通过LC-MS/MS测定人血浆中多西拉敏的方法与流程

通过lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏的方法
技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种通过lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏的方法。


背景技术：

2.琥珀酸多西拉敏(doxylamine succinate)，别名多西拉敏琥珀酸盐，其分子式为c
17h22
n2o
·
c4h6o4，cas号为562-10-7，分子量为388.46，其分子结构式具体如下：
[0003][0004]
琥珀酸多西拉敏为乙醇胺衍生物抗组胺剂，具有抗组胺作用、抗胆碱作用和显著的镇静作用，主要用于帮助减轻入睡困难。
[0005]
根据国家药监局(nmpa)的《药品注册管理办法》、《化学药品注册分类改革工作方案》等法规和技术指导原则进行试验药琥珀酸多西拉敏片(t)与参比药(r)两制剂一致性评价，需要对两制剂生物样品中的琥珀酸多西拉敏进行药代动力学研究以及生物等效性研究，但目前尚无有效的对生物样品中琥珀酸多西拉敏的测定方法。
[0006]
为满足评价琥珀酸多西拉敏片生物等效性的临床大批量样品分析需求，需开发快速、稳定、准确的检测方法用于测定人血浆中多西拉敏的浓度。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明有必要提供一种通过lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏的方法，利用快速亲水相互作用，采用lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏，该方法灵敏度高，能够定量的最低浓度可达0.500ng/ml，可实现人血浆中多西拉敏准确、快速、灵敏测定。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]
本发明提供了一种通过lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏的方法，包括以下步骤：
[0010]
人血浆样品前处理；
[0011]
采用液相色谱-质谱联用检测，其中，液相色谱条件为色谱柱：gemini 5μ c18 110a，2.0
×
100mm；预柱：gemini-c18；流动相a：甲醇；流动相b：20mm乙酸铵溶液，其中含有0.2％甲酸；自动进样器温度：4℃，进样量为2.0μl；柱温：30℃；梯度洗脱，流速为0.6ml/min，分析时间2.70min；质谱条件为离子化方式：电喷雾离子源(esi)，正离子化；监测方式：多重反应监测(mrm)；离子化电压：5500v；雾化器压力(gas1)：50psi；辅助加热气(gas2)：50psi；辅助加热气温度(gas temp)：600℃；碰撞气(cad)：medium；扫描方式；多反映监测。
[0012]
进一步方案，所述梯度洗脱具体如下：
[0013]
时间(min)流动相a(体积％)流动相b(体积％)
0.0033.067.01.2095.05.02.0095.05.02.1033.067.02.7033.067.0。
[0014]
进一步方案，所述方法的检测浓度范围为0.500-200ng/ml，lloq为0.500ng/ml。
[0015]
进一步方案，所述人血浆样品前处理的步骤为：向人血浆样品中加入内标工作溶液和蛋白沉淀剂，涡旋并离心后，取上清液稀释。
[0016]
进一步方案，所述内标工作溶液中的内标为琥珀酸多西拉敏-d5，其配制方法为：精密称取琥珀酸多西拉敏-d5标准品，用70％甲醇溶解稀释，获得浓度为1.00mg/ml的多西拉敏-d5储备液；再用70％甲醇稀释得到浓度为200ng/ml的内标工作溶液。
[0017]
进一步方案，所述蛋白沉淀剂选自乙腈，所述稀释剂选自90％乙腈。
[0018]
