一种酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法，具体涉及一种发酵偶联产物原位分离(气提或膜分离)进行稳定的酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法。


背景技术：

2.燃料乙醇是最主要的生物能源产品之一，目前主要以糖质、淀粉质和木质纤维素原料生产。淀粉质原料生产燃料乙醇，扣除副产品冲减后，原料成本仍然占总生产成本的60％左右，居首位，能耗成本占30％左右，次之。开发廉价原料资源，特别是以各类农作物秸杆为代表的木质纤维素类生物质，是解决燃料乙醇生产原料成本高的根本途径，但由于这类生物质对纤维素酶解的强抗性，从中获得糖的成本远远高于淀粉质原料，而且水解糖中含有20％-30％的五碳糖，难以被乙醇发酵性能优良的菌株有效利用，致使其燃料乙醇的生产成本远远高于糖质和淀粉质原料，无法工业化大规模生产。因此，开发燃料乙醇生产的节能技术，降低生产过程能耗，具有十分重要的意义。
3.以提高发酵终点乙醇浓度为目标的高浓度发酵，不仅可以降低发酵醪精馏操作的能耗，而且还可以减少燃料乙醇生产废糟液总量，节省废糟液处理的能耗。目前，国内外淀粉质原料乙醇发酵，连续发酵乙醇体积比浓度一般为11-12％，间歇发酵略高，可以达到13-15％。发酵终点乙醇浓度超过15％的高浓度发酵，甚至达到20％的超高浓度发酵，一直是学术界和工业界共同关注的研究方向，人们试图从发酵工艺的改进、培养基营养组分添加、发酵装置优化等方面着手，不断提高发酵终点乙醇浓度。然而，达到这样高乙醇浓度而导致发酵终点残余糖浓度升高，影响糖醇收率(工业生产中以进入发酵系统总糖来计算糖醇收率，发酵终点残余糖浓度升高会导致糖醇收率的显著降低)，不显著延长发酵时间，增加杂菌污染的机会，造成糖和发酵生成乙醇的损耗，是基础研究和应用技术开发面临的最大挑战，也是vhg技术迄今为止未能在工业化生产中得到实际应用的根本原因。
4.因此，开发超高浓度连续乙醇发酵是燃料乙醇工业化发展的一个重要方向。加拿大的dpbayrock博士利用多级串联反应器进行了短时间的超高浓度连续乙醇发酵并得到不错效果，详见：bayrock dp,ingledew wm.2001.application of multistage continuous fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology.journal of industrial microbiology and biotechnology 27,87-93。
5.然而，研究发现进行长时间超高浓度连续乙醇发酵过程中酿酒酵母呈现长周期、大振幅的振荡行为，并发现其对其乙醇发酵性能产生明显影响，详见：bai fw,chen lj,anderson wa,moo-young m.2004.parameter oscillations in very high gravity medium continuous ethanol fermentation and their attenuation on multi-stage packed column bioreactor system.biotechnology and bioengineering 88:558-566。
6.另外，巴西学者walter borzani教授也在利用酿酒酵母在含底物糖浓度20％的糖蜜(blackstrap molasses，含有大量灰分和其它杂质)的连续乙醇发酵的研究工作中发现
