脂质分子在作为胃癌化疗药耐药的预测性标志物中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种胃癌铂类化疗药耐药的预测性标志物，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.胃癌在我国恶性肿瘤中发病率和病死率均居第2位，我国胃癌5年生存率仅为35.9％。目前化疗是治疗胃癌的主要方式之一，铂类药物尤其是顺铂以及奥沙利铂是胃癌最重要的化疗药物。然而，铂类耐药性的发生限制了药物的临床疗效，甚至导致治疗的失败。临床关于胃癌铂类耐药金标准尚不明确，大多依靠结合临床经验进行判断。因此，开发指示铂类耐药的标记物并寻找逆转铂类耐药性的方法对于胃癌患者的治疗至关重要。
3.近年来研究表明，脂质在细胞的生长及功能中起到了重要的作用。脂质代谢改变是癌细胞的重要代谢表型。阻断癌细胞中的脂质供应会对癌细胞生物能量学、膜生物合成和细胞内信号传导过程产生重大影响。此外，脂质可用性的改变也会影响癌细胞迁移、血管生成的诱导、代谢共生、逃避免疫监视和癌症的耐药性。脂质在胃癌耐药的作用却尚未有相关报道。是否有可能从脂质中寻找到准确提示胃癌耐药的指标及治疗靶点，有重要的临床意义。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明通过脂质组学检测胃癌患者的组织后发现，脂质分子1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，即pe(18:0/18:2)在胃癌铂类(顺铂及奥沙利铂)耐药患者中显著增高，且升高程度与其耐药程度呈正相关。
5.技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
6.脂质分子在作为胃癌化疗药耐药的预测性标志物中的应用。
7.脂质分子在作为胃癌铂类化疗药耐药的预测性标志物中的应用。
8.脂质分子在作为制备胃癌铂类化疗药耐药的试剂盒中的应用。
9.作为优选方案，以上所述的脂质分子包括含有磷酸的脂类。甘油磷脂也是磷脂的主要组成成分，包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)。组学结果提示，脂质大多集中在上述脂质亚类中。
10.有益效果：
11.本发明通过大量实验筛选，通过临床胃癌患者铂类耐药脂质与细胞铂类耐药相关脂质差异分析获得可能的铂类耐药脂质标记物。具体如下：人胃癌细胞(ags)与人胃癌细胞顺铂耐药(ags/ddp)的差异脂质及人胃癌细胞(ags)与人胃癌细胞奥沙利铂耐药(ags/oxa)的差异脂质取交集，共获得147个差异脂质分子，为胃癌铂类耐药细胞差异脂质。同样，将临床胃癌铂类化疗患者根据疗效分为敏感组(a)、不敏感组(b)与耐药组(c)组，将各组差异脂质取交集，获得85个差异脂质。将147个细胞耐药差异脂质与85个临床耐药脂质取交集，共有30个共表达脂质，其中pe(18:0/18:2)具有统计学差异。因此，pe(18:0/18:2)可作为预测胃癌铂类耐药的潜力标志物。
附图说明
12.图1是耐药细胞的构建图，a为ddp干预ags存活率，b为ddp干预ags/ddp存活率，c为oxa干预ags存活率，d为oxa干预ags/ddp存活率。
13.图2是胃癌细胞脂质分类图。
14.图3是临床胃癌组织脂质分类图。
15.图4是ags与ags/ddp差异脂质分析图。
16.图5是ags与ags/oxa差异脂质分析图。
17.图6是临床铂类化疗敏感组(a)、铂类化疗不敏感组(b)差异脂质分析图。
18.图7是临床化铂类疗敏感组(a)、铂类化疗耐药组(c)差异脂质分析图。
19.图8是铂类化疗不敏感组(b)、铂类化疗耐药组(c)差异分析图。
20.图9是pe(18:0/18:2)在各组胃癌细胞及临床胃癌组织中的含量图，a为各组胃癌细胞pe峰值，b为各组临床胃癌pe峰值。
21.图10是pe(18:0/18:2)促进胃癌细胞铂类耐药的实验验证图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
23.1.临床样本收集及耐药细胞株构建
24.1.1临床胃癌患者分组