进一步方案，所述人血浆样品前处理的步骤，具体为：取100μl人血浆样品，加入20μl内标工作溶液和300μl蛋白沉淀剂，涡旋并离心后取50μl上清液，再将上清液与150μl稀释剂混合，即获得待测样品。
[0019]
进一步方案，所述涡旋并离心的参数为：以2500rpm涡旋混匀2min，10000g离心10min。
[0020]
本发明的原理：
[0021]
由于同位素标记物具有与未标记的待测物结构几乎完全一致，物理化学性质比较相似，在液相色谱中的保留时间一致，在质谱中的响应接近等特点，本方法选用同位素标记的多西拉敏-d5作为内标进行实验。lc-ms/ms方法具有灵敏度高、选择性高、分析速度快、使用范围广等特点，本方法选用lc-ms/ms法实现定量测定人血浆样品中多西拉敏的浓度。
[0022]
本发明具有以下有益效果：
[0023]
本发明的测定方法灵敏度高，能够定量的最低浓度可达到0.500ng/ml。并且本发明测定方法的特异性、基质效应、提取回收率和稳定性均得到验证，该测定方法能够用于临床琥珀酸多西拉敏药代动力学样本的检测。
[0024]
本发明中针对琥珀酸多西拉敏片药动学研究血浆样品的测定具有稳定、准确、实用的特定，可满足临床大批量样品分析评价琥珀酸多西拉敏片生物等效性的需求。
[0025]
此外，优选的，本发明采用乙腈沉淀法处理血浆样品，相比与液-液提取法和固相萃取法，乙腈沉淀法具有操作简便、快速等特点，可最大程度提高处理通量和灵敏度。
附图说明
[0026]
图1为多西拉敏母离子质谱图；
[0027]
图2为多西拉敏-d5母离子质谱图；
[0028]
图3为空白血浆样品中多西拉敏(lloq，0.500ng/ml，左图)和内标(多西拉敏-d5，200ng/ml，右图)；
[0029]
图4为空白血浆样品；
[0030]
图5为空白血浆样品中多西拉敏(1.00ng/ml，左图)和内标(多西拉敏-d5，200ng/
ml，右图)；
[0031]
图6为多西拉敏(1.00ng/ml，左图)和内标(多西拉敏-d5，200ng/ml右图)；
[0032]
图7为血浆中多西拉敏代表性标准曲线图；
[0033]
图8为一名受试者第一周期和第二周期的血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
[0034]
下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
[0035]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
[0036]
术语说明：
[0037][0038]
仪器与试剂：
[0039]
高效液相色谱(agilent公司，包括g1322a脱气机、g1316a柱温箱、g1367d自动进样器和g1312b二元泵)；质谱系统(sciex公司，qtrap5500型lc-ms/ms串联质谱仪，配备电喷雾电离源(esi源))。
[0040]
琥珀酸多西拉敏(批号：y0001562，纯度：100％，来源：edqm)；琥珀酸多西拉敏-d5(批号：20161122o，化学纯度：99.4％，同位素纯度：99.6％，来源：tlc公司)；甲醇(色谱纯，批号：i0935307804，merck公司)；乙酸铵(色谱纯，批号：50y1607ap，acs公司)；甲酸(色谱纯，批号：1704123，西陇化工公司)；乙腈(色谱纯，批号：ja064430，merck公司)。
[0041]
实施例1测定人血浆中多西拉敏
[0042]
配制标准品溶液
[0043]
①
多西拉敏工作溶液：精密称取琥珀酸多西拉敏标准品，加入指定体积的70％甲醇溶解稀释，获得浓度为1.00mg/ml的多西拉敏储备液，多西拉敏储备液置于透明玻璃瓶中-20℃冰箱保存。
[0044]
精密量取一份多西拉敏储备液并用70％甲醇稀释，配制成标准系列工作溶液，标准系列工作溶液的浓度分别为：100000、4000、3240、1620、810、270、90、30和10ng/ml；
[0045]
精密量取另一份多西拉敏储备液并用70％甲醇稀释，配制成质控工作溶液，质控工作溶液的浓度分别为：100000、6000、3000、1200、200、20和10ng/ml。
[0046]
