一种益生菌组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生态技术领域，特别是涉及一种益生菌组合物及其应用。


背景技术：

2.龋齿是一种常见的慢性口腔疾病，由宿主和微生物群之间的稳态失衡引起。据估计，全球有23亿人患有恒牙龋齿，超过5.3亿儿童患有乳牙龋齿。受龋齿影响的学童比例为60％
–
90％，这在发达国家和发展中国家都很常见。龋齿是疼痛和不适的原因，除了失去美观外，对冷热饮料的敏感性增强，此外，牙科治疗的成本很高。
3.细菌菌斑生物膜的形成是龋齿发生的先决条件。成熟的牙菌斑生物膜是一种三维微生态环境，由多种细菌嵌入基质中，基质主要由具有一定厚度的水不溶性多糖组成。在正常的牙菌斑生物膜中，口腔菌群处于动态平衡状态。当宿主、饮食或微生物生长因子改变生态平衡时，斑块中的酸化细菌会降低生物膜环境的ph值。随后，牙齿中的脱矿质-再矿化平衡转向矿物质流失，导致蛀牙。变形链球菌具有较强的产酸和抗酸能力，已被公认为致龋菌的主要类型。由变形链球菌合成的大量胞外多糖对牙菌斑的复杂三维结构很重要。事实上，许多研究报告了变形链球菌的存在、生物膜形成和相关的龋齿风险之间的关系。
4.功能性便秘亦是影响儿童健康成长的重要因素之一，功能性便秘是儿童时期最常见的胃肠道疾病之一。儿童便秘症状的全球患病率各不相同，估计范围为0.3％-28％。而肠道菌群的失衡是引发便秘的重要因素。
5.目前，已报道了一些方法来预防儿童龋齿，其中最主要的是使用氟化物(水氟化和含氟牙膏)治疗和使用抗菌漱口水去除牙菌斑。其他预防龋齿的方法包括在牙齿的易受影响的窝窝和裂隙上使用窝窝和窝沟封闭剂，但是这些形式的治疗又是昂贵的。氟化物治疗的缺点是摄入过量的氟化物会导致骨骼和氟斑牙。抗菌漱口水的缺点是，即使是口腔中的有益细菌也会被杀死，从而为病原体重新进入口腔创造开放的、非竞争性的表面；此外，长期使用会导致牙齿染色。
6.有报道使用中药或其提取物或酶制剂的产品来预防龋齿，但是这些方法或配方并不太适合于儿童，中药材对儿童的副作用并不可知；而使用酶成分的方法，由于酶极易失活，产品的有效性并不能很好地保证。
7.与其他预防方法相比，益生菌的优势在于它们通常被认为是安全的，并且具有额外的健康益处，例如维持健康的肠道。益生菌对于口腔健康的作用机制被认为是对抗病原体的拮抗活性、病原体的共聚集和生长抑制、细菌素、有机酸和过氧化氢的产生，以及与口腔上皮的相互作用，从而降低生物膜微生物的致病性和致龋潜力。免疫似乎也与口腔疾病作斗争的先天性和适应性免疫反应有关。
8.目前仅有极少的文献报道益生菌方法，但是生产成本高，工艺复杂，且目前没有一种更能够同时改善儿童龋齿及便秘的益生菌产品。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种益生菌组合物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该益生菌组合物可同时改善儿童龋齿及便秘。
10.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
11.本发明提供一种同时改善儿童龋齿及便秘的益生菌组合物，包含凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)tbc169、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)dh231和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)dh-lr-121。
12.进一步地，所述凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)tbc169、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)dh231和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)dh-lr-121的质量比为(0.9-2.8)：(0.5-2.5)：(1.8-4.2)。
13.进一步地，所述益生菌组合物还包括低聚果糖和聚葡萄糖。
