一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统及其在酵母中表达蛋白质的方法

一种基于细胞质线性质粒的t7表达系统及其在酵母中表达蛋白质的方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于细胞质线性质粒的t7表达系统，所述t7表达系统包含t7 rna聚合酶、t7转录单元、细胞质线性质粒，该系统可用于酵母中持续、稳定、高效地表达蛋白。


背景技术：

2.t7系统来自于大肠杆菌t7噬菌体，是一套非常强大的转录系统，该系统主要由t7 rna聚合酶和其特异性识别的由t7启动子启动转录的转录单元构成。目前在原核生物中对t7表达系统的应用已经非常成熟，但在真核生物尤其是酿酒酵母中构建能够持续、稳定、高效地表达蛋白的t7表达系统仍然受到限制，这主要是因为真核生物核转录的mrna面临着出核的问题，其mrna具有结构特殊性。
3.真核生物mrna的5
′
端存在帽子结构(7-甲基鸟核苷三磷酸，m7gppp)，3
′
端存在多聚腺苷酸(poly(a))尾巴。5
′
端帽子结构能够被核糖体小亚基识别，促使mrna和核糖体的结合，m7gppp结构能有效地封闭mrna 5
′
末端，以保护mrna免受5
′
核酸外切酶的降解，增强mrna的稳定性，参与mrna由细胞核向细胞质基质转运的过程。3
′
多聚腺苷酸尾巴除了在维持mrna稳定性和翻译起始中发挥一定作用外，也是mrna由细胞核进入细胞质基质所必需的元件，能够大大提高mrna在细胞质基质中的稳定性(参见，非专利文献1)。
4.但是在原核生物细胞中，转录和翻译发生在同一细胞空间内，且转录和翻译过程几乎同步进行，通常并不存在转录后加工的过程。因此，来自于大肠杆菌t7噬菌体的t7表达系统，作为原核宿主来源的表达系统，其转录产物不存在5
′
端帽子和3
′
多聚腺苷酸尾巴结构，在真核细胞中难以由细胞核向细胞质基质转运，进而结合核糖体进行翻译，造成蛋白质合成受到限制。
5.一些rna病毒如脑炎心肌炎病毒(emvc)、猪瘟病毒(csfv)等，其mrna缺乏帽子结构，这些病毒的翻译起始依赖于其5
′
端非翻译区的顺式作用元件——内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，ires)(参见，非专利文献2)，ires能够在一些反式作用因子的辅助下募集真核生物核糖体到mrna分子5
′
非翻译区启动翻译起始。
6.对于真核生物，有研究者在酿酒酵母中构建了基于核基因组的t7表达系统，但由于缺乏5
′
端帽子结构，细胞核内大量的t7 mrna无法进入细胞质，结合核糖体被翻译为蛋白质，故该t7表达系统并未表达出目标蛋白(参见非专利文献3)。
7.gunge等人利用来源于乳酸克鲁维酵母的一对线性高拷贝双链细胞质质粒pgkl1和pgkl2，在酿酒酵母中开发了与宿主复制系统正交的核外复制系统(参见，非专利文献4)。该核外复制系统编码自己的dna聚合酶，并通过与质粒的末端蛋白(tp蛋白)结合来起始细胞质中的pgkl1和pgkl2质粒的复制。由于细胞质中的pgkl1、pgkl2质粒与核内dna的复制方式存在差异，细胞质与细胞核之间存在物理隔离，pgkl1、pgkl2质粒的复制不受到宿主基因组复制系统的影响。
8.现有技术文献：
9.非专利文献1：朱玉贤.现代分子生物学[m].第四版.北京:高等教育出版社,2013:96-101.
[0010]
非专利文献2：卢杰,张珈敏,林美娟,曹旭,胡远扬.rna病毒翻译调控元件——内部核糖体进入位点(ires)[j].中国生物化学与分子生物学报,2007(07):513-518.