以上配制所得的工作溶液均4℃冰箱保存。
[0047]
②
多西拉敏-d5工作溶液：精密称取琥珀酸多西拉敏-d5标准品，加入指定体积的70％甲醇溶解稀释，获得浓度为1.00mg/ml的多西拉敏-d5储备液。精密量取一定量的多西拉敏-d5储备液并用70％甲醇稀释，配制成浓度为200ng/ml的内标工作溶液。
[0048]
配制标准曲线系列样品及质控样品
[0049]
以人空白血浆稀释标准系列工作溶液和质控工作溶液，分别获得血浆中多西拉敏的浓度分别为0.500、1.50、4.50、13.5、40.5、81.0、162、200ng/ml标准曲线系列样品，以及4个点的质控样品的浓度分别为1.00ng/ml(lqc)、10.0ng/ml(mgqc)、60.0ng/ml(maqc)、150ng/ml(hqc)。
[0050]
样品前处理(包括血浆样品、标准/质控样品和空白样品)
[0051]
96孔板中加入100μl待测样品(
①
对于血浆样品，加入100μl；
②
对于标准/质控样品，加入空白血浆95μl及5μl对应浓度工作液；
③
对于双空白及单空白样品，加入空白血浆100μl)；然后分别加入20μl内标工作溶液(浓度为200ng/ml)，300μl沉淀剂乙腈，以2500rpm涡旋混匀2min，10000g离心10min，取50μl上清液，再加入稀释剂90％乙腈150μl混匀后待测。
[0052]
lc-ms/ms条件
[0053]
①
液相色谱条件：色谱柱：gemini 5μ c18 110a(2.0
×
100mm，5μm)；预柱：gemini-c18(批号：aj0-7597)；流动相a为甲醇；流动相b为20mm乙酸铵水溶液(以20mm乙酸铵水溶液的总体积为100％作为基准，含有体积比为0.2％甲酸)；自动进样器温度：4℃；柱温：30℃；流速0.6ml/min，分析时间2.70min；梯度洗脱程序见表1。
[0054]
表1梯度洗脱程序
[0055]
时间(min)流动相a(体积％)流动相b(体积％)0.0033.067.01.2095.05.02.0095.05.02.1033.067.02.7033.067.0
[0056]
②
质谱条件：离子化方式：电喷雾离子源(esi)，正离子化；监测方式：多重反应监测(mrm)；离子化电压：5500v；雾化器压力(gas1)：50psi；辅助加热气(gas2)：50psi；辅助加热气温度(gas temp)：600℃；碰撞气(cad)：medium；扫描方式；多反映监测。具体多西拉敏和多西拉敏-d5的母离子质谱图如图1和图2所示的，检测对象：多西拉敏，m/z271.0[m h]

，dp值60，ce值20；多西拉敏-d5，m/z 276.2[m h]

，dp值60，ce值20。
[0057]
实施例2方法学验证
[0058]
对实施例1中人血浆中多西拉敏的测定方法进行方法学验证，具体方法可参照2020年版《中国药典》-《生物样品定量分析方法验证指导原则》。
[0059]
1、选择性
[0060]
实施例1色谱条件下，多西拉敏和多西拉敏-d5的保留时间均为1.3min左右。
[0061]
分析7个不同来源受试者空白血浆、溶血血浆、高血脂血浆以及上述空白血浆配制的lloq样品和uloq样品评价方法的选择性。
[0062]
结果表明，7种不同来源空白基质中内源性物质对待测物的干扰为0.6-3.7％，对内标干扰为0.0-0.0％；同一来源空白基质中内标对待测物干扰为0.8％-14.3％；同一来源空白基质中uloq对内标干扰为0.0-0.0％。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰多西拉敏及多西拉敏-d5的测定。典型色谱图可参见图3、图4、图5和图6。
[0063]
2、标准曲线
[0064]
以多西拉敏理论浓度为横坐标(x)，多西拉敏与多西拉敏-d5的面积比为纵坐标(y)，进行直线回归计算(权重因子w＝1/x2)，多西拉敏的典型回归方程为y＝0.0317x 0.000394，r＝0.9994，在0.500-200ng/ml范围内明显线性，见图7。
[0065]
3、精密度和准确度
[0066]