25.纳入铂类新辅助化疗(新辅助化疗方案均为以顺铂/奥沙利铂为主)的胃癌患者33例。所有胃癌患者在上述新辅助化疗完成后均行手术治疗。根据术后病理检查结果，采用2019版肿瘤术前辅助治疗评估分级(肿瘤退缩分级trg)，判断患者术前铂类化疗的敏感性，见表1。其中，0-1级为敏感组，2级为不敏感组，3级为耐药组，各组患者人数见表2。
26.表1肿瘤退缩分级(trg)方法
27.肿瘤退缩分级(trg)光镜下所见0(完全退缩)无肿瘤细胞残留(包括淋巴结)1(中等退缩)仅见单个或小灶癌细胞残留2(轻微退缩)肿瘤残留但少于纤维化间质3(无退缩)广泛肿瘤残留，无或少量肿瘤细胞坏死
28.注:a.评分仅限于原发肿瘤病灶；b.肿瘤细胞指存活的瘤细胞，不包括退变坏死细胞；c.放/化疗后可能出现的无细胞黏液湖，不能将其认为肿瘤残余。
29.表2胃癌患者术前辅助治疗疗效评估
30.铂类新辅助化疗分组患者例数敏感组(0-1级)4不敏感组(2级)17耐药组(3级)12
31.3组胃癌患者性别、年龄、病程、tnm分期等均无统计学差异(p》0.05)，见表3。
32.表3 3组胃癌患者一般临床资料比较
[0033][0034]
1.2ags耐药细胞构建
[0035]
人胃癌细胞ags用含10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养。用逐步递增顺铂(ddp)浓度诱导顺铂耐药胃癌细胞。取对数生长期细胞ags，用顺铂初始浓度为0.1μg
·
ml-1培养，取存活细胞用增加浓度的顺铂培养，同时每一浓度连续传代3次以稳定耐药特征，直至ags细胞在顺铂浓度为1μg
·
ml-1的培养基中可稳定传代培养，将该细胞命名为人胃癌细胞顺铂耐药细胞株(ags/ddp)。与非耐药ags细胞相比，ags/ddp在1μg
·
ml-1
的顺铂培养液培养液中的存活率明显升高(见图1)，表明耐药细胞模型构建成功。人胃癌细胞奥沙利铂耐药细胞株(ags/oxa)构建方法同上。
[0036]
2.脂质组学检测
[0037]
2.1样本处理
[0038]
2.1.1样品信息质控样本(qc)的制备
[0039]
等量取各组样本混合为qc。qc样本不仅用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，也用于评价整个实验过程中系统稳定性。细胞样本与临床样本分开进行实验。详情见表3。
[0040]
表3样品信息表
[0041]
样品分组样品名称数量样品状态agsags(1-8)8固体ags/ddpags/ddp(1-8)8固体ags/oxaags/oxa(1-8)8固体化疗敏感组a(1-4)4固体化疗不敏感组b(1-17)17固体化疗耐药组c(1-12)12固体
[0042]
2.1.2样本预处理方法
[0043]
样本加入200μl4℃的水，涡旋混匀，加入240μl预冷甲醇，涡旋混合，加入800μl甲基叔丁基醚(mtbe)，涡旋混合，低温水浴中超声20min，室温放置30min，14000g 10℃离心15min，取上层有机相,氮气吹干，-80℃保存样本。
[0044]
2.2色谱-质谱分析
[0045]
2.2.1uhplc色谱条件
[0046]
样品采用uhplc nexera lc-30a超高效液相色谱系统进行分离。柱温45℃，流速300μl/min。流动相组成a：10mm甲酸铵乙腈水溶液(乙腈:水＝6:4,v/v)，b:10mm甲酸铵乙腈异丙醇溶液(乙腈:异丙醇＝1:9,v/v)。梯度洗脱程序如下：0～2min，b维持在30％，2～25min，b从30％线性变化至100％，25～35minb维持在30％。整个分析过程中样品置于10℃
自动进样器中，为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序，进行样本的连续分析。
[0047]
2.2.2质谱条件
[0048]
分别采用电喷雾电离(esi)正离子和负离子模式进行检测。样品经uhplc分离后采用q exactive plus。质谱仪(thermo scientific)进行质谱分析。
[0049]
