一种检测血液中齐拉西酮的液相色谱分析方法与流程

1.本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种检测血液中齐拉西酮的液相色谱分析方法。


背景技术：

2.齐拉西酮是一种非典型抗精神病药，属苯并噻唑哌嗪类化合物。其化学结构式如下所示：
[0003][0004]
体外研究表明，齐拉西酮对多巴胺d2、5ht2a、5ht1d受体具有拮抗作用，对5ht1a受体具有激动作用。对多巴胺d2、d3、5-羟色胺5ht2a、5ht2c、5ht1a、5ht1d、α1-肾上腺素等受体具有较高的亲和力，对组胺h1受体具有中等亲和力，对包括m胆碱等受体在内的其他受试受体/结合位点未见亲和力。齐拉西酮能抑制突触对5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取。齐拉西酮主要用于治疗精神分裂症，对急性或慢性、初发或复发精神分裂症均有很好疗效，对精神分裂症相关症状(包括视听幻觉、妄想、动机缺乏和逃避社会)有效。齐拉西酮的有效治疗窗为50～200ng/ml，实验室警戒值为400ng/ml，因此，在临床应用中有必要对齐拉西酮进行治疗药物监测，尽量减少药物不良反应，避免医疗事故的发生。
[0005]
目前测定血液中齐拉西酮含量通常采用的方法为高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。其中，高效液相色谱质谱联用法分析成本高，对场地要求较高，且需要专业人员进行操作，不适合在中小医院广泛开展。高效液相色谱法具有定量准确，重现性好，成本低等优点，但已被报道的文献方法大多存在着前处理操作较复杂，样品量需求较大，分析时间较长等问题，尚不适于大通量的样本检测。


技术实现要素：

[0006]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测血液中齐拉西酮的液相色谱分析方法。至少包括以下步骤：
[0007]
s1、标定标准溶液，获得标准曲线方程；优选采用外标法；
[0008]
s2、将血清或血浆加入乙腈混匀，离心，上清为待测样品，所述血清或血浆与乙腈
的体积比为1：1～10，优选为1：3；
[0009]
s3、对所述待测样品进行检测，包括：
[0010]
s31、将所述待测样品加入在线固相萃取装置对所述待测样品进行萃取，得到萃取物；
[0011]
s32、将所述萃取物加入到高效液相色谱分析仪中进行分析，通过所述标准曲线方程计算得到待检测样品中齐拉西酮的浓度。
[0012]
可选的，s1包括：
[0013]
s11、将齐拉西酮标准品配制至少3种浓度标准工作液：优选的，配制7种浓度标准工作液，标准工作液的浓度分别为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml、3200ng/ml、6400ng/ml；
[0014]
s12、分别取各浓度的标准工作液，加入空白血清，混匀获得各浓度的标准溶液；
[0015]
s13、所述标准溶液中加入乙腈，混匀后离心，取上清；
[0016]
s14、进行在线固相萃取后利用液相色谱分析仪对所述上清进行检测，得到所述各浓度的标准溶液的色谱图；
[0017]
s15、分别以所述各浓度的标准溶液的峰面积作为标准曲线方程的纵坐标y1，以所述标准溶液的浓度为作为标准曲线方程的横坐标x1，进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1 b，并且得出线性方程系数a、b。
[0018]
可选的，所述标准工作液与所述空白血清的体积比为1：9～19，优选为1：9；进一步优选的，所述标准溶液与乙腈的体积比为1：1～10，更优选为1：3。
[0019]
可选的，s11包括：
[0020]
s111、采用无水甲醇将齐拉西酮标准品配制得到标准储备液a；
[0021]
s112、将所述标准储备液a用甲醇水溶液进行稀释，获得最高浓度的标准工作液，然后采用所述甲醇水溶液继续稀释，获得其他各浓度的标准工作液；
[0022]
优选的，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比浓度为40～100％，更优选50％。
[0023]
可选的，在s2中，所述血清或血浆的体积为50～200μl，优选100μl；优选的，所述血清或血浆加入乙腈后在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀2～6min，12000～14000rpm离心3～10min。
[0024]
可选的，s14、s31包括：
[0025]
所述在线固相萃取装置的spe萃取柱选自：反相spe柱，优选c18 mg-34.0mm
×
20mm；
[0026]
流动相：a：水、b：乙腈；
[0027]
进样量：10～100μl，优选为50μl；
[0028]
流速：0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min。
[0029]
可选的，洗脱为梯度洗脱，
[0030]
0～2分钟，a：60～100％，b：0～40％；
[0031]
2～6分钟，a：0～20％，b：80～100％；
[0032]
6～9.5分钟，a：60～100％，b：0～40％；
