一种芋螺肽的制备方法与流程

1.本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备芋螺肽的方法。
技术背景
2.芋螺肽(conotoxin ctx)，又叫芋螺毒素肽。是一类小分子多肽，属神经毒素。芋螺肽是腹足纲芋螺科的肉食性海洋软体动物所分泌的毒液中的一种成分，是芋螺对猎物进行麻痹捕食和防御外敌的武器，每种芋螺毒液中可能含50～200种不等的小分子多肽。
3.芋螺肽为信号肽介导表达的小分子多肽，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，大多由12～46个氨基酸残基组成，且含有2对或3对二硫键，其高密度的二硫键结构使得其稳定性大大提高，从而使得芋螺肽在各种理化环境中仍能很好的保持活性。
4.芋螺肽，英文名为mu-conotoxin，具体肽序如下：pyr
1-gly
2-cys
3-cys
4-asn
5-gly
6-pro
7-lys
8-gly
9-cys
10-ser
11-ser
12-lys
13-trp
14-cys
15-arg
16-asp
17-his
18-ala
19-arg
20-cys
21-cys
22-conh2,cyclic(3
→
15),(4
→
21),(10
→
22)tris(disulfide)
5.目前芋螺肽制备方式主要有三种，分别是生物组织提取法、化学合成法、基因工程制备。其中，生物组织提取产量受限，从芋螺体内直接分离提取芋螺毒素的工艺复杂，提取困难，成本高；基因工程制备工艺并不成熟，两者均难以实现芋螺毒素的产业化，并不能满足市场的需求。因此，需要通过固相多肽合成法大量合成，降低成本，以此满足科研用途及日益增长的市场需求。
6.专利cn110894225a公开了一种芋螺肽的规模化制备方法，该方法按照芋螺肽主链c端至n端的氨基酸顺序依次偶联肽树脂，裂解后采用空气氧化法合成三对二硫键，最后纯化制备得到产品。由于芋螺肽的序列较长且序列结构特殊，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而线性肽中产生较多与目标产品性质极为接近的杂质。如d-his
18
消旋杂质、gly重排杂质。这些杂质与目标线性肽的理化性质相近，极大增加了二硫键正确配对的难度，产生大量芋螺肽的相关杂质，产品的分离纯化难度，导致产品收率大大降低。因此，迫切需要一种杂质含量低、纯度和收率高，合成成本低的芋螺肽的合成方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术在合成过程中存在副反应多，纯化难，收率低，纯度低的问题，本发明提供了一种芋螺肽的制备方法，该方法如下：
8.一种芋螺肽的制备方法：通过固相多肽合成法制备芋螺肽树脂，芋螺肽树脂酸解得到芋螺肽线性肽，线性肽环化获得芋螺肽粗品，芋螺肽粗品纯化得到芋螺肽精品；其中固相多肽合成法制备芋螺肽树脂的方法为：在fmoc-cys(r3)-resin上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得芋螺肽线性肽树脂x-pyr-gly-cys(r1)-cys(r2)-y-pro-lys-gly-cys(r3)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(r1)-arg(pbf)-z-arg(pbf)-cys(r2)-cys(r3)-resin，其中，
9.x为氨基保护基团或h；
10.y为asn(trt)-gly或asn(trt)-(hmb)gly或asn(trt)-(dmb)gly；
11.z为asp(otbu)-his(trt)-ala或asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala或asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala；
12.r1、r2、r3选自acm、trt、tbu、mebzl、meobzl、bzl、tacm、mmt。
13.asn5、gly6若按照顺序偶联一个一个接在氨基酸树脂上，极易发生重排形成重排杂质，从而导致副反应的发生，而本发明将asn5、gly6形成二肽片段，或hmb/dmb保护的gly二肽片段，能最大程度地抑制重排杂质的产生。
14.his
18
用常规的单个氨基酸接入树脂容易发生消旋副反应，产生d-his
18
消旋杂质。将asp
17-his
18-ala
19
作为一个整体三肽片段接入树脂时，可以特异地抑制消旋反应的发生，从而很好的避免d-his
18
消旋杂质的产生。
15.在一些实施例中，接入y片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，片段为：fmoc-asn(trt)-gly或fmoc-asn(trt)-(hmb)gly或asn(trt)-(dmb)gly；或用2次偶联依次接入，第一次为fmoc-(hmb)gly-oh或fmoc-(dmb)gly-oh或fmoc-gly-oh，第二次为fmoc-asn(trt)-oh。
16.在一些实施例中，接入z片段的步骤如下：用1次偶联直接接入，片段为：fmoc-asp(otbu)-his(trt)-ala或fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala或fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala。
17.在一些实施例中，接入y、z以外的其它保护氨基酸分别为：fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、h-pyr-oh。
18.在一些实施例中，接入y、z以外的其它保护氨基酸分别为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh。
19.在一些实施例中，接入y、z以外的其它保护氨基酸分别为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh。
20.优选地，所述芋螺肽线性肽环化时采用的方法选自：空气氧化法、dmso氧化法、血晶素氧化法。
21.优选地，芋螺肽树脂酸解时采用的试剂选自：tfa、dodt和w的混合溶液，w选自tis、mpr、h2o；其中，tfa占裂解液的体积百分比为80％-90％，且dodt体积百分比为1％-10％。
22.在一些实施例中，所述的载体树脂为rink amide am resin。
23.由于芋螺肽链较长且序列结构特殊，其在制备过程中若未选择合适的反应条件容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化的难度、产品质量等产生较大的影响。本发明
通过将芋螺肽在环化之前，采用asn5、gly6形成的二肽片段，或hmb/dmb保护的gly二肽片段，最大程度地抑制重排杂质的产生；采用asp
17-his
18-ala
19
形成的三肽片段接入树脂，特异地抑制消旋反应的发生，从而很好的避免d-his
18
消旋杂质的产生。本发明方法所制备的芋螺肽精品，纯度大于99.5％，纯化收率大于76％，单一杂质小于0.2％。本发明以较简便的工艺步骤同时实现了提高粗肽纯度、控制杂质含量和增加总收率的目标，与现有技术相比，反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场应用前景。
具体实施方式
24.下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。在本发明具体实施方式中，所有偶联有保护基的氨基酸均可通过市售获得。
25.实施例1
26.boc-pyr-gly-cys(acm)-cys(acm)-asn(trt)-gly-pro-lys-gly-cys(acm)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(acm)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(acm)-cys(acm)-rink amide am resin的制备
27.1.1树脂的溶胀
28.称取rink amide am resin树脂205.8g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
29.1.2脱fmoc
30.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
31.1.3投料反应
32.称取140.50g fmoc-cys(acm)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
33.1.4反应完毕洗涤树脂
34.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
35.1.5偶联其余氨基酸
36.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-gly-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-gly-pro-lys(boc)-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin。