14.优选地，所述凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)tbc169、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)dh231和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)dh-lr-121的质量比为2.2：2：3。
15.本发明还提供一种同时改善儿童龋齿及便秘的产品，包含上述的益生菌组合物。
16.本发明还提供上述的益生菌组合物在制备同时改善儿童龋齿及便秘的产品中的应用。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明制备的益生菌组合物包含凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)tbc169、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)dh231和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)dh-lr-121，该组合具有改善龋齿的作用，且在一定配伍比例下，效果更优。同时，本发明制备的益生菌组合物不仅能够抑制致龋菌变形链球菌的生长，对儿童龋齿有改善效果，而且对儿童便秘起到很好的改善作用。
19.相比于中药材或中药提取物，本发明制备的益生菌组合物安全无副作用，原材料适宜儿童群体，同时改善口腔微生态平衡和肠道微生态平衡；制备工艺简单，成本低，为儿童牙齿及肠道健康提供一种天然双向保护方式。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为唾液变形链球菌评分图；
22.图2为斑块变形链球菌评分图；**表示与对照组相比有显著性差异(p＜0.01)；*表示与对照组相比，有差异性但不显著(p＜0.05)；
23.图3为变异链球菌生长变化图；**表示与对照组相比有显著性差异(p＜0.01)；*表示与对照组相比，有差异性但不显著(p＜0.05)；
24.图4为不同配方对厌氧菌数的影响；**表示与对照组相比有显著性差异(p＜0.01)；*表示与对照组相比，有差异性但不显著(p＜0.05)；
25.图5为不同配方对兼性厌氧菌数的影响；**表示与对照组相比有显著性差异(p＜0.01)；*表示与对照组相比，有差异性但不显著(p＜0.05)；
26.图6为排便频率变化图。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.以下实施例中，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)tbc169保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.1207，已在专利zl200410098660.4中公开；
33.婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)dh231分离自人体正常粪便，经中国科学院微生物研究所检验鉴定为婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)，于2019年8月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.18372；
34.鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)dh-lr-121分离自人体正常粪便，经中国科学院微生物研究所检验鉴定为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)，于2016年9月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.13076。
35.实施例1
36.通过测试唾液和斑块中变形链球菌水平研究确定最佳抑制变形链球菌的益生菌组合物的配伍比例：
37.1.人群筛选
38.本实施例筛选了126名儿童，根据纳入和排除标准，选择了48名儿童。患者的平均年龄为8.5
±
1.6岁(范围为5-15岁)。男20例(41.67％)，女28例(58.33％)。这些儿童通过随