[0033]
优选为：
[0034]
0～2分钟，a：90％，b：10％；
[0035]
2～6分钟，a：10％，b：90％；
[0036]
6～9.5分钟，a：90％，b：10％；
[0037]
优选的，收集2～3min内的洗脱产物用于高效液相色谱检测。
[0038]
可选的，s14、s32包括：
[0039]
分析色谱柱为反相色谱柱thermo acclaim
tm 120c18，4.6
×
250mm，5μm；
[0040]
流动相：体积比为55～65：45～55的水和乙腈；水中含有0.1～0.3v/v％的甲酸和10～60mmol/l的乙酸铵；优选为：水和乙腈的体积比为60：40；水中含有0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵。
[0041]
可选的，分析色谱柱的洗脱方式：等度洗脱；
[0042]
流速：0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min；
[0043]
柱温：35～45℃，优选为40℃；
[0044]
进样量：10～100μl，优选为50μl。
[0045]
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0046]
本发明提供的方法可简化前处理步骤，减少样品量，缩短分析时间，适合大通量的样本检测，提高检测效率。
[0047]
本发明提供的方法同时具有良好的灵敏度和准确性。
附图说明
[0048]
图1为本发明实施例中标准溶液中齐拉西酮色谱图；
[0049]
图2为本发明实施例中加标血清样本中齐拉西酮色谱图；
[0050]
图3为本发明实施例中血清与乙腈的体积比为1：1血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0051]
图4为本发明实施例中血清与乙腈的体积比为1：10血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0052]
图5为本发明对比例1中蛋白沉淀剂采用10mol/l naoh血清样品加标(20ng/ml)的色谱图；
[0053]
图6为本发明对比例1中蛋白沉淀剂采用采用6mol/l hcl血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0054]
图7为本发明对比例2中不使用在线固相萃取装置血清样品加标(640ng/ml)的色谱图；
[0055]
图8为本发明对比例4中流动相为体积比为60：40的纯水和乙腈血清样品加标(640ng/ml)色谱图；
[0056]
图9为本发明对比例4中流动相为体积比为60：40的水(50mmol/l的乙酸铵)和乙腈血清样品加标(640ng/ml)色谱图；
[0057]
图10为本发明对比例4中流动相为体积比为60：40的水(0.2v/v％甲酸)和乙腈血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0058]
图11为本发明对比例5中流动相为体积比为50：50的水(0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵)和乙腈空白血清样品色谱图；
[0059]
图12为本发明对比例5中流动相为体积比为50：50的水(0.2v/v％的甲酸和
50mmol/l的乙酸铵)和乙腈空白血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0060]
图13为本发明对比例5中流动相为体积比为70：30的水(0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵)和乙腈血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0061]
图14为本发明对比例6中采用色谱柱(thermo acclaim
tm 120c18，4.6
×
150mm，5μm)空白血清样品色谱图；
[0062]
图15为本发明对比例6中采用色谱柱(thermo acclaim
tm 120c18，4.6
×
150mm，5μm)血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0063]
图16为本发明对比例7中采用色谱柱柱温30℃空白血清样品色谱图；
[0064]
图17为本发明对比例7中采用色谱柱柱温30℃血清样品加标(20ng/ml)色谱图；
[0065]
图18为本发明对比例7中采用色谱柱柱温50℃空白血清样品色谱；
[0066]
图19为本发明对比例7中采用色谱柱柱温50℃血清样品加标(20ng/ml)色谱图。
具体实施方式
[0067]
为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0068]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0069]
本发明实施例提出一种血液中齐拉西酮含量的高效液相色谱检测方法，至少包括以下步骤：
[0070]
s1、标定标准溶液，获得标准曲线方程；
[0071]
s2、处理待测血液，获得待测样品，包括：
[0072]