[0011]
非专利文献3：benton b m,eng w k,dunn j j,et al.signal-mediated import of bacteriophage t7 rna polymerase into the saccharomyces cerevisiae nucleus and specific transcription of target genes[j].molecular and cellular biology,1990,10(1):353-360.
[0012]
非专利文献4：gunge n,sakaguchi k.intergeneric transfer of deoxyribonucleic acid killer plasmids,pgkl1 and pgkl2,from kluyveromyces lactis into saccharomyces cerevisiae by cell fusion[j].journal of bacteriology,1981,147(1):155.


技术实现要素：

[0013]
发明要解决的问题
[0014]
由上述文献记载可以看出，利用t7表达系统较难实现在真核生物中持续、稳定、高效地表达蛋白。
[0015]
本发明人多年致力于该方面的研究，从促进mrna由细胞核向细胞质基质转运的角度，分别在t7表达系统中引入带有核定位序列的vpu基因和利用病毒加帽酶为t7 rnap转录产物添加5
′
cap，构建两种不同的t7表达系统。前者可以使vpu蛋白定位在细胞核核膜上，改变核膜的通透性，使t7 rnap转录的产物通过渗透扩散进入细胞质，后者通过添加5
′
cap，将mrna高效地从细胞核运输到细胞质。这两种t7表达系统均成功解决了mrna的跨膜运输问题，促进了目标蛋白的翻译合成，高效稳定地表达了目标蛋白。
[0016]
本发明未对mrna的跨膜运输问题继续进行研究，而是着眼于目标基因的核外复制，利用细胞质线性质粒，针对真核生物中的酵母构建了稳定的t7表达系统，实现了持续、稳定、高效地表达蛋白的目的。
[0017]
用于解决问题的方案
[0018]
为解决上述问题，本发明提供了具有如下特征的t7表达系统以及使用该系统在酵母中表达蛋白质的方法。
[0019]
[1]、一种基于细胞质线性质粒的t7表达系统，其特征在于，所述t7表达系统包含t7 rna聚合酶、t7转录单元、细胞质线性质粒，所述t7转录单元由t7启动子、t7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。
[0020]
[2]、根据[1]所述的t7表达系统，其特征在于，所述t7 rna聚合酶的基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有t7 rna聚合酶基因的宿主菌株。
[0021]
[3]、根据[1]所述的t7表达系统，其特征在于，所述t7转录单元及细胞质线性质粒的部分片段用于构建整合型载体，所述细胞质线性质粒的部分片段作为基因整合用线性质粒的同源臂。
[0022]
[4]、根据[1]所述的t7表达系统，其特征在于，将[3]中的含有所述t7转录单元及所述基因整合用线性质粒的同源臂的整合型载体转化到[2]中的所述宿主菌株中，构建细
胞质线性质粒整合有t7转录单元的、基因组上携带有t7 rna聚合酶基因的菌株，由此得到所述t7表达系统。
[0023]
[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的t7表达系统，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述t7 rna聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述t7 rna聚合酶的终止子。
[0024]
[6]、根据[1]～[5]中任一项所述的t7表达系统，其特征在于，用于构建[3]中所述的整合型载体用线性质粒的同源臂为两个，分别来自t7转录单元待插入位置的上游和下游。
[0025]
[7]、根据[1]～[6]中任一项所述的t7表达系统，其特征在于，[3]中的所述整合型载体，用于筛选阳性转化子的标记基因由所述细胞质线性质粒自身启动子启动。
[0026]
[8]、根据[7]中所述的t7表达系统，其特征在于，所述细胞质线性质粒来自酵母。
[0027]
[9]、根据[8]所述的t7表达系统，其特征在于，所述细胞质线性质粒为来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pgkl1和pgkl2。
[0028]
[10]、根据[1]～[9]中任一项所述的t7表达系统，其特征在于，所述t7转录单元在线性质粒中的插入位置为pgkl1质粒的orf2。
[0029]
