一种萃取粮食与饲料中真菌毒素的方法与流程

1.本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种萃取粮食与饲料中真菌毒素的方法。


背景技术：

2.粮食是国家的战略物质,是人民的生活必需品,但粮食在生产、加工、运输、贮存的过程中受温度与湿度的影响，会发生霉变而产生有毒有害的真菌毒素。真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。其中多种真菌毒素有致癌、致畸、肝毒性、肾毒性、免疫抑制等等毒害作用，对人与动物有很大的危害。此外，由于许多真菌都能够产生多种真菌毒素化合物，而且许多来源的农产品在整体加工之前可能会聚集在一起，因此在食品和饲料产品中，多种真菌毒素共存的可能性非常高。
3.目前使用的对粮食饲料中真菌毒素的检测技术主要分为两大类，一类是以国标检测技术为主的大型仪器检测方法，包括高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lc-ms)、气相色谱-质谱法(gc-ms)等；一类是以免疫学分析方法为基础的快速分析技术，如酶联免疫分析法(elisa)、免疫层析分析(ica)、时间分辨荧光免疫层析(trfia)等。目前样品中真菌毒素的提取大多采用液相萃取技术。液相萃取技术利用相似相溶原理，将目标分子萃取到一种溶剂中，进而实现目标物和杂质的分离。常用的溶剂主要有甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷等有机溶剂，或者由几种溶剂组合而成的复合溶剂。
4.不同的真菌毒素在不同粮食、不同部位的分布和含量差异很大,且极性各不相同。这就导致在同时测定不同目标、不同基质的多种真菌毒素时，需分别采用不同的萃取液来萃取不同的真菌毒素，且萃取过后要进行不同倍数的稀释，在检测过程中费时费力。且萃取液大多为有机溶剂，对人体健康有害，污染环境。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题是提供一种萃取粮食与饲料中真菌毒素的方法，该方法能够实现对粮食、饲料中真菌毒素的高效萃取，萃取液更加环保，萃取过程更加简便快速。
6.为实现上述目的，本发明第一方面提供如下技术方案：
7.一种萃取粮食与饲料中真菌毒素的方法，所述方法包括：
8.s1：真菌毒素萃取液的制备：使用含0.5-2重量％的tween20、含0.1-1重量％的edta的基础缓冲液pbs，将表面活性剂配制成为含0.05-2重量％表面活性剂的缓冲液得到所述真菌毒素萃取液；
9.s2：真菌毒素的萃取：准确称取1-2g粮食粉末或饲料粉末于烧杯中，加入所述真菌毒素萃取液，搅拌提取2-5分钟，静置后，直接取上清溶液作为待测液；
10.s3：真菌毒素的检测：通过免疫检测方法定量分析样品中的真菌毒素含量。
11.作为本发明的一个实施例，步骤s1中，所述基础缓冲液pbs的浓度为5-10mm，ph为7.2-7.4。
12.作为本发明的一个实施例，步骤s1中，所述表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚类化合物或烷基酚聚氧乙烯醚类化合物，优选为月桂醇聚醚-15、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、tert-辛基酚聚氧乙烯醚和乙基苯基聚乙二醇中的一种或几种。
13.作为本发明的一个实施例，步骤s3中，所述通过免疫检测方法定量分析样品中的真菌毒素含量包括：使用侧向流免疫层析、酶联免疫吸附或化学发光免疫分析中的一种或几种免疫检测方法同时定量分析步骤s2中待测液中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的含量。
14.本发明提供的上述技术方案至少带来的有益效果：
15.(1)本发明中使用的萃取液不含有机溶剂，相对于使用有机溶剂作为萃取液萃取真菌毒素的毒害作用及污染环境等缺点，更绿色环保；
16.(2)本发明的方法省去检测真菌毒素过程中的离心、过滤、稀释等步骤，萃取液与样品混合后可直接检测，减少检测时间，使用更加方便；
17.(3)本发明的方法可以对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇三种极性不同的真菌毒素实现同步萃取；
18.(4)本发明方法使用含有表面活性剂的缓冲液作为萃取液，无使用甲醇、乙醇等易燃易爆有机溶剂面临的运输、储存、管理等成本问题，节约成本。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
20.实施例1：玉米中黄曲霉毒素b1(afb1)、玉米赤霉烯酮(zen)、呕吐毒素(don)的检测
21.1)取0.17g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml基础缓冲液(50mm，含1重量％tween20、0.3重量％edta)，充分溶解制得2mm的月桂醇聚醚-15溶液，作为黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素三种真菌毒素的萃取液。
22.2)称取1g玉米样品粉末于50ml烧杯中，备用。
23.3)将20ml 2mm的月桂醇聚醚-15溶液加入到样品的烧杯中，搅拌2min进行萃取，静置5min后取上清溶液作为待测液。
24.4)利用edc/nhs法将黄曲霉毒素单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、呕吐毒素单克隆抗体分别共价偶联在羧基修饰的时间分辨荧光微球上，分别得到时间分辨荧光微球与afb1单克隆抗体、zen单克隆抗体与don单克隆抗体的偶联物作为免疫微球，并冻干于微孔中，在4℃冰箱保存。利用划膜仪将黄曲霉毒素包被抗原(afb1-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，将玉米赤霉烯酮包被抗原(zen-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，将呕吐毒素包被抗原(don-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上37℃烘干12小时，将玻璃纤维膜、nc膜、吸水纸依次贴在pvc底板上，用切条机切成宽度为4mm的试纸条，分别制成黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的时间分辨荧光检测卡。
25.5)各取100μl待测液直接滴加到三种真菌毒素检测卡上，检测卡静置反应15分钟；
26.6)最后，通过时间分辨荧光干式定量检测仪器，通过检测卡t线和c线的荧光强度，
来确定afb1、zen、don三种真菌毒素的含量。
27.实施例2：小麦中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测
28.1)取0.17g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml基础缓冲液(50mm，含1重量％tween20、0.3重量％edta)，充分溶解制得2mm的月桂醇聚醚-15溶液，作为黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮与呕吐毒素三种真菌毒素的萃取液。