将血清或血浆加入乙腈混匀，离心，上清为待测样品；
[0073]
s3、对待测样品进行检测，包括：
[0074]
s31、将待测样品加入在线固相萃取装置，对待测样品进行萃取，得到萃取物；
[0075]
s32、将萃取物加入到高效液相色谱分析仪中进行分析，通过标准曲线方程计算得到待检测样品中齐拉西酮的浓度。
[0076]
在本发明实施例中，血清或血浆加入乙腈沉淀蛋白，血清或血浆与乙腈的体积比为1：1～10，优选为1：3。如果乙腈添加比例过小，蛋白沉淀不完全，影响在线固相萃取小柱使用寿命；如果乙腈添加比例过大，稀释过多，浓度降低，影响信号。
[0077]
本发明实施例通过在线固相萃取装置与高效液相色谱分析仪连用，简化了前处理步骤，对样本仅通过乙腈沉淀蛋白后直接进样至在线固相萃取装置，后续无需操作即可完成检测，减少了人员操作，使检测过程简便快速，降低实验成本，提高检测效率。
[0078]
本发明实施例采用外标法制备标准曲线，相比内标法，外标法不需要寻找内标物质，内标物质一般选择其他药物，但待测样本供体也服用该药物的话，就会干扰检测结果，造成检测结果不准确。外标法制备标准曲线可采用本领域常用方法制备，在本发明实施例的一个具体实施方式中，标准曲线方程可通过以下方法获得：
[0079]
s11、将齐拉西酮标准品配制至少3种浓度标准工作液：优选的，配制7种浓度标准
工作液，标准工作液的浓度具体可为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml、3200ng/ml、6400ng/ml；
[0080]
s12、分别取各浓度的标准工作液，加入空白血清，混匀获得各浓度的标准溶液；
[0081]
s13、标准溶液中加入乙腈，混匀后离心，取上清；
[0082]
s14、在线固相萃取后利用液相色谱分析仪对上清进行检测，液相色谱分析仪的分析条件如下所述；得到各浓度的标准溶液的色谱图；
[0083]
s15、分别以各浓度的标准溶液的峰面积作为标准曲线方程的纵坐标y1，以标准溶液的浓度为作为标准曲线方程的横坐标x1，进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1 b，并且得出线性方程系数a、b。
[0084]
本发明实施例优选的实施方式中，标准工作液与空白血清的体积比为1：9～19，加入标准工作液的体积尽量少，尽量不改变基质，保证检测的准确性，本发明实施例进一步优选为1：9。
[0085]
本发明实施例优选的实施方式中，标准溶液与乙腈的体积比为1：1～10，优选为1：2～5，更优选为1：3。与样品前处理保持一致。
[0086]
本发明实施例某一具体实施方式中，配制至少3种浓度标准工作液包括：
[0087]
s111、采用无水甲醇将齐拉西酮标准品配制得到标准储备液a；
[0088]
s112、将标准储备液a用甲醇水溶液进行稀释，获得最高浓度的标准工作液，例如：6400ng/ml；然后采用甲醇水溶液继续稀释，获得其他各浓度的标准工作液，例如：200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml、3200ng/ml；
[0089]
本发明实施例优选的实施方式中，稀释标准储备液a的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比浓度为40～100％，更优选50％。该稀释液的好处增加溶解性、减少溶剂挥发。
[0090]
本发明实施例中，可采用常规条件获得血清或血浆，本发明实施例检测所需要的血清或血浆的样本量为50～200μl，优选100μl；
[0091]
本发明实施例优选的实施方式中，s22包括：加入乙腈后在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀2～6min，12000～14000rpm离心3～10min。选用该条件可以保证混匀离心效果。
[0092]
本发明实施例优选的实施方式中，s14、s31中的色谱条件具体为：
[0093]
在线固相萃取装置的萃取柱选自：反相spe柱，优选c18 mg-3 4.0mm
×
20mm；
[0094]
流动相：a：水，b：乙腈；
[0095]
进样量：10～100μl，优选为50μl；
[0096]
流速：0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min。
[0097]
洗脱为梯度洗脱，
[0098]
0～2分钟，a：60～100％，b：0～40％；
[0099]
2～6分钟，a：0～20％，b：80～100％；
[0100]
6～9.5分钟，a：60～100％，b：0～40％；
[0101]
优选为：
[0102]
0～2分钟，a：90％，b：10％；
[0103]
2～6分钟，a：10％，b：90％；
[0104]
6～9.5分钟，a：90％，b：10％；
[0105]
收集2～3分钟内的洗脱产物用于高效液相色谱检测。
[0106]
在0～2分钟，90％水相，洗脱能力较低，目标分析物齐拉西酮能够保留在spe柱上，血液样本中大分子蛋白等杂质洗脱到废液中；在3～6分钟，90％有机相，洗脱能力较强，对spe柱进行清洗，洗去残留在spe柱上的杂质，确保无杂质干扰下一针样品与spe柱的使用寿命；6～9.5分钟平衡spe柱，为下一针进样做准备。
