一种橄榄ISSR-PCR分子标记组合及其应用

一种橄榄issr-pcr分子标记组合及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种橄榄issr-pcr分子标记组合及其应用。


背景技术：

2.橄榄(canarium album)是橄榄科橄榄属乔木，又名黄榄、青果、橄榄子等。原产于中国南方，主要分布在我国福建、广东、四川、广西、重庆和浙江等南部省份和地区，尤以广东和福建栽培最多。橄榄是一种传统的药食同源的水果，其味甘酸，性平，有清热解毒、利咽化痰、除烦醒酒的作用。橄榄果实富含丰富的多酚类物质、黄酮类化合物，可加工制成果酒、果汁、茶叶等，还能用于抗病毒、抗氧化、保护肝脏、提高免疫和调节血脂血糖等方面。
3.相关技术中，橄榄新品种选育工作发展迅速，由于不同地区的橄榄品种存在相互引种、杂交等情况，导致了各个地区橄榄品种遗传背景复杂。现有的橄榄品种鉴定工作大多依靠形态特征鉴别，从而使得橄榄遗传背景不明确，而且由于缺乏科学系统的检测方法和权威的分类系统，致使同名异物或同物异名的现象时常发生，为橄榄品种的鉴别工作带来了极大的挑战。
4.issr(inter-simple sequence repeat)是物种遗传多样性研究中的常见方法，具有不受环境影响，结合位点丰富和灵敏度准确性高等特点，在品种鉴定方面，dna分子标记技术与传统技术相比具有更加突出的优点。
5.相关技术中，虽然也有采用issr分子标记技术鉴别橄榄的报道，但其鉴定准确度普遍无法实现大样本量下的高精度的要求，有研究人员对86份橄榄进行了遗传多样性分析，使用12条issr引物共扩增242条带，多态性百分率仅为95.45％，且对引物的需求量大并需要借助其它技术手段进行联合分析，鉴定工作较复杂；有研究对云南的59份油橄榄进行了issr鉴定分析，11对引物共扩增出了106条条带，多态性百分率仅为89.60％。
6.因此，开发一种才有更少引物、且在更大规模样本量筛查中能够显示出更高多态性百分率的橄榄品种鉴定方法对于提高橄榄品种鉴定的工作效率以及鉴定准确性都具有极为重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种橄榄issr-pcr分子标记组合及其应用。本技术发现了一组橄榄issr-pcr分子标记的引物组，可准确鉴定大样本量的橄榄样品，并准确的进行种质分类，从而实现橄榄品种的准确鉴定工作，降低橄榄选育难度和不确定性。
8.本发明的第一个方面，提供一组用于鉴别橄榄遗传多样性分析的issr引物组，所述引物组由seq id no：1～10组成。
9.其中，所述seq id no：1～10的具体核苷酸序列如下所示。
10.ubc808：5
’‑
agagagagagagagagc-3’(seq id no:1)
11.ubc812：5
’‑
gagagagagagagagaa-3’(seq id no:2)
12.ubc835：5
’‑
agagagagagagagagyc-3’(seq id no:3)
13.ubc836：5
’‑
agagagagagagagagya-3’(seq id no:4)
14.ubc880：5
’‑
ggagaggagaggaga-3’(seq id no:5)
15.ubc884：5
’‑
gagagagagagagagayc-3’(seq id no:6)
16.ubc886：5
’‑
vdvctctctctctctct-3’(seq id no:7)
17.ubc888：5
’‑
bdbcacacacacacaca-3’(seq id no:8)
18.ubc889：5
’‑
dbdacacacacacacac-3’(seq id no:9)
19.ubc890：5
’‑
vhvgtgtgtgtgtgtgt-3’(seq id no:10)
20.在本发明中，发明人发现上述引物组相较于现有技术中的橄榄issr引物组，其引物数量更少，能够在更大的样本量下实现更高精度的多态性检测，对于提高橄榄种质和品种鉴定提供了有利的技术支持。
21.本发明的第二个方面，提供一种用于鉴别橄榄遗传多样性分析的检测试剂，所述检测试剂中含有本发明第一个方面所述的issr引物组。
22.在本发明中，本发明中的检测试剂相较于现有技术，其含有的引物数量更少，能够在更大的样本量下实现更高精度的多态性检测，对于提高橄榄种质和品种鉴定提供了有利的技术支持。
23.本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的issr引物组在制备橄榄遗传多样性检测产品中的应用。
24.在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试剂、检测试剂盒、检测芯片。
25.在本发明的一些实施方式中，所述产品中还含有pcr扩增试剂。