长周期，大振幅的振荡行为，详见：borzani w.2001.variation of the ethanol yield during oscillatory concentration changes in undisturbed continuous ethanol fermentation of sugar-cane blackstrap molasses.world journal of microbiology and biotechnology 17:253-258；遗憾的是walter borzani只报道了实验现象，分析了对乙醇发酵收率的影响，而没有开发这一振荡现象的弱化策略。目前，针对这种超高浓度连续乙醇发酵条件下振荡行为而开发相应的振荡弱化策略，在多级串联反应器条件下利用固定化方法较好地弱化了这种振荡，但这种多级罐串联操作的缺点在于增加了设备的投资和操作维护的难度。除此之外，而未见关于能够使高浓度乙醇发酵稳定策略的报道或专利技术。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种发酵偶联产物原位分离(气提或膜分离)技术进行稳定的酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法。
8.为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
9.一种酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法，即一种在连续乙醇发酵过程中偶联气提或膜分离装置来弱化乙醇生产菌在超高浓度连续乙醇发酵过程中参数振荡的方法，包括如下步骤：
10.(1)培养乙醇生产菌的步骤；
11.(2)利用乙醇生产菌进行超高浓度连续乙醇发酵的步骤；和
12.(3)利用气提法或膜分离步骤实现(2)的过程中超高浓度乙醇发酵稳定连续生产的步骤。
13.所述的乙醇生产菌优选为工业酿酒酵母或基因工程絮凝酵母菌bhl01。
14.其中，步骤(2)使用超高浓度连续乙醇发酵装置，步骤(3)的气提法使用气提装置，膜分离法使用膜分离装置；气提装置或膜分离装置偶联于超高浓度连续乙醇发酵装置，当发酵装置的发酵液中的发酵参数出现1-10个完整的振荡周期后，启动气提或膜分离装置，向乙醇发酵液中通入气体，利用气提法弱化连续乙醇发酵过程中乙醇生产菌的振荡行为。
15.在步骤(2)所述超高浓度连续乙醇发酵中使用的连续发酵培养基中初始糖浓度为250g/l-350g/l，最佳浓度为280g/l；连续发酵培养基的稀释速率为0.012-0.036h-1
，最佳为0.027h-1
。
16.培养基中的糖为葡萄糖，或小麦、玉米的糖化液。在连续的超高浓度乙醇发酵过程中，酵母细胞的发酵参数呈现周期性大幅振荡，所述发酵参数包括发酵液中的残余糖(包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖)，乙醇，生物量。
17.在步骤(3)的气提过程中所用的气体为氮气、空气或发酵自产气体如二氧化碳，气提的原料液为乙醇生产菌的发酵液，气体通过发酵系统中在搅拌桨的剪切作用下形成小气泡。当超高浓度连续发酵条件下的发酵液的发酵参数呈现1-10个完整的振荡周期后，启动气提装置，开始向乙醇发酵液中通入气提气体，每1.5升(连续发酵有效体积)乙醇发酵液中通入的气体流速为100-300l/h，最佳为200l/h。通入气体约100h后，发酵液中的乙醇浓度可维持在50g/l左右，发酵液中的残余糖浓度低于1g/l。停止通入气提气体时，连续发酵系统恢复到气提前的周期性振荡行为，其振荡周期超过100h。
18.超高浓度连续乙醇发酵可以显著降低燃料乙醇生产能耗，然而酵母细胞在vhg条
件下进行连续乙醇发酵呈现长周期、大振幅的振荡行为，不仅严重影响乙醇发酵性能，而且不利于精馏装置的稳定运行，致使超高浓度连续乙醇发酵技术未能在工业化生产中得到实际应用。
19.本发明提供的方法，不增加设备投资，有效地实现了单级罐超高浓度连续乙醇发酵并且控制残余糖浓度低于1g/l，达到了工业要求，为超高浓度连续乙醇发酵工业化生产提供了新的技术支持。
附图说明
20.图1为本发明中连续空气或氮气气提乙醇发酵装置结构示意图；
21.图2为本发明中连续自产气气提乙醇发酵装置结构示意图；
22.图3为游离酵母细胞连续乙醇发酵过程中发酵参数振荡的数据曲线；
23.图4为絮凝酵母细胞连续乙醇发酵过程中发酵参数振荡的数据曲线；
24.图5为游离细胞连续乙醇发酵系统中氮气气提前后发酵参数的数据曲线；
25.图6为游离细胞连续乙醇发酵系统中空气气提前后发酵参数的数据曲线；
26.图7为絮凝细胞连续乙醇发酵系统中自产气气提前后发酵参数的数据曲线。
具体实施方式