[0107]
本发明实施例优选的实施方式中，s14、s31中的色谱条件具体为：
[0108]
分析色谱柱为反相色谱柱thermo acclaim
tm
120 c18，4.6
×
250mm，5μm；
[0109]
流动相：体积比为55～65：45～55的水和乙腈；水中含有0.1～0.3v/v％的甲酸和10～60mmol/l的乙酸铵；优选为：体积比为60：40的水和乙腈；水中含有0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵；
[0110]
洗脱方式：等度洗脱；
[0111]
流速：0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min；
[0112]
柱温：35～45℃，优选为40℃；
[0113]
进样量：10～100μl，优选为50μl。
[0114]
高效液相色谱分析仪的荧光检测器的激发波长316nm，发射波长415nm。荧光检测器可选用ultimate3000 rs fluorescence detector检测器，响应时间为2s，采集频率：5hz，分析时间为9.5min。
[0115]
具体仪器连接方式为：将在线固相萃取装置与高效液相色谱分析仪通过六通阀连接，高效液相色谱分析仪泵ii，用于给在线固相萃取装置提供动力；高效液相色谱分析仪泵i；用于给色谱分析柱提供动力。
[0116]
注入待测样品，泵ii将待测样品通过在线固相萃取装置的萃取柱，分析物齐拉西酮保留在萃取柱上；
[0117]
泵i将分析物齐拉西酮从萃取柱洗脱到高效液相色谱分析仪的分析柱，泵i对所述分析物齐拉西酮通过所述分析柱进行分离，荧光检测器检测；
[0118]
泵ii对所述萃取柱进行清洗、平衡。
[0119]
本发明实施例通过使用在线固相萃取装置后，血清经乙腈沉淀蛋白后直接进样，减少了人员操作，使检测过程简便快速，实验成本降低，缩短分析时间，更利于在临床治疗中对患者体内的齐拉西酮血药浓度进行监测。
[0120]
本发明实施例以下具体实施例所用的原料和设备均为市售产品。
[0121]
实施例1
[0122]
本实施例用于说明检测血液中齐拉西酮的液相色谱分析方法的具体检测步骤：
[0123]
1、标准溶液的标定
[0124]
1.1标准工作液的配制：
[0125]
精确称取齐拉西酮标准品2mg，置于2ml冻存管中，加入2ml的无水甲醇，得到标准储备液a；
[0126]
取适量标准储备液a，用50v/v％的甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中齐拉西酮浓度为6400ng/ml，然后继续用50v/v％的甲醇水溶液进行稀释，配制成浓度分别为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml、3200ng/ml、6400ng/ml的齐拉西酮溶液，并在-80℃条件下保存；
[0127]
1.2获得标准曲线：
[0128]
首先用移液器分别移取10μl标准工作液、90μl空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成七种不同浓度的标准溶液；
[0129]
将标准溶液分别在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min后，加入300μl乙腈，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀2～6min，12000～14000rpmn高速离心3～10min，吸取上清液350μl，利用液相色谱分析仪和荧光检测器对上述溶液进行检测。
[0130]
得到七种不同浓度的齐拉西酮的标准溶液色谱图，从上述齐拉西酮的标准溶液色谱图中分别得到齐拉西酮的峰面积，分别以上述七个不同浓度的齐拉西酮标准溶液的峰面积作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述齐拉西酮标准溶液中的浓度为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1 b，并且得出线性方程系数a、b；标准工作液为含有齐拉西酮的溶液。
[0131]
2、待测样品处理
[0132]
用移液枪移取100μl血清或血浆，加入300μl乙腈，在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀2～6min，12000～14000r/min离心3～10min，吸取上清液350μl作为待测样品；
[0133]
3、待测样品的检测
[0134]
使用液相色谱分析仪和荧光检测器对上述步骤1.2中处理后的标准溶液、步骤2待测的样品进行检测，得出上述待测样品的齐拉西酮的色谱图，从上述齐拉西酮色谱图中可以得到齐拉西酮峰面积，将齐拉西酮峰面积y1代入上述步骤1的标准曲线方程y1＝a*x1 b中，通过计算得到待检测样品中齐拉西酮的浓度x1。
[0135]
高效液相色谱仪包括在线固相萃取装置。
[0136]
在线固相萃取装置所使用的萃取柱：资生堂c18 mg-34.0mm
×
20mm，
[0137]
萃取柱流动相：a：水，b：乙腈；
[0138]
梯度洗脱如表1所示：
[0139]
表1