26.在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增试剂包括但不限于pcr预混液、缓冲液、体系溶剂。
27.当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理添加其他用于扩增的辅助试剂，以实现定向扩增的目的。
28.本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的issr引物组在橄榄种质选育中的应用。
29.在本发明中，发明人基于上述issr引物组对橄榄样品dna进行扩增，并根据扩增产物在凝胶成像中的条带信息分析橄榄样品的种质信息，其测得的多态性百分率达到了99.26％，远超现有技术中的测得率。且对于101份橄榄样品均实现了精准分类，具有极高的准确性，从而有效的实现了优质化橄榄种植筛选以及为后续的育种工作提供了数据支持。
30.本发明的第五个方面，提供一种鉴别橄榄品种遗传多样性的方法，包括如下步骤：
31.(1)提取橄榄样品dna，基于seq id no：1～10中至少一条引物分别独立进行扩增，得到扩增产物；
32.(2)电泳分离扩增产物，并进行凝胶成像，获得条带信息；
33.(3)根据条带信息进行聚类分析，并建立dna指纹图谱，从而鉴别出橄榄品种。
34.在本发明的一些实施方式中，所述橄榄样品dna的提取是基于商用试剂盒获得的，当然，本领域技术人员也可以根据实际检测需求选择本领域中其他常规的dna提取方法提取获得。
35.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应体系为：
[0036][0037]
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应体系为：
[0038][0039]
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：94～95℃预变性2～5min；94～95℃变性25～30s，50℃退火42～45s，40～45个循环；72℃延伸9～10min。
[0040]
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，40个循环；72℃延伸10min。
[0041]
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物为seq id no:1、3、5、7～8和10的组合。
[0042]
在本发明实施例中，为了节省工作量，发明人仅从上述10条引物中随机筛选6条条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于橄榄dna指纹图谱的编写，并最终得到了对于101份橄榄有效的橄榄种质资源指纹图谱编码，实现了橄榄品种的高效分类。
[0043]
在本发明的一些实施方式中，所述引物为seq id no：1～10的组合。
[0044]
在本发明中，发明人基于上述issr-pcr反应体系能够很好的用于橄榄样品的种质鉴别，使扩增多态性达95％以上，从而得到其对应的种质关系(亲缘关系)和具体的dna分子指纹图谱，为issr分子标记在橄榄分类方面的应用提供借鉴，也为橄榄样品的种质开发和选育鉴定提供有效的技术支持和理论基础。
[0045]
在本发明的一些实施方式中，聚类分析的具体操作为：具体为：读取扩增条带信息，将电泳图谱上100～5000bp范围内同一位置上清晰且重复出现的条带记为“1”，同一位置上没有条带的记为“0”，以此生成0、1条带矩阵。利用nt-syspc2.0软件中simqual程序计算相似性系数矩阵，以clustering程序中shnn进行聚类分析；使用tree plot模块生成聚类图，并构建分子进化树。
[0046]
在本发明的一些实施方式中，dna指纹图谱的构建采用tbtools软件，绘制信息基于条带信息生成的0、1数据矩阵。
[0047]
本发明的有益效果是：
[0048]
(1)本发明提供了一组用于鉴别橄榄遗传多样性分析的issr引物组，该引物组相对于传统方法有效的减少了引物数量，并可以在更大的样本量的情况下实现高精准度的测
定工作，可识别的多态性高达99.26％，远超传统技术，实现了橄榄品种的精准分类。
[0049]
(2)本发明中的集合了橄榄dna提取方法、橄榄issr-pcr反应、琼脂糖凝胶对issr-pcr扩增产物分离等多个步骤，通过其组合实现了大规模橄榄品种遗传多样性高准确度分析工作，而且基于该方法，其条带分辨率更高，扩增片段更清晰，反应更加稳定，多态性识别度更高，可在短时间内完成大批量实验材料鉴定。
[0050]
(3)本发明中的鉴定方法鉴定成本低，有效缩短了样品的检测时间，结果稳定可靠，且能准确分辨橄榄种质资源间的亲缘关系，对橄榄种质资源的鉴定有重大意义。
附图说明
[0051]
图1为本发明实施例中获得的部分橄榄样品的琼脂糖凝胶电泳图。