37.1.6收缩晾干树脂
38.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂670g。
39.实施例2
40.h-pyr-gly-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin的制备
41.1.1树脂的溶胀
42.称取rink amide am resin树脂202.8g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
43.1.2脱fmoc
44.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
45.1.3投料反应
46.称取140.80g fmoc-cys(trt)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
47.1.4反应完毕洗涤树脂
48.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
49.1.5偶联其余氨基酸
50.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(hmb)gly-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、h-pyr-oh，得到h-pyr-gly-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-gly-pro-lys(boc)-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin。
51.1.6收缩晾干树脂
52.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂680g。
53.实施例3
54.boc-pyr-gly-cys(tbu)-cys(tbu)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(tbu)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin的制备
55.1.1树脂的溶胀
56.称取rink amide am resin树脂200.8g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂
加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
57.1.2脱fmoc
58.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
59.1.3投料反应
60.称取142.80g fmoc-cys(tbu)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
61.1.4反应完毕洗涤树脂
62.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
63.1.5偶联其余氨基酸
64.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(dmb)gly-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(tbu)-cys(tbu)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(tbu)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin。
65.1.6收缩晾干树脂
66.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂675g。
67.实施例4
68.boc-pyr-gly-cys(mebzl)-cys(tbu)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(mebzl)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin的制备
69.1.1树脂的溶胀
70.称取rink amide am resin树脂201.8g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
71.1.2脱fmoc
72.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
73.1.3投料反应
74.称取153.50g fmoc-cys(tbu)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
75.1.4反应完毕洗涤树脂
76.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
77.1.5偶联其余氨基酸
78.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(mebzl)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(hmb)gly-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-cys(mebzl)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(mebzl)-cys(tbu)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(mebzl)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin。
79.1.6收缩晾干树脂
80.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂682g。
81.实施例5
82.h-pyr-gly-cys(trt)-cys(tbu)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin的制备
83.1.1树脂的溶胀
84.称取rink amide am resin树脂203.2g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
85.1.2脱fmoc
86.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
87.1.3投料反应
88.称取150.70g fmoc-cys(tbu)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
89.1.4反应完毕洗涤树脂
90.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
91.1.5偶联其余氨基酸
92.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(dmb)gly-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、h-pyr-oh，得到h-pyr-gly-cys
(hmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(trt)-rink amide am resin的制备
111.1.1树脂的溶胀
112.称取rink amide am resin树脂202.9g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
113.1.2脱fmoc
114.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
115.1.3投料反应
116.称取151.20g fmoc-cys(trt)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
117.1.4反应完毕洗涤树脂
118.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
119.1.5偶联其余氨基酸
120.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(hmb)gly-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(acm)-cys(tbu)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(acm)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(trt)-rink amide am resin。
121.1.6收缩晾干树脂
122.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂686g。
