一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用的制作方法

一种快速长片段扩增酶及其在kir基因测序中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种快速长片段扩增酶及其在kir基因测序中的应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cells,nk)来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。nk细胞主要分布于外周血和脾，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。nk细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于t、b淋巴细胞的一类淋巴样细胞。nk细胞可表达多种表面标志，其中多数也可表达于其他免疫细胞表面。nk细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。nk细胞能够杀伤某些病毒感染的细胞和突变的肿瘤细胞，而对宿主正常组织细胞下不具细胞毒作用，表明nk细胞具有识别宿主自身正常组织细胞和体内异常组织细胞的能力。近年来研究证实，nk细胞表面具有两类功能截然不同的受体，其中一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可激发nk细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞活化受体；另一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可抑制nk细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞抑制受体。nk细胞识别hla i类分子的受体由两种结构不同的家族分子构成。一种称之为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptor,kir)；另一种称之为杀伤细胞凝集素样受体(killer lectin-like receptor,klr)。
3.kir(killer immunoglobulin-like receptor,kir)是位于nk细胞和某些t细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原mhcⅰ类分子的受体，对nk细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用。kir位于人类19q13.4，白细胞受体复合物(lrc)上，跨距约150kb、头尾排列，聚集成簇和多态性丰富的多基因家族所编码，基因呈不规律排列，其结构和功能具有多样性。uhrberg等首次采用pcr-ssp方法对kir进行基因分型，显示了在不同nk细胞克隆含有不同数目和种类的kir基因。由于kir基因分型方法的不断改进和完善，kir基因家族成员的不断扩增，先前忽略的基因，假基因和变体不断浮出水面，katharine等证实通过家系分离和基因组测序和基因序列的确定，单凭基因含量就超过20多种kir单倍型和至少40-50种kir基因型，目前在低分辨水平上可检测的有18个kir基因型，即kir1d、kir2d1-5、kir2ds1-5、kir3dl1-3、kir3ds1、假基因xv、x和kir2dp1，这些基因表现出不同程度的多态性。在uhrberg、norman和gomez-lozano等人的工作基础上，其他研究工作者通过重新调整合成多对引物优化kir分型的正确性。
4.目前主要的kir基因分型方法有pcr-rflp法、pcr-ssop法、pcr-ssp法、实时荧光定量pcr法及pcr-sbt法。pcr-rflp即pcr-限制性片段长度多态性检测技术，基本原理是用pcr扩增目的dna，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。此方法需构建等位基因特异性酶切位点，操作复杂，结果不能自动获得且带有主观性。pcr-ssop即pcr-特异性序列寡核苷酸探针，基本方法是用人工合成的kir型别特异的寡核
苷酸序列作为探针，与待检样品经pcr扩增的kir基因片段杂交，从而确定kir型别。此法存在大量探针设计困难，以及在实验程序的最佳条件摸索中需要投入巨大的人力物力，并需配备杂交仪，而且实验室间可重复性差、准确度有待提高。pcr-ssp即序列特异性引物技术，基本方法是设计出一整套等位基因特异性引物，借助pcr技术获得kir型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定kir型别。此法操作相对简单，省去酶切、杂交等步骤，pcr扩增后直接电泳观察结果，如今广泛应用于临床。但其结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高。实时荧光定量pcr(real-time pcr)技术通过实时监测杂交探针释放的荧光信号，能够定性或者定量检测样本中的核酸，操作简单，但得不到高分型别。pcr-sbt(pcr-直接测序法)也可用于kir基因分型，sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量pcr taqman探针法、普通pcr法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。但传统的kir测序需要分段设计多组引物，设计复杂，未得到广泛应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供了一种快速长片段扩增酶及其在kir基因测序中的应用，通过本发明提供的经修饰的dna聚合酶可在一个pcr反应实现对kir亚型基因的全长扩增，长至16kb。旨在克服现有技术的不足之处，实现长片段序列的快速准确扩增，每个kir亚型只需要一对引物组即可实现全长扩增，使kir基因测序扩增更快速简单的进行。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一个目的是提供一种快速长片段扩增酶，其为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的dna聚合酶，所述的修饰的dna聚合酶与未修饰的dna聚合酶的氨基酸序列相比，进行如下突变：第145位的亮氨酸l突变为谷氨酰胺q，第719位的缬氨酸v突变为天冬酰胺n，所述快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no 48所示。