[0052]
图2为使用ubc884引物扩增部分橄榄样品的扩增结果。
[0053]
图3为使用ubc884引物扩增部分橄榄样品的扩增结果。
[0054]
图4为使用ubc884引物扩增部分橄榄样品的扩增结果。
[0055]
图5为本发明实施例中基于issr遗传距离的不同橄榄样品的upgma聚类图。
[0056]
图6为本发明实施例中基于issr遗传距离的不同橄榄样品的upgma聚类图。
[0057]
图7为本发明实施例中基于issr遗传距离的不同橄榄样品的upgma聚类图。
[0058]
图8为本发明实施例中基于issr遗传距离的不同橄榄样品的upgma聚类图。
[0059]
图9为本发明实施例中得到的dna指纹编码图谱原图。
[0060]
图10为图9所示的dna指纹编码图谱的部分放大图。
[0061]
图11为图9所示的dna指纹编码图谱的部分放大图。
具体实施方式
[0062]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0063]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0064]
橄榄总dna提取
[0065]
在下述实施例中，其所用的橄榄样本为采自广东省农业科学院果树研究所资源圃及潮州市果树所橄榄资源圃中的共101份橄榄嫩叶。
[0066]
其中，具体的试验编号信息与品种情况如表1所示。
[0067]
表1橄榄样品试验编号信息与品种情况
[0068]
[0069][0070]
具体提取步骤如下：
[0071]
将橄榄总dna提取过程中用到的枪头、离心管、研钵等预先高压灭菌30min。
[0072]
取植物基因组提取试剂盒(m5 hiper plant genomic dnakit，购自北京聚合美生
物科技有限公司)中的裂解液，按质量比计，加入10％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％巯基乙醇，放入65℃水浴锅中预热。在液氮中研磨0.1g待测的橄榄嫩叶，加入上述裂解液混合液，混匀，倒入灭菌后的离心管中，65℃水浴45min～1h，期间，每间隔10min摇晃一次以帮助充分裂解。加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm常温离心8min。取上清，重复离心1次。取上清，按1：1.5的体积比加入试剂盒中的结合液，充分混匀；吸取上清，将其转移至dna纯化柱中，12000rpm常温离心30s，弃去收集管内的液体，重复此步骤直至将溶液完全转移。向dna纯化柱中加入700μl漂洗液，12000rpm常温离心30s，弃去收集管内的液体，然后重复该步骤1次；12000rpm再次离心2min。将dna纯化柱取出晾干，直至无乙醇残留。然后将dna纯化柱置于新的1.5ml离心管中，向纯化柱正中央加入50-100μl的ddh2o，静置2min，12000rpm离心1min。再次加入50-100μl的ddh2o，静置2min，12000rpm离心1min。弃去纯化柱，收集离心管内的液体，即得纯化后的橄榄总dna。
[0073]
使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测所得的橄榄总dna纯度，-20℃保存备用。
[0074]
其中，部分样品的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
[0075]
issr引物组合及pcr反应体系的设置
[0076]
在本实施例中，发明人共采用了10条引物构建检测引物组合，以用于检测橄榄品种多态性。
[0077]
具体的引物序列如表2所示。
[0078]
表2引物及其核苷酸序列
[0079]
引物编号引物序列(5
’→3’
)ubc808agagagagagagagagc(seq id no:1)ubc812gagagagagagagagaa(seq id no:2)ubc835agagagagagagagagyc(seq id no:3)ubc836agagagagagagagagya(seq id no:4)ubc880ggagaggagaggaga(seq id no:5)ubc884gagagagagagagagayc(seq id no:6)ubc886vdvctctctctctctct(seq id no:7)ubc888bdbcacacacacacaca(seq id no:8)ubc889dbdacacacacacacac(seq id no:9)ubc890vhvgtgtgtgtgtgtgt(seq id no:10)
[0080]
基于上述10条引物分别对橄榄总dna进行pcr检测，具体反应体系如表3所示。
[0081]
表3 pcr反应体系
[0082]