[11]、一种基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酵母中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含t7 rna聚合酶、t7转录单元、细胞质线性质粒的t7表达系统，其中，所述t7转录单元由t7启动子、t7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。
[0030]
[12]、根据[11]所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0031]
1)合成所述t7 rna聚合酶基因序列，并将其构建到整合型载体中；
[0032]
2)将1)中所述的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有t7 rna聚合酶基因的宿主菌株；
[0033]
3)合成两段所述细胞质线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将所述两个基因整合用同源臂和所述标记基因构建到载体中，所述标记基因位于所述两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含所述t7转录单元的dna片段，回收所述包含目标基因的t7转录单元片段，将其插入带有所述两个基因整合用同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合型载体；
[0034]
4)将3)中所述的整合型载体线性化后转化2)中整合后得到的所述宿主菌株，构建所述基于细胞质线性质粒的t7表达系统；
[0035]
5)使用所述t7表达系统，在所述重组酵母菌株中表达所述目标基因的蛋白。
[0036]
[13]、根据[11]或[12]所述的方法，其特征在于，使用报告基因编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为所述目标基因验证所述表达系统表达目标基因的蛋白的能力。
[0037]
[14]、根据[11]～[13]中任一项所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株含有细胞质线性质粒pgkl1和pgkl2。
[0038]
发明的效果
[0039]
细胞质线性质粒体系是核外复制体系，可以在细胞质中进行自主复制，本发明的基于该细胞质线性质粒的t7表达系统属于稳定的t7表达系统，不会随着细胞的分裂而丢
失，具有该t7表达系统的酵母菌株至少连续转接3次后仍能稳定地表达目标蛋白。与其相对，现有技术中的瞬时t7表达系统会随着细胞分裂而快速丢失，无法实现继代培养中稳定地表达目标蛋白。
[0040]
此外，由于细胞质与细胞核之间的物理隔离，本发明通过细胞质线性质粒进行核外复制具有特殊的优势，与改善跨膜运输而构建的t7表达系统相比，本发明的核外复制体系具有更优异的持续、稳定、高效地表达目标蛋白的效果。
附图说明
[0041]
图1为p-t7 rnap整合型质粒示意图。
[0042]
图2为t7 rnap基因整合到酵母基因组的验证电泳图。其中，a.引物ho-up/ho-down pcr扩增酿酒酵母f102-2基因组(m：1kb dna ladder；1：酿酒酵母f102-2基因组)；b.c.d.引物ho-up/ho-down，ho-up/t7rp-2，ho-down/t7rp-1分别pcr扩增整合p
tef1-t7 rnap转录单元后的酿酒酵母f102-2基因组(m：1kb dna ladder；1～8：整合p
tef1-t7 rnap转录单元后的酿酒酵母f102-2基因组)。
[0043]
图3为puc-t7-nluc整合型质粒示意图。
[0044]
图4为基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酵母中表达荧光素酶的效果图。其中，对照组(control)为f102-2菌株，ynluc1、ynluc2为任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)两个单菌落。
[0045]
图5为基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酵母中表达荧光素酶的稳定性的效果图。其中，对照组(control)为f102-2菌株，ynluc1、ynluc2为任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)两个单菌落。
[0046]
图6为puc-t7-sfgfp整合型质粒示意图。
[0047]
图7为基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酵母中表达绿色荧光蛋白的效果图。其中，对照组(control)为f102-2菌株，ysf1、ysf2为任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)两个单菌落。