29.2)称取1g小麦样品粉末于50ml烧杯中，备用。
30.3)将20ml 2mm的月桂醇聚醚-15溶液加入到样品的烧杯中，搅拌2min进行萃取，静置5min后取上清溶液作为待测液。
31.4)取平均粒径为25nm的纳米金颗粒的溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液调节ph值为7.5，向溶液中加入一定浓度的黄曲霉毒素b1单克隆抗体，反应30分钟后，加入封闭缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液，ph 7.2，含牛血清白蛋白5重量％、酪蛋白0.3重量％、pvpk12 0.5重量％、海藻酸钠0.02重量％)，继续反应30分钟。用喷金划膜仪将其喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干24小时，制备黄曲霉毒素检测卡的结合物垫。同样制备玉米赤霉烯酮与呕吐毒素的结合物垫。利用划膜仪分别将黄曲霉毒素包被抗原(afb1-bsa，0.3mg/ml)以及羊抗鼠igg(0.5mg/ml)均匀涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，37℃烘干4小时，将玉米赤霉烯酮包被抗原(zen-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，将呕吐毒素包被抗原(don-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上37℃烘干12小时，将玻璃纤维膜、结合物垫、nc膜、吸水纸依次贴在pvc底板上，用切条机切成宽度为3.8mm的试纸条。将试纸装载于塑料卡壳中，分别制成黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的胶体金检测卡。
32.5)各取100μl待测液直接滴加到三种真菌毒素检测卡上，检测卡静置反应15分钟；
33.6)最后，通过手持定量检测仪器读取检测卡t线和c线的数据，来确定afb1、zen、don三种真菌毒素的含量。
34.实施例3：大米中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测
35.1)取0.17g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml基础缓冲液(50mm，含1重量％tween20、0.3重量％edta)，充分溶解制得2mm的月桂醇聚醚-15溶液，作为黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮与呕吐毒素三种真菌毒素的萃取液。
36.2)称取1g大米样品粉末于50ml烧杯中，备用。
37.3)将20ml 2mm的月桂醇聚醚-15溶液加入到样品的烧杯中，搅拌2min进行萃取，静置5min后取上清溶液作为待测液。
38.4)分别将afb1-bsa、zen-bsa、don-bsa三种真菌毒素的抗原直接固定在不同的微孔板上，洗涤后，分别向包被了三种真菌毒素抗原的微孔中分别加入50μl待测液，后分别加入50μl对应的三种真菌毒素抗体溶液于37℃孵育，1h后洗涤，加入100μl辣根过氧化物酶标记二抗于37℃孵育1h，洗涤后加入显色液显色，37℃孵育15min后加入终止液终止反应，利用酶标仪测定各孔od值，计算样品中的afb1、zen、don三种真菌毒素的含量。
39.实施例4：全价配合饲料中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测
40.1)取0.17g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml基础缓冲液(50mm，含1重量％tween20、0.3重量％edta)，充分溶解制得2mm的月桂醇聚醚-15溶液，作为黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮与呕吐毒素三种真菌毒素的萃取液。
41.2)称取1g全价配合饲料样品粉末于50ml烧杯中，备用。
42.3)将20ml 2mm的月桂醇聚醚-15溶液加入到样品的烧杯中，搅拌2min进行萃取，静置5min后取上清溶液作为待测液。
43.4)分别将黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素三种真菌毒素的单克隆抗体固定到96孔板的不同微孔中，洗涤后，分别向含有三种真菌毒素抗体的微孔中加入100μl待测液，37℃孵育1h，洗涤后加入100μl酶标抗体于37℃孵育1h，洗涤后加入100μl酶底物进行显色，经酶标仪读取各微孔的吸光度值计算样品中的afb1、zen、don三种真菌毒素的含量。
44.实施例5：混合饲料中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测
45.1)取0.17g月桂醇聚醚-15试剂，加入100ml基础缓冲液(50mm，含1重量％tween20、0.3重量％edta)，充分溶解制得2mm的月桂醇聚醚-15溶液，作为黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮与呕吐毒素三种真菌毒素的萃取液。
46.2)称取1g混合饲料样品粉末于50ml烧杯中，备用。
47.3)将20ml 2mm的月桂醇聚醚-15溶液加入到样品的烧杯中，搅拌2min进行萃取，静置5min后取上清溶液作为待测液。
48.4)利用edc/nhs法将黄曲霉毒素单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、呕吐毒素单克隆抗体分别共价偶联在羧基修饰的量子点上，分别得到量子点与afb1单克隆抗体、zen单克隆抗体与don单克隆抗体的偶联物作为免疫微球，并冻干于微孔中，在4℃冰箱保存。利用划膜仪将黄曲霉毒素包被抗原(afb1-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，将玉米赤霉烯酮包被抗原(zen-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上，将呕吐毒素包被抗原(don-bsa，0.5mg/ml)以及羊抗鼠igg(1mg/ml)均匀喷涂到硝酸纤维膜(nc膜)上37℃烘干12小时，将玻璃纤维膜、nc膜、吸水纸依次贴在pvc底板上，用切条机切成宽度为4mm的试纸条，分别制成黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的量子点检测卡。
49.5)各取100μl待测液直接滴加到三种真菌毒素检测卡上，检测卡静置反应15分钟；
50.6)最后，通过荧光定量检测仪器，通过检测卡t线和c线的荧光强度，来确定afb1、zen、don三种真菌毒素的含量。
51.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。