机化(计算机生成的随机数)分成6组，每组8人，即益生菌a、b、c、d、e组以及对照组(control)，各配方组的成分比例见下表1。每组儿童的样本量基于置信水平(95％)和误差范围(1％)。研究期间没有辍学；因此，所有48名儿童都完成了研究(图1)。益生菌配方组及对照组儿童服用剂量和时间相同，水溶解后服用，每天服用2次(早晚)，持续30天。在研究开始之前，筛选后(筛选日)被选中的48名儿童被提供口腔卫生指导，并要求在治疗期间保持口腔保健。提供了关于正确刷牙方法的说明，以及每天刷牙两次和饭后用力冲洗的必要性。然而，他们被指示在第1次取样检测(筛选和选择后的第二天)和第2次取样检测(治疗14天后)前24小时不要刷牙，以便轻松收集牙菌斑。
39.表1各配方组的物料成分质量比例
[0040][0041]
2选择标准
[0042]
2.1纳入标准
[0043]
该研究包括5至15岁的具有较高龋齿风险(dmfs/defs≥5)的任何性别的儿童(包括便秘或无便秘人群)。其他纳入标准：研究前三个月未服用任何形式的抗生素或益生菌的儿童，愿意咀嚼片剂并参与研究的儿童，受试者的父母愿意提供书面知情同意书并遵循学习程序。
[0044]
2.2.排除标准
[0045]
排除标准包括患有严重感染、全身疾病、免疫系统减弱和先天性异常的儿童；接受氟化物治疗的儿童；研究开始后三个月内使用木糖醇口香糖、益生菌产品、抗生素或皮质类固醇的儿童；和那些不愿意参加研究的人。
[0046]
3.唾液样本的收集
[0047]
上午9点到10点收集龋齿唾液样本(lashley杯无刺激收集舌下腺液和颌下腺)，以避免任何昼夜变化。
[0048]
4.斑块样本的收集
[0049]
使用无菌牙签从所有牙齿上收集龈上菌斑。然后将样品转移到无菌试管中，并以1:10的比例稀释以进行所有评估。
[0050]
5.唾液和斑块变形链球菌和乳酸杆菌的估计
[0051]
通过椅旁试验(crt bacteria,ivoclar vivadent ag,schaan,liechtenstein)估
计唾液和斑块变形链球菌和乳酸杆菌的数量。在对菌落进行鉴定和计数后，根据菌落形成单位(cfu/ml)的数量，变形链球菌的评分范围为1-4(表2)。
[0052]
表2
[0053][0054]
6统计分析
[0055]
采用t检验，测量数据表示为具有sd的平均值。p＜0.01的值被认为是显著的；p＜0.05为有差异但不显著。
[0056]
7.结果
[0057]
7.1.唾液变形链球菌水平
[0058]
如图1所示，与对照组相比，在服用30天的各配方组益生菌后，唾液变形链球菌水平(如评分数所示)有不同程度的降低，且与对照组相比，c配方组有显著性变化(p＜0.01)；而e配方组相比于对照组，有变化但不显著；其余各配方组相比于对照组，变形链球菌均有一定程度降低，但相比于对照组，没有显著性差异。从以上变化可以看出，不同配方组对唾液变异链球菌的抑制程度不同，本实验可知，c配方组对唾液变异链球菌的抑制效果最好。
[0059]
7.2斑块变形链球菌的变化
[0060]
如图2所示，服用30天各配方组益生菌后，在斑块样本中变形链球菌水平相比于对照组有不同程度的降低；相比于对照组，c配方组和e配方组，对斑块中变形链球菌的抑制效果相比于对照组有显著性变化(p＜0.01)；a配方组对斑块变形链球菌的抑制效果也较好，相比于对照组有差异性但是不显著(p＜0.05)；其余b、d各组虽然也表现出对斑块中变形链球菌的抑制作用，但是效果不如c组和e组。
[0061]
实施例2测试不同配方对变形链球菌的抗菌活性(细菌生物膜、细菌黏附性)
[0062]
实验方法：为了确定不同配方的抗菌活性，变形链球菌在bhi肉汤中于37℃培养过夜。将变形链球菌培养物用bhi肉汤培养基稀释至浊度相当于mcfarland 0.5(1.5
×
108个细胞/ml)。然后，将100μl变形链球菌悬浮液和100μl各配方组处理的上清液添加到96孔微量滴定板的孔中，重复6次。然后将板在37℃厌氧培养24小时。在对照孔中，培养液为无菌mrs肉汤。孵育后使用酶标仪记录od(600nm)。
[0063]
实验结果：如图3所示，各配方组对变异链球菌的生长显示出明显的抑制作用，各配方组之间无显著性差异；但是相比于对照组，c组的配方表现出最明显的抑制作用(与对照组之间有显著性差异p＜0.01)；此外，a配方组和e配方组对变形链球菌的抑制效果仅略逊于c组，与对照组有差异性(p＜0.05)。
[0064]
实施例3不同配方组产品对厌氧菌及兼性厌氧菌总数的影响