[0048]
图8为基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酵母中表达绿色荧光蛋白的稳定性的效果图。其中，对照组(control)为f102-2菌株，ysf1、ysf2为任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)的两个单菌落。
[0049]
图9为不同t7表达系统在酿酒酵母中的荧光素酶表达量的差异图。其中，对照组(control)为f102-2菌株，ynluc1、ynluc2为任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)的两个单菌落，yvpu-nluc为by4741(ho::nls-t7rnap,ps-vpu/nluc)，yf-np868r为by4741(ho::t7rnap-nls,ps-np-intn-nano)，yf-np868r为by4741(ho::intc-t7rnap-nls，ps-np-intn-nano)。
[0050]
图10至图12分别显示了seq id no:1、seq id no:6和seq id no:9的序列。
具体实施方式
[0051]
以下对本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统及其对于蛋白的稳定表达进行详细介绍。
[0052]
本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统，包含t7 rna聚合酶、t7转录单元、细
胞质线性质粒，所述t7转录单元包含t7启动子、t7终止子和目标基因。
[0053]
本发明的细胞质线性质粒来自真核生物细胞。优选地，所述细胞质线性质粒来自酵母。更优选地，来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pgkl1和pgkl2。最优选地，来自酿酒酵母菌株f102-2(购自atcc200585)，其含有pgkl1和pgkl2。
[0054]
本发明的t7 rna聚合酶基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有t7 rna聚合酶基因的宿主，且经所述宿主系统转录、翻译，合成所需的蛋白。
[0055]
本发明中的“整合型载体”是指在目标宿主中不能自主复制，其本身或将其线性化后的片段能整合到宿主基因组或者其它宿主中存在的自主复制遗传物质上(如质粒、细胞器基因组等)的质粒载体，例如，线性化后的片段能够整合到细胞质线性质粒上的质粒载体。
[0056]
本发明中的“同源臂”是指整合型载体上与细胞质线性质粒同源的片段，来自基因整合位点两端，用于在酵母中与细胞质线性质粒相应片段发生体内基因重组，达到替换基因片段的目的。所述同源臂长度不受限制，优选地，可为20～2000bp，更优选地，可为100～1500bp，最优选地，可为500～1000bp。优选地，所述同源臂选自pgkl1和pgkl2质粒，更优选地，可选自pgkl1。
[0057]
本发明中选取真核生物的启动子作为表达所述t7 rna聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述t7 rna聚合酶的终止子。
[0058]
本发明中使用的筛选阳性转化子的标记基因不受限制，可选择酵母相应的缺陷型基因，优选地，可使用亮氨酸筛选标记leu2基因作为标记基因。
[0059]
本发明中用于筛选阳性转化子的标记基因由pgkl1和/或pgkl2质粒自身启动子启动，所用启动子不受限制，可选择pgkl1和/或pgkl2质粒各个orf的启动子，优选地，可使用pgkl1质粒orf2的ucs启动子。此处，orf为开放阅读框的缩写(open reading frame)，ucs是上游保守序列的缩写(upstream conserved sequence)。
[0060]
优选地，本发明中t7转录单元在线性质粒中的插入位置为pgkl1质粒orf2。
[0061]
《使用基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中表达蛋白质的方法》
[0062]
需要说明的是，本发明中涉及的常规的质粒和载体的构建、蛋白的表达方法以及细胞转化等方法，可参照本领域公知的分子生物学及遗传学方法，例如，可参照“本领域的常规生物学方法”、“最新分子生物学实验方法汇编(current protocols in molecular biology，wiley出版)”、“分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
[0063]
本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中表达蛋白质的方法主要包括以下步骤：