123.实施例8
124.boc-pyr-gly-cys(acm)-cys(trt)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(acm)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin的制备
125.1.1树脂的溶胀
126.称取rink amide am resin树脂205.5g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
127.1.2脱fmoc
128.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
129.1.3投料反应
130.称取152.20g fmoc-cys(trt)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
131.1.4反应完毕洗涤树脂
132.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
133.1.5偶联其余氨基酸
134.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(trt)
‑‑
oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(dmb)gly-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(acm)-cys(trt)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(acm)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(hmb)ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin。
135.1.6收缩晾干树脂
136.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂685g。
137.实施例9
138.boc-pyr-gly-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin的制备
139.1.1树脂的溶胀
140.称取rink amide am resin树脂206.5g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
141.1.2脱fmoc
142.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
143.1.3投料反应
144.称取151.60g fmoc-cys(trt)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
145.1.4反应完毕洗涤树脂
146.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
147.1.5偶联其余氨基酸
148.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(trt)
‑‑
oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、
fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(dmb)gly-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-(dmb)gly-pro-lys-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(trt)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(trt)-cys(trt)-rink amide am resin。
149.1.6收缩晾干树脂
150.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂688g。
151.实施例10
152.boc-pyr-gly-cys(tbu)-cys(tbu)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(tbu)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin的制备
153.1.1树脂的溶胀
154.称取rink amide am resin树脂207.1g(树脂初始替代度为0.50mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入dmf(1.4l)溶胀30min，溶胀结束后分别用dmf洗涤树脂2次,1.4l/次/min。
155.1.2脱fmoc
156.加入去保护液(20％哌啶/dmf)去保护，去保护两次，去保护时间10min 10min，每次去保护液1.4l，用dmf洗涤6次，1.4l/次/min，茚三酮检测呈k 。
157.1.3投料反应
158.称取151.36g fmoc-cys(tbu)-oh、33.50g hobt，溶于dmf(13l)中，控制温度-5℃，加入31.70g dic，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈k-，偶联完全。
159.1.4反应完毕洗涤树脂
160.加入dmf 1.4l，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干1min。反复用1.4l dmf洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
161.1.5偶联其余氨基酸
162.重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺肽肽序依次偶联fmoc-cys(tbu)
‑‑
oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-(hmb)gly-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh，得到boc-pyr-gly-cys(tbu)-cys(tbu)-asn(trt)-(hmb)gly-pro-lys-gly-cys(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(tbu)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-(dmb)ala-arg(pbf)-cys(tbu)-cys(tbu)-rink amide am resin。
163.1.6收缩晾干树脂
164.将1.5制得的树脂用甲醇(1.4l)洗涤一次，再用dcm(1.4l)洗涤2次，最后用甲醇(1.4l)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺肽全保护肽树脂683g。
165.实施例11芋螺肽的制备
166.1.1肽树脂裂解
167.按照裂解体系(tfa:tis:mpr:h2o:dodt＝85:2:2:1:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例2制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
168.1.2线性芋螺肽环化
169.向纯化水(180l)中加入磷酸二氢钠二水合物(3.1kg，0.1mol/l)、盐酸胍(34.6g，0.002mol/l)搅拌溶解澄清，将1.1制得的线性肽用1％的dmso(1.2l)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节ph为6.0，氧化24h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.3g，合成收率为35％，粗肽纯度68.65％。
170.1.3芋螺肽精肽的制备
171.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为87.3g，纯化收率78.6％，纯度99.7％，单一杂质小于0.18％。
172.实施例12芋螺肽的制备
173.1.1肽树脂裂解
174.按照裂解体系(tfa:tis:dodt＝85:5:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例2制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
175.1.2线性芋螺肽环化
176.向纯化水(180l)中加入磷酸二氢钾(2.6kg，0.1mol/l)、盐酸胍(34.9g，0.002mol/l)搅拌溶解澄清，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节ph为7.9，通入空气氧化24h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为95.3g，合成收率为38％，粗肽纯度69.65％。