27.以下结合技术方案和附图详细叙述实施例。
28.培养乙醇生产菌
29.所述乙醇生产菌为工业酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或基因工程絮凝酵母菌bhl01。其中，所述基因工程絮凝酵母菌bhl01为将絮凝基因导入工业酿酒酵母菌中得到的组成型表达的絮凝酵母菌株。
30.本文中为了简洁，将工业酿酒酵母，简称为游离酵母；基因工程絮凝酵母菌bhl01，简称为絮凝酵母。
31.将在培养皿中培养的菌株接种于摇瓶中的生长培养基中，在25-37℃，200-300rpm的恒温摇床中振荡培养，培养时间为15-25h，菌株培养条件优选为在30℃﹑300rpm摇床振荡条件下培养20h。
32.小麦、玉米糖化液的制备
33.糖化液的制备在搅拌罐中进行,将脱胚脱皮玉米粉或小麦粉与60-65℃左右的温水按的比例1:2.5配制成粉浆,并按每公斤玉米粉或小麦粉0.6ml的比例加入α-淀粉酶,升温至85-90℃,保温液化1-1.5小时,然后降温至60-65℃,按每公斤玉米粉1.2ml的比例加入糖化酶,保温糖化10-15小时后,过滤得糖化液,供整个发酵系统使用。
34.利用乙醇生产菌进行超高浓度连续乙醇发酵
35.①
将上述步骤中得到的含有乙醇生产菌的种子培养液按体积百分比10％的接种量接入到装有1.5l批式发酵培养基的发酵罐3中，在30℃，300rpm，ph 4.5的发酵条件下进行批式发酵培养，利用设置在发酵罐3上的温度调节器7和ph调节器8调节发酵液温度和发酵液ph值。发酵过程中的发酵液ph值优选控制在4.5，通过ph调节器8向发酵液中加入2mol/l氢氧化钠水溶液来调节。在发酵过程中向发酵罐3中通入压缩空气，压缩空气通过转子流量计5b进行控制流量，将通气速率控制在0.05vvm，空气在通入发酵罐前需经过装有水的设
备6b调节空气湿度，使通入发酵罐3的空气中含有饱和的水蒸气。每隔12h，测定发酵液中的残余糖和乙醇浓度。
36.②
当发酵罐3中发酵液的残余糖浓度低于1g/l时,开始从储罐1中通过蠕动泵(图1中2，图2中2a)向发酵罐3中以0.012-0.036h-1
的稀释速率流加连续发酵培养基，进行连续发酵培养，每隔12h，测定发酵液中的发酵参数。连续发酵培养条件同
①
中所述发酵条件。连续发酵培养基的稀释速率优选为0.027h-1
。
37.连续发酵体系通过发酵罐3上的溢流口控制发酵体积，发酵液由溢流口流入废液罐4中。
38.在进行超高浓度连续乙醇发酵后，检测到的发酵参数出现大幅度波动，约100-130h后呈现稳定的连续振荡行为。
39.连续发酵培养基中碳源为葡萄糖或小麦、玉米的糖化液，初始糖的浓度为250-300g/l,优选为280g/l。
40.所述发酵参数包括发酵液中残余糖、乙醇和生物量。
41.传统乙醇发酵过程中，由于发酵后期高浓度乙醇对细胞的抑制作用，因此只能进行高浓度底物的批式发酵，难以实现连续的高浓度乙醇发酵，工业上虽是进行的连续发酵，但是流加的培养基都是含有低浓度糖的培养基。因此进行超高浓度连续乙醇发酵是工业乙醇发酵的重要方向，相对传统的乙醇发酵工艺是一个很大的提高和改善，使用这种工艺可以提高终点发酵的乙醇浓度，从而降低乙醇精馏能耗。但是，在连续超高浓度连续乙醇发酵过程中乙醇生产菌的振荡现象使得发酵过程中的底物不能稳定地转化为乙醇，容易造成大量的底物损失和能量消耗，因此，弱化这种振荡现象对于超高浓度连续发酵生产工业乙醇显得尤为重要。本发明利用高浓度连续乙醇发酵中进行气提的方法有效弱化这种酵母细胞的振荡现象。
42.利用气提或膜分离法弱化发酵过程中乙醇生产菌的发酵参数振荡行为
43.待出现1-10个完整的发酵参数振荡周期后，在不改变连续乙醇发酵条件的同时启动气提装置，通过转子流量计5a以100-300l/h的速率向发酵液中通入气体，大气泡在搅拌桨的剪切作用下分裂成许多小气泡，由于气液两相的乙醇浓度梯度的驱动两相间的乙醇传递作用，乙醇在气相中随气泡流入冷凝设备中得到收集，如此进行乙醇气提。