[0064]
1)合成t7 rna聚合酶的基因序列，并将其构建到整合型载体中；
[0065]
2)将1)中的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有t7 rna聚合酶基因的宿主菌株；
[0066]
3)合成两段线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将两个同源臂和标记基因构建到载体中，标记基因位于两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含t7转录单元的dna片段，回收包含目标基因的t7转录单元片段，将其插入带有同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合
型载体；
[0067]
4)将3)中的整合型载体线性化后转化2)中的整合后得到的宿主菌株，构建基于细胞质线性质粒的t7表达系统；
[0068]
5)使用t7表达系统，在重组酵母菌株中表达目标基因的蛋白。
[0069]
本发明通过在细胞质线性质粒上引入t7转录单元，将线性质粒核外复制的特点与t7系统强大的转录功能耦合，构建了稳定的t7表达系统。
[0070]
本领域常用的报告基因均可作为目标基因用于本发明。优选地，使用编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白(sfgfp)的基因作为目标基因，验证所述表达系统表达目标基因的蛋白的能力。
[0071]
《基于细胞质线性质粒的t7表达系统的蛋白表达稳定性的检测》
[0072]
在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母使用所述t7表达系统，并对目标基因重组蛋白进行表达和检测。
[0073]
本发明通过报告基因在重组酿酒酵母菌株中的继代培养表达来检测基于细胞质线性质粒的t7表达系统表达重组蛋白的稳定性，报告基因可使用荧光素酶(nluc)、绿色荧光蛋白(sfgfp)等。通过荧光强度的对比来表征目标基因的蛋白表达，通过连续转接具有基于细胞质线性质粒的t7表达系统的目标菌株，测定其目标基因蛋白表达的稳定性，表征目标酵母菌株中t7系统的稳定性。
[0074]
《实验材料》
[0075]
载体：pmri 31(genbank:kj502281.1)；puc57购自invitrogen公司。
[0076]
菌株：酿酒酵母菌株f102-2，购自atcc200585。
[0077]
培养基：ypd培养基和sd-leu培养基，购自北京索莱宝科技有限公司。
[0078]
试剂：10
×
pbs缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；荧光素酶活性测定试剂盒，购自promega公司；sfi i核酸内切酶，购自new england biolabs(neb)公司；无缝克隆试剂盒(infusion)，购自中美泰和生物技术(北京)有限公司；山梨醇，半乳糖，氨苄青霉素，卡那霉素，遗传霉素g418，均购自北京索莱宝科技有限公司；1kb dna ladder购自北京全式金生物技术有限公司。
[0079]
以下结合实施例进一步解释本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于描述本发明，本发明不限于此。
[0080]
《实施例》基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中的构建和表达
[0081]
1.带有t7 rnap的整合型质粒载体的构建
[0082]
基于pmri 31质粒载体，构建带有t7 rnap的整合型质粒载体p-t7 rnap；p-t7 rnap的完整dna序列如seq id no:1所示，其结构如图1所示，按以下顺序其主要包括：
[0083]
(1)酿酒酵母ho基因的5
′
基因组侧翼区；
[0084]
(2)pbr322质粒复制起始位点(pbr322 ori)；
[0085]
(3)卡那霉素/遗传霉素抗性标记基因(kanmx)，卡那霉素用于大肠杆菌菌株筛选，遗传霉素用于酿酒酵母菌株筛选；
[0086]
(4)细胞色素c1(cyc1)终止子(tcyc1)；
[0087]
(5)t7 rna聚合酶(t7 rnap)基因；
[0088]
(6)tef1启动子(ptef1)；
[0089]
(7)酿酒酵母ho基因的3
′
基因组侧翼区。
[0090]
2.基因组插入t7rnap的酿酒酵母基因工程菌的构建
[0091]
将质粒p-t7rnap使用sfi i核酸内切酶线性化，回收线性化dna片段，将线性片段电转入酿酒酵母菌株f102-2，具体操作参照以下酵母感受态制备和酵母电转化步骤：
[0092]
酵母感受态细胞制备：
[0093]
(1)从平板上挑取酵母单菌落接种到5ml的ypd培养基中，30℃培养12h。
[0094]
