用于制备肝癌检测试剂的新型代谢标志物及其应用

1.本发明涉及代谢物的功能和应用领域，具体涉及一种用于制备肝癌检测试剂的新型代谢标志物及其应用。


背景技术：

2.近年来，肝细胞癌(hcc)作为全球致死率较高的恶性肿瘤之一，约一半的新增确诊病例和死亡病例来自中国。在临床上用于筛查和诊断hcc包括影像学方法(如计算机断层扫描(ct)和超声检查)和血清生物标志物(如甲胎蛋白[afp])，但是ct和afp检测对hcc的预测灵敏度及对早期hcc判断的准确性有限，hcc晚期确诊率，预后生物标志物准确性有限，导致了hcc的死亡率较高。因此，寻找hcc早期生物标志物仍然是当务之急。
[0003]
肝脏作为一个主要的代谢器官，负责协调清除体内毒素，平衡葡萄糖、脂质和氨基酸的摄取，从而调节全身代谢维持稳态。肝癌的发生和发展伴随着代谢重编程，满足癌细胞快速生长和增殖的需要。因此，探索肝细胞癌代谢调控，挖掘用于肝细胞癌的诊断和预后的新型代谢标志物，可以为临床肝癌的精准治疗提供科学依据，更大限度地提高肝癌早期诊断率和治疗效果。
[0004]
丙酰辅酶a是具有三碳酰基的辅酶a。丙酰辅酶a由c-vomit的代谢途径产生，其中包括胆固醇、缬氨酸、奇数链脂肪酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。丙酰辅酶a可通过多步反应形成琥珀酰辅酶a进入到三羧酸循环，或生成丙酰肉碱参与奇数链脂肪酸合成。丙酰辅酶a合成代谢和分解代谢中的突变已被证实与多种人类疾病有关。其中pcca/pccb亚基功能的丧失导致丙酸血症(pa，omim606054)，导致大量新生儿发病和死亡。mut的突变会导致甲基丙二酸尿症(mim 251000)，从而导致酮症酸中毒，伴随嗜睡、呕吐和发育迟缓等症状。丙酰辅酶a具有调节代谢的潜力，其衍生物丙酰肉碱已被证明是hcc的生物标志物。近年来，随着不断深入的研究，代谢重编程也成为肝癌的新型标志之一，丙酰辅酶a在肝癌发生及调控中的角色仍需要进一步探索。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于制备肝癌检测试剂的新型代谢标志物及其应用。本发明通过实验研究发现，丙酰辅酶a代谢物在肝癌中的水平与肝癌严重程度呈反比。肝癌的丙酰辅酶a水平可以用于评估肝癌的严重程度，提高肝癌早期诊断的效率和准确性。通过检测肝癌组织样本的丙酰辅酶a水平，对肝癌患者进行个性化精准治疗。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007]
第一方面，本发明提供一种用于制备肝癌检测试剂的新型代谢标志物，其特征在于：所述代谢物为丙酰辅酶a。
[0008]
第二方面，本发明提供一种用于制备肝癌检测试剂的新型代谢标志物的应用，其特征在于：丙酰辅酶a作为肝癌代谢标志物，应用在肝癌检测中。
[0009]
作为一种优选方案，所述丙酰辅酶a作为肝癌代谢标志物，其代谢物水平及其与辅酶a比值与肝癌严重程度呈反比。
[0010]
本发明的优点及有益效果如下：
[0011]
本发明在小鼠体内构建肝癌模型，检测小鼠血清及肝癌组织中的代谢物水平，发现丙酰辅酶a的含量与小鼠血清alt、ast水平呈反比，与小鼠肝癌负荷呈反比。以上结果表明丙酰辅酶a含量与肝癌严重程度呈反比，可用于作为肝癌早期诊断及严重程度的代谢标志物。
[0012]
检测临床肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织中的代谢物水平，发现肿瘤组织中的丙酰辅酶a水平及丙酰辅酶a/辅酶a比值显著低于癌旁组织，且与肝癌的edmondson-steiner分级(简称为分级)、tnm分期(简称为分期)阶段呈负相关。以上结果表明丙酰辅酶a含量及丙酰辅酶a/辅酶a比值可用于肝癌临床检测，以判断肝癌的严重程度。
附图说明
[0013]
图1为本发明akt/nras/aldh6a1诱导小鼠肝癌模型中，丙酰辅酶a代谢物水平图；
[0014]
图1中：
[0015]
a：肝癌模型示意图；
[0016]
b：代表性肝脏外观图；
[0017]
c：肝癌组织中检测丙酰辅酶a的水平；
[0018]
d:血清检测丙酰辅酶a的水平；
[0019]
e：小鼠肝癌结节数目统计；
[0020]
f：血清检测alt、ast水平。
[0021]