44.利用气提法时，所述通入气体为空气、氮气或发酵自产气体，其中，通入气体为空气或氮气时采用图1所示的连续气提乙醇发酵装置；通入气体为发酵自产气时采用图2所示的连续自产气气提乙醇发酵装置。利用膜分离法时，采用图3所示的发酵-膜分离耦合装置及亲水性的聚乙烯醇(pva)-磷酸化壳聚糖(cs)复合基质膜，对菌液进行加热蒸发，混合蒸汽进入膜内，具有膜选择性的乙醇分子透过膜后通过冷凝装置收集。
45.图1中，通入气体流速通过转子流量计5a控制，并在通入发酵罐3前通过设备6a调节湿度，使通入发酵罐3的气体中含有饱和的水蒸气。发酵罐3中的气体带走部分乙醇同时在冷凝管11中被冷凝回收到收集瓶9中，由于发酵液中乙醇被移除，降低了乙醇对细胞的毒性伤害，乙醇生产菌的乙醇毒害作用得到了缓解，气提一段时间后发酵系统趋于稳定，发酵罐3中的乙醇浓度维持在一定的浓度，当乙醇生产菌为游离酵母时乙醇浓度维持在47.36
±
8.15％g/l水平，当乙醇生产菌为絮凝酵母时维持在75.56
±
4.67％g/l水平，同时发酵液中的残余糖浓度也维持在低于1g/l的水平，这种近似稳态的连续发酵状态维持不变。直到停
止气提操作后，发酵系统才渐渐恢复到之前的周期性振荡行为(如图5，图6，图7)。通过进水口12向冷凝管11中流入低温冷凝液，保持冷凝管11处于0-5℃的温度范围，13为出水口，而收集瓶9在冷凝夹套10中保持低温状态。
46.图2中，气提气体为发酵自产气，通入气体流速通过空气泵2b来调节。通过气体流量计5b向发酵罐3中通入微量空气，以维持乙醇生产菌的正常生长，通气速率控制在0.05vvm。图2中其他设备及功能与图1中相同。
47.在气提弱化过程中，通入气体为氮气时，所收集得到的乙醇浓度高于通入气体为空气时的乙醇浓度。这是因为通入气体为空气时，由于空气中氧气给超高浓度乙醇发酵条件下的酵母细胞提供充足的氧气，使碳流量大量流向生物量合成途径，有可能会削弱乙醇胁迫在发酵参数振荡过程中的影响，而惰性气体氮气对乙醇发酵没有影响，所以得到的乙醇浓度高于通入空气时的乙醇浓度。
48.在气提弱化过程中，通入气体为发酵自产气时，可以有效防止在使用外源气体(空气或氮气)时的气体流速较大且气体中乙醇冷凝不够彻底而导致部分乙醇随尾气排出造成损失的问题，提高气提效率而且节省外源气体供应。
49.图3中，在膜分离的过程中，菌株发酵罐3中的发酵菌液在蠕动泵的作用下进入膜器4中。由于膜材料是亲醇性的，乙醇分子优先透过膜，其余物质被膜阻隔回流进菌株发酵罐3中。冷凝装置5中不断补充液氮，使得蒸发后的乙醇液化，最后在6中收集乙醇液体。
50.絮凝酵母细胞作为乙醇生产菌，由于其独特的絮凝沉降特性维持发酵体系中高生物量，从而防止生物量流失以及减少底物合成生物量的消耗，同时减轻流出液乙醇分离过程中生物量去除的能耗，能有效提高乙醇的得率。
51.实施例
52.下面结合实施例对本发明作具体说明。
53.乙醇生产菌：工业酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)，购买于美国atcc菌种库(atcc number:4126)。
54.②
基因工程絮凝酵母菌bhl01(菌种保藏号：cgmcc 3408，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
55.培养基：
56.①
摇瓶生长培养基:每升培养基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨6g,121℃灭菌20min。
57.②
批式发酵培养基:每升培养基中含糖120g(为葡萄糖或小麦、玉米的糖化液),酵母粉5g,蛋白胨3g,121℃灭菌20min。
58.③
连续发酵培养基:每升培养基中含糖280g(为葡萄糖或小麦、玉米的糖化液),酵母粉5g,蛋白胨3g,110℃灭菌15min。
59.《乙醇生产菌的培养和超高浓度连续乙醇发酵》：用接种环接入一环斜面保存(4℃)的工业酿酒酵母菌到含有100ml摇瓶生长培养基的250ml摇瓶中,在旋转式摇床上以300rpm、30℃的条件下培养20h后,接入到发酵罐3中的批式发酵培养基中,接种量为培养基量的10％(体积百分比)，接种后在转速300rpm、30℃、ph4.5和通气量为0.05vvm的设定条件下培养,空气的湿度通过设备6b调节至饱和。培养15h后，每隔12h，测定发酵液中的残余糖浓度，当发酵液中的残余糖浓度低于1g/l时，在不改变发酵条件的情况下，按照0.027h-1