正极:离子源温度(heater temp)300℃,鞘气流速(sheath gas flow rate)45arb,辅助气流速(aux gas flow rate)15arb，吹扫气流速(sweep gas flow rate)1arb，喷雾电压(spray voltage)3.0kv，离子传输管温度(capillary temp)350℃，s-lens电压(s-lens rf level)50％.ms1扫描范围(ms1 scan ranges)：200-1800。
[0050]
负极：离子源温度(heater temp)300℃，鞘气流速(sheath gas flow rate)45arb，辅助气流速(aux gas flow rate)15arb，吹扫气流速(sweep gas flow rate)1arb，喷雾电压(spray voltage)2.5kv，离子传输管温度(capillary temp)350℃，s-lens电压(s-lens rf level)60％.ms1扫描范围(ms1 scan ranges):250-1800。
[0051]
脂质分子和脂质碎片的质量电荷比，按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(ms2 scan,hcd)。ms1在m/z 200时分辨率为70000,ms2在m/z 200时分辨率为17500。
[0052]
2.3数据处理
[0053]
采用lipidsearch进行峰识别、峰提取、脂质鉴定(二级鉴定)等处理。对lipidsearch提取得到的数据进行数据分析，包括单变量统计分析、多元变量统计分析、层次聚类分析和相关性分析等。
[0054]
3.脂质组学检测结果
[0055]
3.1脂质亚类(lipid class)数量统计
[0056]
正、负离子模式鉴定到的脂质亚类以及各类中鉴定到的脂质分子数量的统计结果如下图2、图3所示。磷脂是含有磷酸的脂类，是组成生物膜的主要成分。其中甘油磷脂也是磷脂的主要组成成分，包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)。组学结果提示，实验发现的脂质大多集中在上述脂质亚类中。
[0057]
3.2脂质细胞铂类耐药与临床病人铂类耐药相关脂质差异分析
[0058]
在进行两组样本间的差异脂质分析时，我们利用单变量分析显示两样本间脂质变化的显著性，筛选潜在的标志脂质分子(以|logfc|》0.67,pvalue《0.05作为筛选标准)。如图4、5、6、7、8火山图分别显示了ags/ddp vsags、ags/oxavsags、化疗敏感组(a)vs化疗不敏感组(b)、化疗敏感组(a)vs化疗耐药组(c)、化疗不敏感组(b)vs化疗耐药组(c)数据的火山图，图中浅色点为|logfc|》0.67，p value《0.05的脂质分子，即单变量统计分析筛选的差异脂质分子。
[0059]
4.pe(18:0/18:2)的选择
[0060]
ags与ags/oxa的差异脂质及ags与ags/ddp的差异脂质取交集，共获得147个差异脂质分子，为胃癌铂类耐药细胞的差异脂质。同样，将临床铂类化疗敏感组(a)、铂类化疗不敏感(b)型与铂类化疗耐药组(c)组各组差异脂质取交集，获得85个差异脂质。将147个细胞耐药差异脂质与临床85个临床耐药脂质取交集，共有30个共表达脂质，如图9所示，其中pe
(18:0/18:2)具有统计学差异(p《0.05)，可见pe(18:0/18:2)具有预测胃癌铂类耐药的潜力。
[0061]
5.pe(18:0/18:2)促进铂类耐药实验验证
[0062]
将ags细胞铺于96孔板，细胞长满70％后，分别设置0、50、100、200μm的pe(18:0/18:2)给药浓度梯度同时在培养基中加入50μm的ddp、oxa，mtt法观测ddp组1、3、5d的细胞存活率以及oxa组1、2d的存活率。如图10所示，pe(18:0/18:2)能显著增加胃癌细胞对铂类的耐药性，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0063]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。