(2)以千分之一以接种率吸取培养液40μl至40ml ypd培养基中，30℃过夜培养，使菌体浓度达到od
600
≈2。
[0095]
(3)将菌液转移到50ml无菌离心管中，4℃下3000
×
g离心5min，去上清。
[0096]
(4)使用30ml冰上预冷的灭菌水重悬细胞，4℃下3000
×
g离心5min，去上清。
[0097]
(5)使用20ml冰上预冷的1m的无菌山梨醇洗涤细胞沉淀，4℃下3000
×
g离心5min，去上清。
[0098]
(6)使用200～500μl冰上预冷的1m的无菌山梨醇重悬细胞，并转移至预冷的无菌1.5ml离心管中，酵母感受态细胞制备完成。每次电转制备新鲜的感受态细胞以保证足够的转化率。
[0099]
酵母电转化：
[0100]
(1)取2～5μl线性化dna片段，加入到预冷的1.5ml离心管中；
[0101]
(2)向上述加有dna的离心管中加入40μl的感受态细胞，用枪轻轻吹打混匀后转移到预冷的2mm电转杯中，冰上静置5min；
[0102]
(3)将电转杯外围的水用吸水纸擦干净，于750v/mm的电击强度下进行电击；
[0103]
(4)向电击后的电转杯中加入1ml的ypd培养基，轻轻悬浮细胞，转移到1.5ml无菌离心管中，30℃静置复苏2h；
[0104]
(5)复苏后的细胞4000rpm离心2min去上清，用灭菌水清洗两遍，再加100～200μl灭菌水轻轻吹打混匀后涂布到相应的琼脂平板，30℃培养2～3天。
[0105]
通过遗传霉素g418抗性选择得到基因组整合了t7 rnap基因的酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7 rnap)。为确保得到阳性转化子，提取转化后酿酒酵母菌株和空白菌株(f102-2)的基因组，并使用特定三对引物ho-up/ho-down、ho-up/t7rp-1、ho-down/t7rp-2进行pcr验证t7 rnap基因是否正确插入到酿酒酵母基因组的ho区域上，验证结果如图2所示。
[0106]
ho-up、ho-down、t7rp-1、t 7rp-2的核苷酸序列如下：
[0107]
ho-up：gtgccggtaacgctttttgtatcttg(seq id no:2)
[0108]
ho-down：gagctcataattcaagcaagttgcgg(seq id no:3)
[0109]
t7rp-1：gattgagcgtgaagaactcccga(seq id no:4)
[0110]
t7rp-2：gagaagtgctggatgccagagcaa(seq id no:5)
[0111]
使用引物ho-up/ho-down进行pcr扩增时，对照组扩增出3402bp片段，阳性转化子扩增出7601bp的片段；使用ho-up/t7rp-2、ho-down/t7rp-1两对引物分别进行pcr扩增时，阳性转化子分别扩增出3264bp、4916bp片段，而对照菌株无此长度扩增片段，说明所述t7 rnap基因成功插入酿酒酵母f102-2染色体上。
[0112]
3.带有目标基因荧光素酶基因的质粒的构建
[0113]
基于puc-57质粒，构建puc-t7-nluc质粒，puc-t7-nluc质粒的完整dna序列如seq id no:6所示，结构参见图3，该质粒按以下顺序主要包括：
[0114]
(1)同源臂1(hr1)，pgkl1质粒orf2的5
′
侧翼区，包含pgkl1质粒orf2启动子；
[0115]
(2)亮氨酸筛选标记基因leu2，包括leu2基因(leu2)和leu2终止子(tleu)；
[0116]
(3)t7启动子启动的荧光素酶基因转录单元，包括t7启动子(pt7)、核糖体内部结合位点(ires)、荧光素酶基因(nanoluc)、细胞色素c1终止子(tcyc1)、t7终止子(tt7)，ires用来帮助t7 rnap转录的mrna与核糖体结合进行翻译；
[0117]
(4)同源臂2(hr2)，pgkl1质粒orf2的3
′
侧翼区，包含pgkl1质粒orf2终止区域；
[0118]
(5)puc质粒复制起始位点(ori)；
[0119]
(6)氨苄青霉素抗性标记基因(ampr)。
[0120]
4.基于细胞质线性质粒的t7表达系统表达荧光素酶的酿酒酵母基因工程菌的构建
[0121]
使用引物hr1、hr2对puc-t7-nluc质粒进行pcr扩增，获得带有同源臂、标记基因、t7启动子启动的荧光素酶转录单元的线性片段，回收线性化dna片段，将该线性片段电转入酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap)，获得重组酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)。具体操作参照上述2.中描述的酵母感受态制备和酵母电转化步骤。
[0122]
引物hr1、hr2的核苷酸序列如下：
[0123]
hr1：acttataataattttgaagaaag(seq id no:7)
