘往往带有含氧基团，可以用多种方法获得或制备石墨烯量子点)的强荧光性质，将氨基化石墨烯量子点与单克隆抗体偶联后的偶联物作为荧光探针，当荧光探针(即氨基化石墨烯量子点-抗体的偶联物)与石墨烯片距离小于10nm，荧光探针(即氨基化石墨烯量子点-抗体的偶联物)的荧光会被石墨烯片吸收而发生猝灭(荧光共振能量转移)；当加入抗原时，由于抗原与抗体之间强烈的免疫反应，促使荧光探针(即氨基化石墨烯量子点-抗体偶联物)远离石墨烯片，使得猝灭的荧光得以恢复。由于荧光恢复强度与加入抗原的浓度成正相关，从而可以用于检测抗原的浓度。已有结果表明卵黄原蛋白的主要降
解产物，即卵黄脂磷蛋白，比卵黄原蛋白更加稳定，而且与卵黄原蛋白类似，与单克隆抗体(anti-lv-mab)的结合效率一样，因此可以用卵黄脂磷蛋白作为标准物，以此建立的抗原对数浓度-荧光强度标准曲线可以用于测量卵黄原蛋白浓度，且准确度会更高。在本发明中荧光探针是指氨基化石墨烯量子点与抗体的偶联物，偶联物也发荧光，可以作为荧光探针。
31.本发明创新点为：氨基化石墨烯量子点与单克隆抗体的偶联物也发荧光，可以作为荧光探针；使荧光猝灭的石墨烯的最佳用量；荧光恢复线性曲线的建立。通过上述创新技术方案，本发明线性探测范围宽(0.001-1500ng/ml)，探测极限低(lod,0.9pg/ml)，灵敏度高(26407.8cps/(ng/ml)，重复性好(五次测量相对均方偏差1.2％)，测量速度快(《12min)，抗干扰性强。
32.第三，本发明的权利要求的创造性还体现在：本发明的测量速度快，测量方法简单，可进行大通量检测(短时间内测量多个样品)。
附图说明
33.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
34.图1是本发明实施例提供的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法流程图；
35.图2是本发明实施例提供的抗-lv-单克隆抗体、石墨烯量子点、氨基化石墨烯量子点及氨基化石墨烯量子点/抗-lv-单克隆抗体偶联物(荧光探针)的紫外可见吸收光谱图；
36.图3是本发明实施例提供的石墨烯量子点、氨基化石墨烯量子点及氨基化石墨烯量子点/抗-lv-单克隆抗体偶联物荧光光谱图；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
37.图4是本发明实施例提供的氨基化石墨烯量子点/抗-lv-单克隆抗体偶联物荧光随激发波长而变化，其中360nm激发时荧光最强；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
38.图5a是本发明实施例提供的荧光探针的荧光逐渐被石墨烯片猝灭的荧光光谱图；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
39.图5b是本发明实施例提供的当石墨烯的浓度达到4μg/ml时，荧光探针的荧光强度被完全猝灭，4μg/ml石墨烯作为最佳用量示意图；
40.图6a是本发明实施例提供的荧光随卵黄脂磷蛋白浓度的增高而变强示意图；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
41.图6b是本发明实施例提供的荧光恢复强度(i)随卵黄脂磷蛋白(lv)对数浓度(log c)的关系曲线图；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
42.图7是本发明实施例提供的对于五份1ng/ml的抗原(lv)/抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液分别测量荧光光谱，观测测量的重复性测量结果图；图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数；
43.图8是本发明实施例提供的分别以150倍于卵黄脂磷蛋白(lv)浓度的鸡蛋白和牛血清蛋白(1.5μg/ml)作为干扰物，重复荧光恢复实验结果图，图中cps是counts per second的缩写，就是探测器每秒测得的光子数。
具体实施方式
44.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
45.一、解释说明实施例
46.如图1所示，本发明实施例提供的用于检测卵黄原蛋白浓度的荧光免疫方法包括：