的
速率流加连续发酵培养基,进行连续发酵，每隔12h，测定发酵液中的发酵参数，即生物量和乙醇、残余糖的浓度。在连续发酵过程中，发酵参数出现波动，一段时间后呈现稳定的连续振荡行为。
60.《气提弱化发酵过程中振荡行为》:连续超高浓度乙醇发酵呈现周期性振荡行为，等到出现2-3个完整的振荡周期后，启动气提装置，通过流量器5a,以200l/h的速率通入无菌气体，一段时间后，发酵系统维持稳定，这种近似稳态的状态维持不变，直到停止气提操作后，发酵系统才渐渐恢复到之前的周期性振荡行为。
61.乙醇和糖的浓度测定的分析使用常规液相色谱法。生物量的测定使用恒温干重法。比较例1游离细胞超高浓度乙醇发酵体系中发酵参数振荡行为
62.在单级搅拌发酵罐中进行超高浓度连续乙醇发酵，按上述方法进行游离酵母细胞的培养和乙醇发酵，以0.027h-1
的稀释速率向发酵液中流加连续发酵培养基，一段时间后，酵母细胞的发酵参数呈现一种长周期大振幅的振荡行为(图3)。如图3所示，发酵液中残余糖、乙醇和生物量浓度分别在179.70-92.61g/l、71.31-31.4g/l和7.04-2.18g/l区间内振荡，振荡周期约130h。
63.比较例2絮凝细胞超高浓度乙醇发酵体系中发酵参数振荡行为
64.在单级搅拌发酵罐中进行超高浓度连续乙醇发酵，按上述方法进行絮凝酵母细胞的培养和连续乙醇发酵，以0.027h-1
的稀释速率向发酵液中流加连续发酵培养基，一段时间后，酵母细胞的发酵参数呈现一种长周期大振幅的振荡行为(图4)。如图4所示，发酵液中残余糖、乙醇和生物量浓度分别在212.21-59.73g/l、88.41-25.37g/l和12.24-3.17g/l区间内振荡，振荡周期约130h。
65.实施例1在游离细胞超高浓度乙醇发酵体系中利用空气弱化振荡
66.利用在图1所示的连续气体气提乙醇发酵装置，按上述方法进行游离酵母细胞的培养和连续乙醇发酵。
67.在进行单级搅拌罐超高浓度连续乙醇发酵的基础上，当酵母细胞的发酵参数出现2-3个完整的振荡周期后，启动气提装置，通过流量器5a将无菌空气通入发酵罐3中，在连续乙醇发酵的同时进行乙醇气提。实验表明，气提乙醇很大程度地降低了发酵液中的乙醇浓度，图1冷凝收集瓶9中收集的乙醇浓度达到166.81g/l，乙醇得率达到约25％；很大程度地弱化单级罐连续超高浓度发酵过程中出现的经发酵参数振荡，残余糖浓度从140.07
±
28.22％降到了1g/l以下，达到了乙醇发酵工业化要求，生物量由4.02
±
58.84％提高到了32.37
±
4.78％，如图5所示。空气气体之前的发酵参数以及空气气提后的具体发酵参数如下表所示：
68.振荡参数残余糖g/l乙醇g/l生物量g/l气提前140.07
±
28.22％57.54
±
37.78％4.02
±
58.84％空气气提弱化后0.08
±
26.54％37.03
±
9.77％32.37
±
4.78％
69.实施例2在游离细胞超高浓度乙醇发酵体系中利用氮气气提弱化振荡
70.利用在图1所示的连续气体气提乙醇发酵装置，按上述方法进行游离酵母细胞的培养和连续乙醇发酵。
71.在单级搅拌罐超高浓度连续乙醇发酵的基础上，当酵母细胞的发酵参数出现一个完整的振荡周期后，启动气提装置，通过流量器5a将无菌氮气通入发酵罐3中，在连续乙醇
发酵的同时进行乙醇气提。结果表明，气提乙醇很大程度地降低了发酵液中的乙醇浓度，图1冷凝收集瓶9中收集的乙醇浓度达到189.07g/l，乙醇得率达到约25％；很大程度地弱化单级罐连续超高浓度发酵过程中出现的参数振荡，残余糖浓度从134.53
±
37.33％g/l降到了1g/l以下，达到了乙醇发酵工业化要求，生物量由3.38
±
71.01％g/l提高到了24.33
±
4.17％g/l，如图6所示。氮气气提之前的发酵参数以及气提后的具体发酵参数如下表所示：
72.振荡参数残余糖g/l乙醇(发酵液)g/l生物量g/l气提前134.53
±
37.33％54.86
±
39.03％3.38
±
71.01％氮气气提弱化后0.08
±