*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001
[0022]
图2为本发明den/ccl4诱导小鼠肝癌模型中，丙酰辅酶a代谢物水平图；
[0023]
图2中：
[0024]
a:肝癌模型示意图；
[0025]
b：代表性肝脏外观图；
[0026]
c：血清检测丙酰辅酶a的水平；
[0027]
d：小鼠肝癌结节数目统计；
[0028]
e：血清检测alt、ast水平。
[0029]
*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001
[0030]
图3为本发明临床肝癌样本中，丙酰辅酶a水平及丙酰辅酶a/辅酶a比值
[0031]
图3中：
[0032]
a：癌(t)和癌旁组织(nt)中，丙酰辅酶a的表达水平；
[0033]
b：癌(t)和癌旁组织(nt)中，丙酰辅酶a/辅酶a比值；
[0034]
c：肝癌组织中，丙酰辅酶a在不同肝癌分级(edmondson grade i-iii)中的表达水平、相关性分析(cor《0,为负相关)；
[0035]
d：肝癌组织中，丙酰辅酶a/辅酶a比值在不同肝癌不同肝癌分级(edmondson grade i-iii)中的表达水平、相关性分析(cor《0,为负相关)；
[0036]
e：肝癌组织中，丙酰辅酶a/辅酶a比值在不同肝癌分期(tnm stage i-iv)中的表
达水平、相关性分析(cor《0,为负相关)。
[0037]
*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0039]
实施例1：通过高压尾静脉注射肝脏特异表达akt/nras/aldh6a1构建小鼠肝癌模型
[0040]
1、实验用动物及饲养：实验动物为c57bl/6(wt)小鼠，选取雄性小鼠，8周龄。
[0041]
2、动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学生命科学学院spf级动物房。每12小时交替照明，温度24
±
2℃，湿度40-70％，小鼠自由饮水进食。
[0042]
3、sleep beauty高压尾静脉小鼠肝癌模型构建：
[0043]
选择wt雄性小鼠8周龄。对照组(control组)：将pt3-myr-akt-ha、pt3-vector、pcmv(cat)t7-sb100和pt/caggs-nrasv12置于生理盐水中，高压注射到小鼠尾静脉。实验组(aldh6a1组)：将pt3-myr-akt-ha、pt3-aldh6a1、pcmv(cat)t7-sb100和pt/caggs-nrasv12置于生理盐水中，在5-7秒内完成尾静脉注射。进入肝脏的akt、nras、aldh6a1可以在转座酶的作用下整合到小鼠基因组中并稳定表达，最终诱发肝脏癌变。每周记录小鼠状态及体重变化。注射后6-8周取材。全血置于4℃过夜，2500转/分钟，4℃，离心3min，上清即为血清，液氮速冻。取出小鼠肝脏拍照，分离小鼠肝癌及癌旁组织，液氮速冻。
[0044]
4、血清代谢物水平检测：全血置于4℃过夜，2500转/分钟，4℃，离心3min，上清即为血清，取50μl液氮速冻。经液相色谱-质谱联用(hplc-ms/ms)检测丙酰辅酶a代谢物水平。
[0045]
5、肝癌组织代谢物水平检测：取25μg小鼠肝脏癌组织，提取组织代谢物。经液相色谱-质谱联用(hplc-ms/ms)检测丙酰辅酶a代谢物水平。
[0046]
6、血清样本谷丙转氨酶(alt)检测：谷丙转氨酶催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红棕色。在测定孔和对照孔各加入37℃预热的谷丙转氨酶基质液20μl，测定孔加入待测样品5μl，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼显色液，在对照孔中加入5μl待测样品，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应20分钟。最后在每个孔加入200μlnaoh，室温静置15分钟后，使用酶标仪检测在510nm处吸光度(njjc，c009-2-1)。
[0047]