47.s101，石墨烯量子点的氨基化；将50ml的1mg/ml gqds水溶液与50ml的25％的氨水溶液混合，室温搅拌均匀混合。将溶液转移到聚四氟乙烯容器中，在200℃条件下加热10小时，室温冷却。将该溶液进一步加热至95℃一小时，蒸发多余的氨，然后在纯净水中透析纯化24小时，透析袋截留分子量1000.透析后的氨基化石墨烯量子点冷冻干燥，得到粉末样品。
48.s102，石墨烯量子点与单克隆抗体偶联(荧光探针)；分别取8mg的1-乙基-(3-二甲基丙基)碳酰二亚胺(edc)和22mg的n-羟基琥珀酰亚胺加入到2ml的0.1mol/l的4-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，混合搅拌，形成edc-nhs溶液待用。为了活化抗体，取19.8ml浓度为4μg/ml的抗体，在其中加入0.2ml的edc-nhs试剂，并在27℃条件下，搅拌15min形成活性抗体。将活化的抗体与浓度为10μg/ml氨基化石墨烯量子点溶液按体积比1:1混合，在37℃条件下孵育30分钟，抗体与氨基化石墨烯量子点经由酰胺化反应形成抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物。在此基础上离心，去除游离的未偶联抗体，在离心过程中，用pbs缓冲液洗涤偶联物3次。最终得到纯化的抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物作为荧光纳米探针，用pbs缓冲液定容到20ml。
49.s103，还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯；在一个实施例中，在步骤三中还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯的具体步骤包括：配置1mg/10ml的氧化石墨烯水溶液，超声分散20分钟。在搅拌状态下加入质量分数为25％的氨水，调节ph值为9，再加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，使pvp与溶液的质量分数为1％，搅拌使pvp均匀分散在溶液中，滴加0.02mol/l抗坏血酸溶液，在磁力搅拌下水浴加热到80℃，还原80min。在此过程中溶液的颜色由棕褐色逐步加深，最终变为深黑色，表明氧化石墨烯被还原成石墨烯。将所制得的溶液离心，水洗两次去除残留pvp，最后用乙醇离心清洗，将还原氧化石墨烯置于40℃恒温箱中干燥，得固体石墨烯粉末，该粉末样品能均匀分散到水中。
50.s104，石墨烯片的最佳用量；取0.5ml以上抗体-氨基化石墨烯量子点溶液多份，分别向其中加入0.1ml不同浓度石墨烯溶液(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0μg/ml)，搅拌分散，再加入0.4ml pbs水溶液，室温下孵育30分钟，以促进抗体-氨基化石墨烯量子点通过静电吸引作用、π-π堆积作用吸附在石墨烯片表面。然后测量以上溶液的荧光光谱，观察荧光猝灭现象。在激发光照射下，由于偶极-偶极相互作用，荧光探针发射的能量(光子)无辐射地转移到石墨烯片上，导致荧光猝灭现象。荧光猝灭程度达到饱和时对应的石墨烯片浓度为石墨烯的最佳用量。抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯片复合物可以作为检测目标的免疫传感器。
51.s105，荧光恢复线性曲线的建立；向多份0.6ml抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液中分别加入0.2ml不同浓度的抗原，再加入0.2ml的pbs缓冲液，使总体积为1ml，抗原
的浓度在0-1500.0ng/ml之间。室温下经过12分钟孵育，测量混合物荧光光谱，观测荧光恢复，荧光测量条件同s104。以上实验重复三次。绘制抗体对数浓度-荧光强度标准曲线。从标准曲线读取线性范围，测量误差以及最低检测限。
52.s106，重复性和抗干扰性测量；以1.5μg/ml鸡蛋白和牛血清蛋白作为干扰物，重复以上荧光恢复实验，证明荧光免疫传感器的抗干扰性，实验重复三次。
53.对于五份1ng/ml的抗原/抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液分别测量荧光光谱，观测测量的重复性。
54.s107，卵黄原蛋白浓度检测；因为卵黄脂磷蛋白为卵黄原蛋白的主要成分之一，且比卵黄原蛋白稳定，因而比卵黄原蛋白更适合作为标准物；又因为卵黄脂磷蛋白与卵黄原蛋白具有相同的免疫原性，两者与抗-lv-单克隆抗体具有相同的结合率，因此以卵黄脂磷蛋白作为标准物质建立的标准曲线也适用于卵黄原蛋白的检测。