8.本发明中“未修饰的dna聚合酶”，是指taq dna polymerase，来自thermo，货号ep0406。
9.本发明的扩增酶的氨基酸序列中l145q和v719n，氨基酸活性基团从负电荷团改变为带正电荷的氨基酸分子，使反应模板dna能更快速且紧密地与聚合酶结合，从而使反应速度加快。
10.本发明的第二个目的是提供所述的快速长片段扩增酶在制备kir基因测序试剂中的应用。
11.本发明的第三个目的是提供一种kir基因分型试剂盒，包含所述的快速长片段扩增酶，还包括pcr反应试剂、pcr扩增引物及测序引物。
12.所述的pcr反应试剂包括：0.5mm脱氧核苷酸(dntp)，40mm氯化镁(mgcl2)，80mm氯化钾(kcl)，60mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，1mm四甲基氯化铵(tmac)，甘油0.6％(v/v)，甲酚红0.02％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。
13.所述的pcr扩增引物及测序引物为能够用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir常见的16种基因的pcr扩增引物和测序引物，所述的16种基因包括14个kir功能性基因2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds4、2ds5、3dl1、3dl2、3dl3和3ds1，以及2个假基因2dp1和3dp1。
14.进一步地，所述的pcr扩增引物包括16个特异性扩增引物组，每个特异性扩增引物
组含有的引物对核苷酸序列如下表所示：
[0015][0016]
[0017][0018]
进一步地，所述的测序引物包括8个通用测序引物组，每个引物核苷酸序列如下表所示：
[0019][0020][0021]
本发明具有如下技术效果：
[0022]
1)本发明的dna聚合酶为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的dna聚合酶，能够实现对长片段目的序列的快速准确扩增；可在一个pcr反应实现对kir亚型基因的全长扩
增，长至16kb；
[0023]
2)能够实现对样本kir基因的快速扩增及测序分型。
附图说明
[0024]
图1为样本扩增电泳图；
[0025]
图2-10为测序图谱。
具体实施方式
[0026]
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0027]
实施例1
[0028]
1.原料与设备
[0029]
1.1快速长片段扩增酶的制备：通过基因合成的方法对dna聚合酶的氨基酸序列进行改造，使其表现为l145q和v719n。合成大肠杆菌常用密码子的完整基因序列，快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no 48所示。并在t7启动子系统下用bl21菌株表达。
[0030]
bl21菌株表达使用重组大肠杆菌puc57载体，均由江苏赛索飞生物科技有限公司提供，并由赛索飞进行基因合成，得到快速长片段扩增酶的质粒dna和工程菌。再由江苏见知生物科技有限公司进行蛋白表达及纯化，得到本发明所述的快速长片段扩增酶(浓度5u/μl)。并通过kir基因扩增验证其性能。
[0031]
本领域技术人员可以根据需要，采用本领域常规技术手段即可制备快速长片段扩增酶，此处不做特别限定。
[0032]
seq id no 48序列如下：
[0033]
atgcgtggtatgctgccgctgtttgaaccgaaaggtcgtgttctgctggtcgacggtcatcatctggcatatcgtacctttcatgcactgaaaggtctgaccaccagccgtggtgaaccggttcaggcagtttatggttttgcaaaaagcctgctgaaagcactgaaagaagatggtgatgcagttattgttgtttttgatgcaaaagcaccgagctttcgtcatgaagcatacggtggttataaagcaggtcgtgcaccgaccccggaagattttccgcgtcagctggcactgattaaagaactggttgatctgctgggtctggcacgtctggaagttccgggttatgaagcagatgatgttctggcaagcctggcaaaaaaagcagaaaaagaaggttatgaagttcgtattctgaccgcagataaagatctgtatcagctgctgagcgatcgtattcatgttctgcatccggaaggttatctgattaccccggcatggctgtgggaaaaatatggtctgcgtccggatcagtgggcagattatcgtgcactgaccggtgatgaaagcgataatctgccgggtgttaaaggtattggtgaaaaaaccgcacgtaaactgctggaagaatggggtagcctggaagcactgctgaaaaatctggatcgtctgaaaccggcaattcgtgaaaaaattctggcacacatggatgatctgaaactgagctgggatctggcaaaagttcgtaccgatctgccgctggaagttgactttgcaaaacgtcgtgaaccggatcgtgaacgtctgcgtgcatttctggaacgtctggaatttggcagcctgctgcatgaattcggtctgctggaaagcccgaaagcactggaagaagcaccgtggccgccgccggaaggtgcatttgttggttttgttctgagccgtaaagaaccgatgtgggcagacctgctggcactggcagcagcacgtggtggtcgtgttcatcgtgcaccggaaccgtataaagcactgcgtgatctgaaagaagcacgtggtctgctggcaaaagacctgagcgttctggcactgcgtgaaggtctgggtctgccgccgggtgatgatccgatgctgctggcatatctgctggacccgagcaataccaccccggaaggtgttgcacgtcgttatggtggtgaatggaccgaagaagcaggtgaacgtgcagcactg