177.1.3芋螺肽精肽的制备
178.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为87.3g，纯化收率76.7％，纯度99.6％，单一杂质小于0.16％。
179.实施例13芋螺肽的制备
180.1.1肽树脂裂解
181.按照裂解体系(tfa:tis:dodt＝85:5:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例3制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固
体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
182.1.2线性芋螺肽环化
183.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.3g，合成收率为37％，粗肽纯度65.55％。
184.1.3芋螺肽精肽的制备
185.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为85.7g，纯化收率77.2％，纯度99.7％，单一杂质小于0.20％。
186.实施例14芋螺肽的制备
187.1.1肽树脂裂解
188.按照裂解体系(tfa:mpr:dodt＝88:9:3)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例4制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
189.1.2线性芋螺肽环化
190.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.3g，合成收率为37％，粗肽纯度65.55％。
191.1.3芋螺肽精肽的制备
192.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为89.7g，纯化收率76.5％，纯度99.6％，单一杂质小于0.10％。
193.实施例15芋螺肽的制备
194.1.1肽树脂裂解
195.按照裂解体系(tfa:tis:mpr:h2o:dodt＝85:2:2:1:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例5制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
196.1.2线性芋螺肽环化
197.向纯化水(180l)中加入磷酸二氢钠二水合物(3.1kg，0.1mol/l)、盐酸胍(34.6g，0.002mol/l)搅拌溶解澄清，将1.1制得的线性肽用1％的dmso(1.2l)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节ph为6.0，氧化24h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标
定含量为96.3g，合成收率为35％，粗肽纯度68.65％。
198.1.3芋螺肽精肽的制备
199.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为85.3g，纯化收率76.6％，纯度99.8％，单一杂质小于0.14％。
200.实施例16芋螺肽的制备
201.1.1肽树脂裂解
202.按照裂解体系(tfa:mpr:dodt＝88:9:3)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例6制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
203.1.2线性芋螺肽环化
204.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.3g，合成收率为37％，粗肽纯度65.55％。
205.1.3芋螺肽精肽的制备
206.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为86.7g，纯化收率76.7％，纯度99.7％，单一杂质小于0.10％
207.实施例17芋螺肽的制备
208.1.1肽树脂裂解
209.按照裂解体系(tfa:tis:dodt＝85:5:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例7制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
210.1.2线性芋螺肽环化
211.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.3g，合成收率为37％，粗肽纯度65.55％。
212.1.3芋螺肽精肽的制备
213.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所
需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为80.7g，纯化收率76.3％，纯度99.6％，单一杂质小于0.12％。
214.实施例18芋螺肽的制备
215.1.1肽树脂裂解
216.按照裂解体系(tfa:tis:mpr:h2o:edt＝90:3:3:3:1)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例8制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
217.1.2线性芋螺肽环化
218.向纯化水(180l)中加入磷酸二氢钠二水合物(3.1kg，0.1mol/l)、盐酸胍(34.6g，0.002mol/l)搅拌溶解澄清，将1.1制得的线性肽用1％的dmso(1.2l)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节ph为6.0，氧化24h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为96.2g，合成收率为35％，粗肽纯度63.65％。
219.1.3芋螺肽精肽的制备
220.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为87.2g，纯化收率78.2％，纯度99.5％，单一杂质小于0.12％。
221.实施例19芋螺肽的制备
222.1.1肽树脂裂解
223.按照裂解体系(tfa:tis:dodt＝85:5:10)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实施例9制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
224.1.2线性芋螺肽环化
225.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为93.3g，合成收率为36％，粗肽纯度65.58％。
226.1.3芋螺肽精肽的制备
227.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为84.6g，纯化收率76.3％，纯度99.5％，单一杂质小于0.14％。
228.实施例20芋螺肽的制备
229.1.1肽树脂裂解
230.按照裂解体系(tfa:mpr:dodt＝88:9:3)配置好裂解液6l，控制温度为-5℃，将实
施例10制得的芋螺肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用tfa洗涤两次，0.5l/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(6.5l)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8l/次，得到线性芋螺肽。
231.1.2线性芋螺肽环化
232.向纯化水(180.74l)中加入tris(2.3kg，0.1mol/l)、diea(4.71g，0.002mol/l)搅拌溶解，将1.1制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(54.6g)，用0.8m的盐酸调节ph为5.0，氧化1h，得到芋螺肽粗肽，没有固体析出，hplc标定含量为95.9g，合成收率为38％，粗肽纯度66.55％。
233.1.3芋螺肽精肽的制备
234.将1.2制得的芋螺肽粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/l，滤液经纳微c18柱(填料为unisil 10-100 c18的色谱柱)纯化，流动相：a为0.05％醋酸水溶液；b为乙腈；梯度为：0-60min，b％为2％-12％，流速1600ml/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为88.6g，纯化收率78.5％，纯度99.6％，单一杂质小于0.11％。