55.取0.2ml未知浓度卵黄原蛋白溶液加入以上0.6ml抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液，再加入0.2ml pbs缓冲液，室温下孵育12分钟，测量荧光光谱，读取荧光峰强度。上述实验重复三次，取三次测量荧光峰强度平均值，从已建立的标准曲线读取卵黄原蛋白浓度即可。
56.二、应用实施例
57.对于含1ng/ml卵黄原蛋白的自来水，三次实测荧光恢复率分别为95.53％，99.18％and 101.23％，即实测浓度为0.9553ng/ml，0.9918ng/ml，1.0123ng/ml，相对测量误差在4.5％以内。
58.三、下面结合实施例相关效果的证据对本发明的效果作进一步描述。
59.实验
60.通常，vtg只存在于卵黄生成期的雌鱼体内，但是雄鱼和幼鱼因含有vtg基因，在环境雌激素的诱导下也能合成vtg。因此，通过检测雄鱼或幼鱼体内的vtg含量可以评价化学物质的雌激素效应。
61.实验中鱼种为褐牙鲆，vtg及lv的制备分离、抗-lv-单克隆抗体的制备为公开的技术(关于褐牙鲆vtg，lv的分离纯化，抗-lv-单克隆抗体的制备技术见：zhenzhong zhang，jun wang,zongbao pan,yabin zhang,xiaona zhang,hua tian,wei wang,shaoguo ru.distribution of vitellogenin in japanese flounder(paralichthys olivaceus)for biomarker analysis of marine environmental estrogens，aquatic toxicology 216(2019)105321.)。
62.关于褐牙鲆vtg及lv与抗-lv抗体具有相同结合率的文献：zhenzhong zhang,jun wang,ming gao,xuefu li,yuqi cheng,xiaona zhang,hua tian,wei wang,shaoguo ru.new methods for purification of paralichthys olivaceus lipovitellin andimmunoassay-based detection of vitellogenin,ecotoxicology and environmental safety 180(2019)624
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631。
63.1、石墨烯量子点的氨基化：
64.将50ml的1mg/ml石墨烯量子点水溶液与50ml的25％的氨水溶液混合，室温搅拌均匀混合。将溶液转移到聚四氟乙烯容器中，在200℃条件下加热10小时，室温冷却。将该溶液进一步加热至95℃一小时，蒸发多余的氨，然后在纯净水中透析纯化24小时，透析袋截留分
子量1000，透析后的氨基化石墨烯量子点冷冻干燥，得到粉末样品。
65.2、石墨烯量子点与单克隆抗体偶联(荧光探针)：
66.分别取8mg的1-乙基-(3-二甲基丙基)碳酰二亚胺(edc)和22mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入到2ml的0.1mol/l的4-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，混合搅拌，形成edc-nhs溶液待用。为了活化抗体，取19.8ml浓度为4μg/ml的褐牙鲆抗-lv-单克隆抗体在其中加入0.2ml的edc-nhs试剂，并在27℃条件下，搅拌15min形成活性抗体。将活化的抗体与浓度为10μg/ml氨基化石墨烯量子点溶液按体积比1:1混合，在37℃条件下孵育30分钟，抗体与氨基化石墨烯量子点经由酰胺化反应形成抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物。在此基础上，离心，去除游离的未偶联抗体，在离心过程中，用pbs缓冲液洗涤偶联物3次。最终得到纯化的抗体-氨基化石墨烯量子点偶联物作为荧光纳米探针，用pbs缓冲液定容到20ml。
67.石墨烯量子点与单克隆抗体的成功偶联(荧光探针)通过紫外可见吸收光谱(图2)和荧光光谱的变化来判断(图3)，荧光探针的荧光强度随激发波长的变而变化(图4)，最强荧光对应激发波长被选择作为后续实验激发波长(360nm)。