[0065]
收集龋齿儿童牙齿菌样本：在受试儿童服用各配方组益生菌产品以及市售产品和对照组产品的第0、3、5周分别以棉花刮棒刮取受试儿童每颗牙齿内外侧，作为牙齿细菌采样样本。测试其中厌氧菌及兼性厌氧菌的数量。实验结果见图4、图5。由图4和图5可以看出，我们各配方益生菌产品能够有效的增加口腔厌氧菌及兼性厌氧菌的数量，帮助恢复口腔微
生态平衡。其中，c配方组相比于市售产品组可显著提高口腔厌氧菌及兼性厌氧菌的数量，且相比于对照组有显著性差异，其他配方组相比于对照组及市售产品组，也可明显提高口腔菌群数量，但效果没有c配方组更好。
[0066]
由以上各实施例的实验结果可以看出，各配方组益生菌组合物中，c配方组的益生菌组合物对变异链球菌的抑制效果最佳，且能够有效改善口腔菌群平衡，恢复口腔微生态平衡。
[0067]
基于对变异链球菌抑制效果最佳的c配方组及效果次之的e配方组进行益生菌产品的制备(bc、be)，并进一步考察我们的益生菌产品对儿童功能性便秘的改善效果。
[0068]
bc配方：婴儿双歧杆菌dh231菌粉2.0g、鼠李糖乳杆菌dh-lr-121菌粉3.0g、
[0069]
凝结芽孢杆菌tbc169菌粉2.2g、低聚果糖28g、聚葡萄糖21g和乙酰化双淀粉己二酸酯9.9g。
[0070]
be配方：婴儿双歧杆菌dh231菌粉2.4g、鼠李糖乳杆菌dh-lr-121菌粉3.5g、
[0071]
凝结芽孢杆菌tbc169菌粉2.8g、低聚果糖17g、聚葡萄糖24g和乙酰化双淀粉己二酸酯8.8g。
[0072]
bc和be采用相同的制备工艺进行制备，制备工序如下：
[0073]
(1)称量、混料：按照上述配方称取原辅料；将检查无误的物料按照由多到少的顺序逐一投入混合机(hda-800型多向运动混合机)，设定电机转速为27转/分钟(主轴转速6转/分钟)，混合20分钟，混合过程中严格控制混合时间。
[0074]
(2)内包：对sk系列条状包装机进行安装复合膜、色带，开机预热，进行空载调机，后，向料斗内加入混合粉，内包过程中控制装量稳定。
[0075]
(3)外包：将内包完成后的产品进行外包工序。
[0076]
实施例4配方组产品及市售产品对儿童便秘改善效果
[0077]
我们进行了一项前瞻性、双盲、安慰剂对照、随机和平行组试验。从儿科门诊收集儿童便秘患者(年龄在1岁-8岁；便秘至少1个月，并且包括以下标准中的至少两个：每周排便两次或更少，大便滞留史，排便疼痛或硬排便史；诊所a：n＝2；b：n＝20；c：n＝15；d：n＝14；e：n＝9)。排除了具有已知便秘器质性原因的受试者，例如先天性巨结肠、脊柱裂、牛奶过敏和代谢疾病。在患者被纳入研究之前，使用排便日记在两周内评估了他们的便秘基线状况。将以上儿童患者随机分为4组：a组(n＝14)接受配方bc益生菌产品；b组(n＝12)接受be益生菌产品；c组(n＝10)接受市售膳食纤维活性益生菌粉i；d组(n＝10)接受市售膳食纤维活性益生菌粉ii。服用方法均为：每人每天2次，每次2g。
[0078]
通过排便日记评估排便频率。护理人员对日记进行评估，以检查排便状态(大便频率、大便稠度和大便量)。根据bristol大便形式量表对大便稠度进行评分，为1-7型(1型：分离的硬块，如坚果；2型：香肠状但块状；3型：类似于香肠或蛇，但表面有裂缝；4型：类似于香肠或蛇，光滑柔软；5型：边缘清晰的软团块；6型：蓬松的碎片，边缘参差不齐，糊状大便；7型：水样，没有固体碎片)。患者在给药前两周以及纳入研究后的零、二和四周到门诊就诊。
[0079]
从图6可以看出，我们的益生菌产品bc、be相比于市售产品来说，对儿童便秘的改善效果更佳，且相比于be产品，bc产品对儿童便秘的改善效果具有更长久的改善益处，bc产品虽在短期(2周)内对排便的促进效果不如be及市售产品，但在4周后，排便频率相比于其余几组产品发生大幅提高，这再次说明，我们的bc产品，是通过逐渐改善肠道菌群的平衡来
改善肠道微生态平衡，帮助便秘儿童恢复其自然的肠道蠕动排便功能，而不是通过短期的效果实现急速的排便效果，对儿童健康更有利。
[0080]
综上对致龋菌的抑菌效果以及对儿童功能性便秘的改善效果，可以看出我们的c配方组制备成的益生菌产品是能够同时对儿童龋齿及儿童便秘有最佳改善效果的产品。
[0081]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。