[0140]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)090102901041090610909.59010
[0141]
萃取柱流速为1ml/min。
[0142]
高效液相色谱仪：
[0143]
分析色谱柱：thermo acclaim
tm 120c18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0144]
分析柱流动相：含60：40(v/v)比例的水(50mmol/l乙酸铵、0.2v/v％甲酸)和乙腈等度洗脱；
[0145]
流速：1ml/min；
[0146]
柱温：40℃；
[0147]
进样量：50μl；
[0148]
荧光检测器是ultimate3000 rs fluorescence detector检测器：
[0149]
其激发波长316nm，发射波长415nm，响应时间为2s，采集频率：5hz，分析时间为
9.5min。
[0150]
得到的色谱图如图1和图2所示，其中，血清样本中齐拉西酮的色谱图见图2，标准溶液中齐拉西酮的色谱图见图1，齐拉西酮的保留时间为8.1min。
[0151]
具体仪器连接方式为：将在线固相萃取装置与高效液相色谱分析仪通过六通阀连接，高效液相色谱分析仪上泵ii用于给在线固相萃取装置提供动力；高效液相色谱分析仪上泵i用于给色谱分析柱提供动力。
[0152]
具体检测过程为：
[0153]
1、0～2分钟，样品通过自动进样器注入系统，泵ii携带样品通过spe柱，分析物齐拉西酮保留在spe柱上，部分杂质被洗脱流入废液。
[0154]
2、2～3分钟，色谱分析泵(泵i)将分析物齐拉西酮从spe柱洗脱到分析柱。
[0155]
3、3～9.5分钟，色谱分析泵(泵i)对分析物齐拉西酮与杂质进行色谱分离后进行检测；泵ii对spe柱进行清洗后平衡以便进行下一针样品分析。
[0156]
实施例2
[0157]
本实施例用于说明本发明实施例方法的线性关系和定量限：
[0158]
将上述配制的10μl的各个浓度的齐拉西酮标准工作液，分别加入90μl空白血清混匀1min后，加入300μl乙腈，在转速为2000rpm下涡旋混匀3min，14000r/min高速离心10min，吸取上清液350μl，进样分析，齐拉西酮浓度在20ng/ml到640ng/ml范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线；配制系列低浓度标准溶液，将上述配制的10μl的各个浓度的齐拉西酮标准溶液，分别加入空白血清或血浆90μl混匀，经前处理后进样分析，以3倍信噪比是检出限，10倍信噪比是定量限，结果表明线性范围和定量限如下：
[0159]
(1)检测限(lod)：齐拉西酮为3ng/ml。
[0160]
(2)定量限(loq)：齐拉西酮为9ng/ml。
[0161]
(3)线性范围：齐拉西酮在20ng/ml～640ng/ml范围内，线性良好，相关系数r2＞0.99。
[0162]
实施例3
[0163]
本实施例用于说明本发明实施例方法的回收率和精密度。
[0164]
分别取齐拉西酮标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，齐拉西酮回收率和精密度分别如表2所示。齐拉西酮在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.0％～101.3％，相对标准偏差为0.83％～1.96％，结果见表2。
[0165]
表2齐拉西酮加标回收率和精密度
[0166]
加标量40ng/ml80ng/ml320ng/ml平均回收率100.5％101.3％99.0％精密度rsd6.76％1.20％1.40％
[0167]
综合上述验证试验，本发明实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中齐拉西酮含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。血液样品经乙腈沉淀蛋白后直接进样，减少了人员操作，使检测过程简便快速，实验成本降低，缩短分析时间，更利于在临床治疗中对患者体内的齐拉西酮血药浓度进行监
测。
[0168]
实施例4：
[0169]
本实施例用于说明本发明实施例蛋白沉淀剂添加比例的技术效果。
[0170]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0171]
1、血清与乙腈的体积比为1∶1；获得实验结果如图3：
[0172]
2、血清与乙腈的体积比为1∶10；获得实验结果如图4。
[0173]
结果说明：采用血清与乙腈的体积比为1∶1～10，均能得到预期效果。
[0174]
对比例1：
[0175]
本实施例用于说明本发明实施例蛋白沉淀剂选用乙腈的技术效果。
[0176]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0177]
1、蛋白沉淀剂采用10mol/l naoh。获得实验结果如图5所示。
[0178]
结果显示：基线抬高，信号降低。
[0179]
2、蛋白沉淀剂采用6mol/l hcl。获得实验结果如图6所示。
[0180]
结果显示：基线抬高，基线不平，有杂质干扰。
[0181]