68.3、还原石墨烯氧化物获得水溶性石墨烯：在一个实施例中，在步骤三中还原氧化石墨烯获得水溶性石墨烯的具体步骤包括：配置1mg/10ml的氧化石墨烯水溶液，超声分散20分钟。在搅拌状态下加入质量分数为25％的氨水，调节ph值为9，再加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，使pvp与溶液的质量分数为1％，搅拌使pvp均匀分散在溶液中，滴加0.02mol/l抗坏血酸溶液，在磁力搅拌下水浴加热到80℃，还原80min。在此过程中溶液的颜色由棕褐色逐步加深，最终变为深黑色，表明氧化石墨烯被还原成石墨烯。将所制得的溶液离心，水洗两次去除残留pvp，最后用乙醇离心清洗，将还原氧化石墨烯置于40℃恒温箱中干燥，得固体石墨烯粉末，该粉末样品能均匀分散到水中。
69.4、石墨烯片的最佳用量：
70.取0.5ml以上抗体-氨基化石墨烯量子点溶液多份，分别向其中加入0.1ml不同浓度石墨烯溶液(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0μg/ml)，搅拌分散，再加入0.4ml pbs水溶液，室温下孵育30分钟，以促进抗体-氨基化石墨烯量子点通过静电吸引作用、π-π堆积作用吸附在石墨烯片表面。然后测量以上溶液的荧光光谱，观察荧光猝灭现象。在激发光照射下，由于偶极-偶极相互作用，荧光探针发射的能量(光子)无辐射地转移到石墨烯片上，导致荧光猝灭现象。荧光猝灭程度达到饱和时对应的石墨烯片浓度为石墨烯的最佳用量。抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯片复合物可以作为检测目标的免疫传感器。图5a是本发明实施例提供的荧光探针的荧光逐渐被石墨烯片猝灭的荧光光谱图；图5b是本发明实施例提供的当石墨烯片的浓度达到4μg/ml时，荧光探针的荧光强度被完全猝灭，4μg/ml石墨烯片作为最佳用量示意图。
71.4、荧光恢复线性曲线的建立：
72.向多份0.6ml抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液中加入0.2ml不同浓度的褐牙鲆卵黄脂磷蛋白，再加入0.2ml的pbs缓冲液，使总体积为1ml，卵黄脂磷蛋白的浓度在0-1500.0ng/ml之间。室温下经过12分钟孵育，测量混合物荧光光谱，观测荧光恢复，荧光测量条件同上。以上实验重复三次。绘制抗原对数浓度-荧光强度标准曲线。从标准曲线读取线性范围、测量误差以及最低检测限。
73.如图6a，荧光随卵黄脂磷蛋白浓度的增高而变强，荧光恢复强度(i)随卵黄脂磷蛋
白(lv)对数浓度(log c)的关系曲线见图6b，数学表达式写为i＝26407.85log c lv 85145.31，回归系数(r2)为0.9994.由信噪比为4(s/n＝4)确定的最低探测极限为0.9pg/ml，线性检测范围为1.0pg/ml
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1500ng/ml，灵敏度26407.8cps/(ng/ml)。
74.5、重复性和抗干扰性测量及检测精度：
75.对于五份1ng/ml的抗原/抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液分别测量荧光光谱，观测测量的重复性。测量结果见图7，相对误差1.2％，显示传感器具有很好的重复性。
76.分别以150倍于lv浓度的鸡蛋白和牛血清蛋白(1.5μg/ml)作为干扰物，重复荧光恢复实验，结果见图8.10ng/ml lv的荧光恢复率为62.13％，1.5μg/ml鸡蛋白和牛血清蛋白荧光恢复率为23.70％and 20.51％，证明荧光免疫传感器具有很好抗干扰性。
77.图8是本发明实施例提供的分别以150倍于卵黄脂磷蛋白(lv)浓度的鸡蛋白和牛血清蛋白(1.5μg/ml)作为干扰物，重复荧光恢复实验结果图。其中曲线1：氨基化石墨烯量子点/抗-lv-单克隆抗体偶联物的荧光光谱；2：10ng/ml卵黄脂磷蛋白荧光恢复光谱；3：1.5μg/ml牛血清蛋白荧光恢复光谱；4：1.5μg/ml鸡蛋白荧光恢复光谱；5：氨基化石墨烯量子点/抗-lv-单克隆抗体/石墨烯荧光光谱。
78.6、卵黄原蛋白浓度检测：
79.取0.2ml未知浓度褐牙鲆卵黄原蛋白溶液加入以上0.6ml抗体-氨基化石墨烯量子点/石墨烯水溶液，再加入0.2ml pbs缓冲液，室温下孵育12分钟，测量荧光光谱，读取荧光峰强度，以上实验重复测量三次，取三次荧光峰强度平均值，从已建立的标准曲线读取卵黄原蛋白对数浓度logc，并进一步计算卵黄原蛋白浓度c即可。
80.以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。