[0124]
hr2：acttctaaacaaagtaatatag(seq id no:8)
[0125]
5.荧光素酶(nluc)在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
[0126]
本实验中使用前述制备的酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)。
[0127]
将上述菌株从固体平板上挑取单菌落，接入5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h后，离心收集菌体，用过滤除菌的pbs缓冲液洗涤2～3次，重悬于无菌pbs，同时样品浓度应稀释至od
600
＝0.3～0.8。
[0128]
荧光素酶发光强度检测方法：
[0129]
(1)将200μl样品转移至96孔透明板中，使用多功能酶标仪测定od
600
；
[0130]
(2)将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并与酵母细胞pbs重悬液以1:1混合，转移200μl样品至白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的luminescence模式测定生物发光强度；
[0131]
(3)用生物发光强度除以od
600
，获得平均发光强度，以此排除菌体之间的差异。
[0132]
图4为利用基于细胞质线性质粒的t7表达系统表达荧光素酶的效果图，对照组(control)为f102-2菌株，任意选取f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)的两个单菌落ynluc1、ynluc2进行培养和测定。从图4中可以看出，基于细胞质线性质粒的t7表达系统其平均发光强度远远高于对照菌株，说明基于细胞质线性质粒，t7系统成功实现了荧光素酶的表达，核外复制体系与t7系统成功耦合，实现了酿酒酵母中t7表达系统的构建。
[0133]
6.基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中表达荧光素酶的稳定性检测
[0134]
挑取f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)任意单菌落ynluc1、ynluc2，接入5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h后，以1：10000的比例转接至新的5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h。每48h进行一次转接，并测定菌株的平均发光强度，转接持续3次，结果如图5所示。
[0135]
由图5可以看出，具有基于细胞质线性质粒的t7表达系统的酿酒酵母在3次转接中均能表达荧光素酶。3次转接中菌株ynluc1平均发光强度的变化幅度为9.6％～11.5％，ynluc2平均发光强度的变化幅度为2.0％～6.3％，基本维持稳定，说明该t7表达系统具有良好的表达目标蛋白的稳定性。
[0136]
7.带有目标基因绿色荧光蛋白(sfgfp)基因的质粒的构建
[0137]
基于puc-57质粒，构建puc-t7-sfgfp质粒，puc-t7-sfgfp质粒的完整dna序列如seq id no:9所示，结构参见图6，该质粒按以下顺序主要包括：
[0138]
(1)同源臂1(hr1)，pgkl1质粒orf2的5
′
侧翼区，包含pgkl1质粒orf2启动子；
[0139]
(2)亮氨酸筛选标记基因leu2，包括leu2基因(leu2)和leu2终止子(tleu)；
[0140]
(3)t7启动子启动的绿色荧光蛋白(sfgfp)基因转录单元，包括t7启动子(pt7)、核糖体内部结合位点(ires)、绿色荧光蛋白基因(sfgfp)、细胞色素c1终止子(tcyc1)、t7终止子(tt7)，ires用来帮助t7 rnap转录的mrna与核糖体结合进行翻译；
[0141]
(4)同源臂2(hr2)，pgkl1质粒orf2的3
′
侧翼区，包含pgkl1质粒orf2终止区域。
[0142]
8.基于细胞质线性质粒的t7表达系统表达绿色荧光蛋白(sfgfp)的酿酒酵母基因工程菌的构建
[0143]
使用引物hr1、hr2对puc-t7-sfgfp质粒进行pcr扩增，获得带有同源臂、标记基因、t7启动子启动的绿色荧光蛋白转录单元的线性片段，回收线性化dna片段，将该线性片段电转入酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap)，获得重组酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)。具体操作参照上述2.中描述的酵母感受态制备和酵母电转化步骤。引物hr1、hr2的核苷酸序列参照上述4.中的记载。