7、血清样本谷草转氨酶(ast)检测：谷草转氨酶催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸可自行脱羧成丙酮酸；丙酮酸与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红棕色。在测定孔和对照孔各加入37℃预热的谷草转氨酶基质液20μl，加入待测样品5μl，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼显色液，在对照孔中加入5μl待测样品，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应20分钟。最后在每个孔中加入200μlnaoh，室温静置15分钟后，使用酶标仪检测在510nm处吸光度(njjc,c010-2-1)。
[0048]
实施例2：通过腹腔注射den/ccl4诱导小鼠肝癌模型
[0049]
1、实验用动物及饲养：实验动物c57bl/6背景野生型(wt)和aldh6a1敲除
aldh6a1-/-小鼠，选取雄性小鼠，2周龄。
[0050]
2、动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学生命科学学院spf级动物房。每12小时交替照明，温度24
±
2℃，湿度40-70％，小鼠自由饮水进食。
[0051]
3、den/ccl4小鼠肝癌模型构建：
[0052]
选择wt雄性小鼠及aldh6a1-/-雄性小鼠。小鼠于出生第14天腹腔注射den(25mg/kg)；8周龄时用橄榄油配制的ccl4(0.5ml/kg)灌胃，每2天一次，至21周。每周检查小鼠的健康状况并记录。在22周终末取材，全血置于4℃过夜，2500rpm，4℃，离心3min，上清即为血清，液氮速冻。取出小鼠肝脏拍照，分离小鼠肝脏癌及癌旁组织，液氮速冻。
[0053]
4、肝癌组织代谢物水平检测：取25μg小鼠肝脏癌组织，提取组织代谢物。经液相色谱-质谱联用(hplc-ms/ms)检测丙酰辅酶a代谢物水平。
[0054]
5、血清样本谷丙转氨酶(alt)检测：谷丙转氨酶催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红棕色。在测定孔和对照孔各加入37℃预热的谷丙转氨酶基质液20μl，测定孔加入待测样品5μl，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼显色液，在对照孔中加入5μl待测样品，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应20分钟。最后在每个孔加入200μlnaoh，室温静置15分钟后，使用酶标仪检测在510nm处吸光度(njjc，c009-2-1)。
[0055]
6、血清样本谷草转氨酶(ast)检测：谷草转氨酶催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸可自行脱羧成丙酮酸；丙酮酸与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红棕色。在测定孔和对照孔各加入37℃预热的谷草转氨酶基质液20μl，加入待测样品5μl，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼显色液，在对照孔中加入5μl待测样品，震荡混匀，置于37℃恒温气浴中反应20分钟。最后在每个孔中加入200μlnaoh，室温静置15分钟后，使用酶标仪检测在510nm处吸光度(njjc,c010-2-1)。
[0056]
实施例3：肝癌病人肝脏组织代谢物检测
[0057]
1、临床肝癌样本收取：收取临床肝癌病人肝脏组织样本(癌组织及配对癌旁组织)，样本来自于武汉大学中南医院，经武汉大学中南医院伦理委员会批准，并经病人签署知情同意书。所有程序均遵守赫尔辛基准则。肝癌组织及配对癌旁组织经液氮速冻保存于-80℃冰箱。
[0058]
2、组织代谢物水平检测：取25μg肝癌组织及配对癌旁组织，提取组织代谢物。经液相色谱-质谱联用(hplc-ms/ms)检测丙酰辅酶a、辅酶a代谢物水平。
[0059]
3、肝癌组织代谢物水平与病理的关联性分析：将肝脏癌组织代谢物水平与肝癌edmonson分级(grade i-iii)、tnm分期(stage i-iv)进行相关性分析。