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[0034]
1.2kir基因分型试剂盒
[0035]
本发明的kir基因分型试剂盒包含上述快速长片段扩增酶，还包括pcr反应试剂、pcr扩增引物及测序引物。
[0036]
1.2.1pcr反应混合液的配制：0.5mm脱氧核苷酸(dntp)，40mm氯化镁(mgcl2)，80mm氯化钾(kcl)，60mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，1mm四甲基氯化铵(tmac)，甘油0.6％(v/v)，甲酚红0.02％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。按上述比例配制2*pcr反应混合液50ml，-20℃长期保存，4℃暂存备用。
[0037]
1.2.2扩增引物混合液的配制：
[0038]
根据imgt数据库中公布的kir基因序列，选择适当顺序设计各亚型的特异性引物。将设计好的引物序列进入ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast分析，结合其它引物设计软件如oligo分析的引物间二级结构等进行调整，选择用于检测kir各型别的引物。
[0039]
将每条扩增引物稀释为12od/ml，再按下表将正向引物、反向引物和te缓冲液按照20μl 20μl 960μl的体积混合，得到kir各亚型扩增引物混合液。
[0040]
表3扩增引物混合液
[0041][0042]
1.2.3测序引物的配制：
[0043]
将每条测序引物稀释为12od/ml的原液，再将测序引物原液与te缓冲液按照下表配制，得到测序引物溶液。
[0044]
[0045][0046]
所述的测序引物包括8个通用测序引物组，每个引物核苷酸序列如下表所示：
[0047]047][0048]
1.3样本的来源
[0049]
1)血液样本采集
[0050]
用edta抗凝采血管采集血液样本，以人静脉全血样本作为实验样本。
[0051]
2)核酸样本萃取
[0052]
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以管柱法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
[0053]
3)核酸样本定量
[0054]
萃取的核酸样本溶解于te溶液(10mmol/l tris-hcl、0.1mmol/l edta)。
[0055]
4)核酸样本质量规范
[0056]
核酸样本的a260/a280比值应介于1.6到2.0之间。
[0057]
1.4所需实验设备
[0058]
pcr扩增仪、一代测序仪、不同量程的移液器、小型台式离心机、96孔板离心机。
[0059]
2.测序分型过程
[0060]
2.1反应体系的配置：每一个样本需同时进行16管独立的pcr扩增反应，按下表配制反应体系：
[0061]
表4扩增反应体系
[0062][0063]
2.2扩增反应程序：总反应时间约为4小时，如表5所示：
[0064]
表5 pcr反应程序
[0065][0066][0067]
2.3电泳分析
[0068]
将pcr反应产物，加样到2％的琼脂糖凝胶上，以200v的电压电泳10-20分钟，紫外透射仪上照相，确认pcr产物的质量。
[0069]
结果如图1所示。图1中，各个泳道从左往右依次为：2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds4、2ds5、3dl1、3dl2、3dl3、3ds1、2dp1、3dp1扩增产物。
[0070]
图1证明了本发明的快速长片段扩增酶能够成功地用于kir基因的扩增。
[0071]
2.4pcr产物纯化(exosap-it
tm
)
[0072]
加入4μl exosap-it
tm
，以去除多余引物和dna。参照下表设定程序，开始进行纯化
步骤。总反应时间约为45分钟。
[0073]
表6 exosap pcr反应程序设定
[0074][0075]
2.5测序反应
[0076]
根据表7，准备所需bdt测序试剂。
[0077]
表7 bdt测序试剂体积表
[0078][0079]
在每一反应孔中加入1.5μl bdt测序试剂、2.5μl测序用引物、1μl纯化后的pcr产物。于pcr仪开始执行测序反应程序。总反应时间约为1小时45分钟。
[0080]
表8测序pcr反应程序设定
[0081][0082]
2.6测序产物纯化——乙醇沉淀
[0083]
利用乙醇沉淀，去除多余bdt。
[0084]
2.7上测序仪前准备步骤
[0085]
测序前，加入15μl的hidi formamide。使用pcr仪进行2分钟，95℃的处理使双链dna变性成为单链状态，上测序仪检测。
[0086]
测序结果如图2-图10所示。可参见测序图谱抬头，图2-10分别为：样本s1 2dl1的8条测序结果。
[0087]
图2-图10证明了kir扩增产物继续进行sanger测序的成功进行。
[0088]
结论：通过本发明提供的经氨基酸修饰的dna聚合酶可在一个pcr反应实现对每个kir亚型基因的全长扩增，长至16kb。实现了长片段序列的快速准确扩增，每个kir亚型只需要一对引物组即可实现全长扩增，使kir基因测序更快速简单的进行。
[0089]
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。