25.72％47.36
±
8.15％24.33
±
4.17％
73.实施例3在絮凝酵母细胞超高浓度乙醇发酵体系利用发酵自产气气提弱化振荡
74.利用在图2所示连续自产气气提乙醇发酵装置，按上述方法进行絮凝酵母细胞的培养和连续乙醇发酵。
75.在进行单级搅拌罐超高浓度连续乙醇发酵的基础上，当酵母细胞的发酵参数出现一个完整的振荡周期后，启动气提装置，通过空气泵2b将发酵自产气通入发酵罐3中，在连续乙醇发酵的同时进行循环乙醇气提。实验表明，气提乙醇很大程度地降低了发酵液中的乙醇浓度，图2冷凝收集瓶9中收集的乙醇浓度达到294.36g/l，总乙醇产量达到95.01
±
5.14％g/l,乙醇得率达到约34.55％(g乙醇/g糖)；很大程度地弱化单级罐连续超高浓度发酵过程中出现的参数振荡，残余糖浓度从121.41
±
62.79％g/l降到了1g/l以下，达到了乙醇发酵工业化要求，生物量由7.76
±
59.41％g/l提高到了49.05
±
11.29％g/l，如图7所示。结合实施例1、实施例2和实施例3可知，在游离细胞和絮凝细胞的超高浓度连续乙醇发酵体系中，通过外源气体或者自产气的连续气提都能有效地弱化酵母细胞的振荡行为，提高发酵效率和底物的转化率。
76.发酵自产气气提之前的发酵参数以及气提后的具体发酵参数如下表所示：
77.振荡参数残余糖g/l乙醇(发酵液)g/l生物量g/l气提前121.41
±
62.79％62.54
±
67.11％7.76
±
59.41％氮气气提弱化后0.09
±
27.02％75.56
±
4.67％49.05
±
11.29％
78.实施例4在游离细胞超高浓度乙醇发酵体系中利用膜分离弱化振荡
79.利用在图3所示的连续气体气提乙醇发酵装置，按上述方法进行游离酵母细胞的培养和连续乙醇发酵。
80.在进行单级搅拌罐超高浓度连续乙醇发酵的基础上，当酵母细胞的发酵参数出现一个完整的振荡周期后，启动膜分离装置，通过蠕动泵2b将经过膜器分离的发酵液通入发酵罐3中，在连续乙醇发酵的同时进行膜分离。由于膜为亲醇性的，乙醇分子可以透过分离膜，实验表明，膜分离很大程度地降低了发酵液中的乙醇浓度，图3冷凝收集瓶6中收集的乙醇浓度达到790.15g/l，乙醇得率达到约25％，很大程度地弱化单级罐连续超高浓度发酵过程中出现的参数振荡；残余糖浓度从132.23
±
46.39％g/l降到了1g/l以下，达到乙醇发酵工业化要求，生物量由6.97
±
52.43％g/l提高到了22.51
±
4.72％g/l。进行膜分离之前的发酵参数以及分离后具体发酵参数如下表所示：
81.振荡参数残余糖g/l乙醇(发酵液)g/l生物量g/l气提前132.23
±
46.39％56.20
±
32.16％6.97
±
52.43％
膜分离后0.08
±
21.23％56.62
±
9.63％22.51
±
4.72％
82.实施例5在絮凝酵母细胞超高浓度乙醇发酵体系利用膜分离弱化振荡
83.利用在图3所示膜分离-发酵耦合装置，按上述方法进行絮凝酵母细胞的培养和连续乙醇发酵。
84.在进行单级搅拌罐超高浓度连续乙醇发酵的基础上，当酵母细胞的发酵参数出现一个完整的振荡周期后，启动膜分离装置，通过蠕动泵2b将经过膜器分离的发酵液通入发酵罐中，在连续乙醇发酵的同时进行膜分离。实验表明，膜分离很大程度地降低了发酵液中的乙醇浓度，总乙醇产量达到90.42
±
6.51％g/l,乙醇浓度达到约34.80％(g乙醇/g糖)，残余糖浓度从125.78
±
51.01％g/l降到了1g/l以下，达到了乙醇发酵工业化要求，生物量由4.68
±
62.04％g/l提高到了42.51
±
9.13％g/l。结合实施例1-5可知，在游离细胞和絮凝细胞的超高浓度连续乙醇发酵体系中，通过气提及膜分离，能有效地弱化酵母细胞的振荡行为，提高发酵效率和底物的转化率。
85.进行膜分离前的发酵参数以及膜分离后的具体发酵参数如下表所示：
86.振荡参数残余糖g/l乙醇(发酵液)g/l生物量g/l气提前125.78
±
51.01％65.89
±
61.05％4.68
±
62.04％膜分离后0.09
±
24.35％70.21
±
5.36％42.51
±
9.13％