对比例2：
[0182]
本实施例用于说明本发明实施例在线固相萃取装置的技术效果。
[0183]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：不使用在线固相萃取装置对待测样本进行萃取富集；获得实验结果如图7所示。
[0184]
结果：峰展宽严重。
[0185]
对比例3：
[0186]
本实施例用于说明本发明实施例萃取柱流动相梯度洗脱方式的技术效果。
[0187]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0188]
3.1、使用表3所示的梯度洗脱方式：
[0189]
表3
[0190]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)0100021000410906109071000
[0191]
3.2、使用表4所示的梯度洗脱方式：
[0192]
表4
[0193]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)0802028080410906109078020
[0194]
3.3、使用表5所示的梯度洗脱方式：
[0195]
表5
[0196]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)0703027030410906109077030
[0197]
3.4、使用表6所示的梯度洗脱方式：
[0198]
表6
[0199]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)0604026040410906109076040
[0200]
3.5、使用表7所示的梯度洗脱方式：
[0201]
表7
[0202]
time(min)流动相a(％)流动相b(％)0505025050410906109075050
[0203]
获得实验结果如表8所示：
[0204]
表8
[0205] 萃取柱梯度洗脱初始比例血清标准溶液(640ng/ml)峰面积对比例3.1100/0260492.9083实施例190/10278306.1800对比例3.280/20288577.8767对比例3.370/30291881.8617对比例3.460/40273039.3817对比例3.550/5053824.8550
[0206]
结果显示：萃取柱采用50/50初始比例洗脱，血清标准溶液(640ng/ml)峰面积降低，表明初始比例为50/50时，目标分析物齐拉西酮在spe萃取柱上保留不住，不可采用50/50初始梯度。
[0207]
对比例4：
[0208]
本实施例用于说明本发明实施例分析色谱柱流动相的技术效果。
[0209]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0210]
1、流动相：体积比为60∶40的纯水和乙腈；获得实验结果如图8；
[0211]
结果显示：12min内未出峰。
[0212]
2、流动相：体积比为60∶40的水和乙腈；水中含有50mmol/l的乙酸铵；获得实验结果如图9；
[0213]
结果显示：12min内未出峰。
[0214]
3、流动相：体积比为60∶40的水和乙腈；水中含有0.2v/v％的甲酸；获得实验结果如图10；
[0215]
结果显示：基线不平。
[0216]
对比例5：
[0217]
本实施例用于说明本发明实施例分析色谱柱流动相比例的技术效果。
[0218]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0219]
1、流动相：体积比为50∶50的水和乙腈；水中含有0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵；获得实验结果如图11和图12所示。
[0220]
结果显示：目标物出峰位置有杂质干扰。
[0221]
2、流动相：体积比为70∶30的水和乙腈；水中含有0.2v/v％的甲酸和50mmol/l的乙酸铵；获得实验结果如图13所示。
[0222]
结果显示：15min未出峰。
[0223]
对比例6：
[0224]
本实施例用于说明本发明实施例采用分析色谱柱的技术效果。
[0225]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0226]
色谱柱：thermo acclaim
tm 120c18，4.6
×
150mm，5μm。获得实验结果如图14和图15所示。
[0227]
结果显示：目标物出峰位置有杂质干扰。
[0228]
对比例7：
[0229]
本实施例用于说明本发明实施例采用柱温的技术效果。
[0230]
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
[0231]
1、色谱柱柱温：30℃；获得实验结果如图16和图17所示。
[0232]
结果显示：目标物出峰位置有杂质干扰。
[0233]
2、色谱柱柱温：50℃；获得实验结果如图18和图19所示。
[0234]
结果显示：目标物出峰位置有杂质干扰。
[0235]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。