组分含量橄榄总dna2μlseq id no:1～10任一条引物(10μmol/l)1μlmaster mix15μl去离子水12μl总计30μl
[0083]
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，40个循环；72℃延伸10min。
[0084]
得到的pcr扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检验证，上样量为8μl/个样品。
[0085]
其中，以使用ubc884引物扩增结果为例，结果如图2～4所示，可以发现，其极好的展示了不同样品的扩增条带，且清晰度高，极易于技术人员分辨。
[0086]
通过使用上述引物组对101份橄榄样品进行扩增，其获得的每条引物多态性扩增结果如表4所示。
[0087]
表4引物组对101份橄榄样品的扩增结果
[0088]
引物编号扩增条带数多态性条带数多态性百分率/％ubc8081717100.00ubc8121010100.00ubc8351313100.00ubc8361313100.00ubc8801212100.00ubc8841515100.00ubc8861111100.00ubc8881919100.00ubc8891414100.00ubc890121191.67总计13613599.26
[0089]
可以发现，10条引物总计的扩增条带数为136条，其中多态性条带135条，测得的多态性百分率为99.26％。平均每条引物扩增条带数为13.6条，平均每条引物扩增得到多态性条带13.5条。上述引物扩增结果表明，在本发明实施例中构建得到的引物组扩增得到的条带信息量适中，多态性丰富，可用于后续的遗传多样性分析及指纹图谱构建工作。
[0090]
上述issr-pcr反应体系在橄榄品种遗传多样性分析中的应用
[0091]
通过上述issr-pcr反应体系的检测结果，可以对橄榄样品进行聚类分析。
[0092]
具体步骤为：
[0093]
将获得的电泳图谱上100～5000bp范围内同一位点上清晰且重复出现的条带记为“1”，同一位置上没有条带的记为“0”，分别获得每条引物对不同橄榄品种的0、1数据矩阵。统计每条引物扩增出的总条数和多态性总条数。用nt-syspc2.0软件中simqual程序计算相似性系数矩阵，以clustering程序中shnn进行聚类分析；使用tree plot模块生成聚类图，以此构建分子进化树。
[0094]
基于上述issr-pcr反应体系测得的issr分子标记，利用ntsyspc2.0软件对该101份橄榄样品进行聚类分析。101份橄榄样品根据亲缘关系远近均被分到不同类群中，其遗传相似系数为0.58～0.97，平均遗传相似系数为0.78。在阈值0.68处可将101份种质资源分成5组。第1组包含种质48份，编号为c1～c48；第2组包含种质45份，编号为c49～c52、c54～c55、c57～c73和c75～c96；第3组包含种质5份，编号为c97～c101；第4组包含种质2份，编号为c53和c56；编号c74样品单独为第5组。上述结果充分证明该样品发生了明显的遗传变异。其中，本实施例中具体的umpga聚类图如图5～8所示。
[0095]
构建橄榄dna指纹图谱：
[0096]
基于每条引物呈现的条带信息可以进一步建立待测橄榄的dna指纹图谱，具体步骤如下：
[0097]
在本实施例中，发明人为了节省工作量，仅从上述10条引物中随机筛选6条条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于橄榄dna指纹图谱的编写，当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理选择不同数量的引物的条带信息作为参考绘制dna指纹图谱。
[0098]
在本实施例中，发明人选择的引物为上述10条引物中的ubc808、ubc835、ubc880、ubc886、ubc888、ubc890所得到的条带信息。对这6条引物中清晰、典型，多态性丰富的多态性条带进行赋值，引物典型条带赋值信息见表5。
[0099]
表56条issr引物扩增典型条带的赋值
[0100][0101][0102]
其中，*代表品种特征条带。
[0103]
根据表5中的多态性条带赋值标准对101份橄榄供试样品进行dna指纹编码，指纹图谱编码如表6所示。根据扩增得出的0、1数据矩阵在tbtools中生成指纹图谱如图9～11所示。
[0104]
表6 101份橄榄种质资源指纹图谱编码
[0105]
[0106][0107]
综上所述，可以发现，通过上述issr-pcr反应体系能够很好的用于橄榄样品的种质鉴别，从而得到其对应的种质关系和具体的dna图谱，从而为橄榄样品的种质开发和选育鉴定提供有效的技术支持。
[0108]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。