[0144]
9.绿色荧光蛋白(sfgfp)在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
[0145]
本实验中使用前述制备的酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)。
[0146]
将上述菌株从固体平板上挑取单菌落，接入5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h后，离心收集菌体，用过滤除菌的pbs缓冲液洗涤2～3次，重悬于无菌pbs。
[0147]
sfgfp荧光强度检测方法：
[0148]
(1)将200μl样品转移至96孔透明底黑板中，使用多功能酶标仪测定od
600
；
[0149]
(2)然后测定荧光强度，激发波长460nm，发射波长510nm；
[0150]
(3)荧光强度扣除pbs本底荧光强度后，除以od
600
，获得平均荧光强度，以此排除菌体之间的差异。
[0151]
图7为利用基于细胞质线性质粒的t7表达系统表达绿色荧光蛋白(sfgfp)的效果图，对照组(control)为f102-2菌株，任意选取的f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)两个单菌落ysf1、ysf2进行培养和测定。从图7中可以看出，基于细胞质线性质粒的t7表达系统其平均发光强度显著高于对照菌株，说明基于细胞质线性质粒核外复制体系，t7系统成功实现了sfgfp的表达，核外复制体系与t7系统成功耦合，实现了酿酒酵母中t7表
达系统的构建。
[0152]
10.基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中表达绿色荧光蛋白(sfgfp)的稳定性检测
[0153]
挑取f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-sfgfp)任意单菌落ysf1、ysf2，接入5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h后，以1：10000的比例转接至新的5ml的sd-leu液体培养基中，30℃培养48h。每48h进行一次转接，并测定菌株的平均荧光强度，转接持续3次，结果如图8所示。
[0154]
由图8可以看出，在3次转接中，具有基于细胞质线性质粒的t7表达系统的酿酒酵母在3次转接中均能表达绿色荧光蛋白。3次转接中菌株ysf1平均荧光强度的变化幅度为13.3％～22.9％，ysf2平均荧光强度的变化幅度为10.4％～24.2％，基本维持稳定，说明该t7表达系统具有良好的表达目标蛋白的稳定性。
[0155]
《比较例》不同t7表达系统在酿酒酵母中的荧光素酶表达量的差异
[0156]
将本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统构建的酿酒酵母菌株f102-2(ho::p
tef1-t7rnap,p1*leu-t7-nluc)(ynluc1、ynluc2)、公开号为cn111534533a的基于hiv-1vpu蛋白的t7表达系统构建的酿酒酵母菌株by4741(ho::nls-t7rnap,ps-vpu/nluc)(yvpu-nluc)、公开号为cn114181957a的基于病毒加帽酶的t7表达系统构建的酿酒酵母菌株by4741(ho::t7rnap-nls,ps-np-intn-nano)(yf-np868r)、by4741(ho::intc-t7rnap-nls，ps-np-intn-nano)(yf-np868r)，按照5.中的方法，测定菌株的平均发光强度，并进行比较，结果如图9所示。
[0157]
由图9可以看出，ynluc1和ynluc2菌株的发光强度远高于基于hiv-1vpu蛋白的t7表达系统构建的酿酒酵母菌株yvpu-nluc菌株、和基于病毒加帽酶的t7表达系统构建的酿酒酵母菌株yf-np868r、yf-np868r菌株，对比可知，本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统在酿酒酵母中表达荧光素酶的效果更优异。
[0158]
分析原因，本发明的基于细胞质线性质粒的t7表达系统将t7启动子启动的目标基因转录单元整合至细胞质线性质粒，细胞质线性质粒的转录在细胞核外进行，能够规避t7rnap转录产物由细胞核向细胞质基质转运的问题，t7转录产物能够直接在细胞质中进行下一步的翻译合成报告基因的蛋白，因此蛋白表达效率更高。
[0159]
产业上的可利用性
[0160]
本发明开发了一种基于线性质粒进行核外复制用于酿酒酵母生产蛋白质的t7表达系统，其通过将t7 rna聚合酶整合到宿主基因组，基于线性质粒进行核外复制、利用t7系统转录目标基因，在细胞质中完成目标基因的复制、转录、翻译，实现了在酿酒酵母中持续、稳定、高效地表达重组蛋白的目的。