方法学验证三个分析批中，每一批检测定量下限样品及低、中、高浓度水平qc样品(1.00ng/ml、10.0ng/ml、60.0ng/ml、150ng/ml)各6样本，计算各批内(n＝6)以及批间(n＝18)精密度和准确度，批内、批间样品检测的精密度和准确度结果见表2。
[0067]
表2批内、批间样品检测的精密度和准确度
[0068][0069]
由表2可以看出，各浓度水平质控样品的测定浓度均值与其理论浓度的偏差均小于15％；变异系数不超过15.0％，因此，本发明中的测定方法精密度和准确度均符合要求。
[0070]
4、回收率
[0071]
取同一来源的空白血浆的空腹采血空白血浆各95μl，按照血浆样品处理步骤，分别配制成参比样品和测试样品，测试样品峰面积/参比样品峰面积均值*100即为回收率。试验结果见表3。
[0072]
表3回收率测试结果
[0073][0074]
由表3可看出，多西拉敏在低、中、高三个质控浓度水平下的提取回收率接近。且满足：(1)在待测物每个浓度水平，待测物峰面积变异系数不超过15.0％；(2)待测物提取回收
率的总体变异系数不超过15.0％；(3)内标峰面积变异系数不超过15.0％。满足提取回收率的接受标准。
[0075]
5、基质效应
[0076]
6种不同来源空腹采血空白基质在低、高二个浓度水平平均归一化基质效应的变异系数分别为3.2％、2.5％，内标归一化基质效应因子均值分别为100.0％和100.0％。同一来源高脂样品高脂效应符合接受标准；同一来源溶血样品溶血效应符合接受标准。测定高脂血浆和溶血血浆配制的低、高两浓度质控样品，用于评价高脂和溶血血浆的基质效应。因此本实验检测条件下，可忽略基质效应的影响。
[0077]
6、稳定性
[0078]
稳定性评估将反映样品在采集和日常分析过程中暴露的环境，稳定性考察的时间和条件可根据实际操作条件进行调整。
[0079]
待测物多西拉敏储备液和工作溶液(lloq和uloq浓度水平)短期稳定性：在室温条件下均能稳定24h。
[0080]
待测物多西拉敏工作溶液(lloq和uloq浓度水平)长期稳定性：在4℃条件下均能稳定5天。
[0081]
生物样品前处理过程中的稳定性：对于人血浆样品在室温白光和室温黄光条件下，均能稳定24h。
[0082]
冻融5次循环稳定性：人血浆样品在-80℃和室温条件下冻融循环稳定性，人血浆样品可在-80℃和室温条件下冻融4次和冻融5次循环。
[0083]
生物基质中待测物的长期稳定性：人血浆-20℃条件下稳定5天，人血浆-80℃条件下稳定29天和60天。
[0084]
样品离心分离前基质中的短期稳定性：人全血在室温白光条件下稳定2小时。
[0085]
以上结果表明，多西拉敏在不同条件下均稳定。
[0086]
实施例3临床样本检测
[0087]
琥珀酸多西拉敏片人体生物等效性研究，经伦理委员会批准纳入10例健康受试者，并按1:1随机分配到tr和rt组(试验制剂t，参比制剂r)，受试者空腹和高脂餐后口服受试制剂(25mg/片)和参比制剂(25mg/片)各1片，在服药前0h(服药前1h内)及服药后48h内的各采血点，采集约4ml的血样于edta-k2真空采血管中。
[0088]
采用已建立起的方法测定血浆中多西拉敏的浓度，图8为一名受试者第一周期和第二周期的血药浓度-时间曲线图。通过图8可以看出，该受试者口服受试制剂(t)和参比制剂(r)后，其血药浓度-时间曲线图的趋势相似。
[0089]
通过以上实施例可以看出，本发明建立了灵敏、快速的液相色谱-质谱联用法测定人血浆中的多西拉敏的方法。其检测灵敏度较高，能够定量的最低浓度可达到0.500ng/ml；并且本发明的方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证，所述方法已经成功应用临床药代动力学样本的检测；本发明中的测定方法能够为琥珀酸多西拉敏片药动学研究血浆样品的测定提供了稳定、准确、实用的方法。
[0090]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0091]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。