一种粘度和极性响应型平台荧光探针、硫化氢检测荧光探针及其合成工艺与应用

1.本发明涉及体内硫化氢检测技术领域，尤其涉及一种粘度和极性响应型平台荧光探针、硫化氢检测荧光探针及其合成工艺与应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.黏度和极性是生物微环境中的两个重要指标，与炎症、神经退行性疾病甚至癌症等许多病理生理过程密切相关。一方面，生物体系中粘度的变化可影响信号转导、生物大分子相互作用乃至细胞的凋亡与自噬等过程；另一方面，诸多生理过程如蛋白质变性、多肽聚集、膜融合及酶的构象变化均受到生理环境极性变化的影响。然而，目前生理微环境中粘度和极性的测量仍然是化学生物学中的一个重要挑战。
4.硫化氢是工业废气中的一种有毒气体，也是生命体系中重要的内源性信号气体递质。在体内，半胱氨酸及其衍生物可以通过酶催化代谢产生硫化氢。研究表明，内源性硫化氢参与细胞的生理过程具有舒张血管、调节血压和调节胰岛素分泌等多种生理功能。传统硫化氢的检测方法包括标准碘量法，醋酸铅试纸法，离子活度法，硫化氢仪器法等。然而，传统分析方法无法进行体内检测，且具有依赖大型检测仪器、待检样品需要较复杂的前处理、检测速度慢、不适用于实时原位检测等缺点。


技术实现要素：

5.针对上述的问题，本发明提出一种粘度和极性响应型平台荧光探针、硫化氢检测荧光探针及其合成工艺与应用，基于所述荧光探针构建的硫化氢检测荧光探针具有高选择性、高灵敏度检测硫化氢的功能，并可用于细胞中硫化氢的实时监测。为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：
6.本发明的第一方面，本发明公开一种粘度和极性响应型平台荧光探针，其结构如式3所示。
[0007][0008]
上述式3中，取代基r1为烃基，如甲基、乙基等；取代基r2为-cn、
ꢀ‑
conh2、-cooh等中的任意一种。
[0009]
本发明的第二方面，本发明公开一种硫化氢检测荧光探针，其结构如式4所示。
[0010][0011]
上述式4中，取代基r1为烃基，如甲基、乙基等；取代基r2为-cn、
ꢀ‑
conh2、-cooh等中的任意一种。
[0012]
本发明的第三方面，本发明公开所述粘度和极性响应型平台荧光探针的合成工艺，包括步骤：以式1所示化合物与4-二乙氨基水杨醛为原料，加热反应后分离出目标产物式3，即得。
[0013][0014]
式1中，取代基r1为烃基，如甲基(-ch3)、乙基(-ch2ch3)等；取代基r2为-cn、-conh2、-cooh等中的任意一种。
[0015]
进一步地，所述式1所示化合物与4-二乙氨基水杨醛的摩尔比范围为1：1～4：1。
[0016]
进一步地，式1所示化合物与4-二乙氨基水杨醛溶于溶剂中后再加热反应。可选地，所述溶剂包括：甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)等中的任意一种。
[0017]
进一步地，所述加热反应的温度为50～100℃。
[0018]
本发明的第四方面，本发明公开所述硫化氢检测荧光探针的合成工艺，包括步骤：以式3所示粘度和极性响应型平台荧光探针与2,4-二硝基氟苯为原料，在碱的催化下反应后分离出目标产物式4，即得。
[0019]
进一步地，式3所示粘度和极性响应型平台荧光探针与2,4-二硝基氟苯的摩尔比范围为1：1～1：1.5。
[0020]
进一步地，式3所示粘度和极性响应型平台荧光探针与2,4-二硝基氟苯溶于溶剂中后再进行反应。可选地，所述溶剂包括：二氯甲烷、氯仿、乙腈等中的任意一种。
[0021]
进一步地，所述碱的加入比例为式3所示原料的摩尔量的一倍及以上。优选地，所述碱包括三乙胺、碳酸钾等中的任意一种。
[0022]
本发明的第五方面，公开所述粘度和极性响应型平台荧光探针(式3)、硫化氢检测荧光探针(式4)在生物、医学等领域中的应用，优选为用于体内硫化氢的监测。
[0023]
与现有技术相比，本发明至少具有以下方面的有益效果：
[0024]
针对生理微环境中极性及粘度检测中存在的可操作性差、灵敏度低等问题，本发
明提供了一种可用于环境粘度和极性检测的高灵敏度平台荧光探针(式3)，该探针可通过荧光强度的剧烈变化反应环境粘度的改变，通过荧光发射位置的变化反应环境极性的改变；同时该探针分子可充当优良的平台分子用于不同应用领域探针的合成；通过改造所述荧光探针分子的羟基，得到高灵敏度硫化氢检测荧光探针(式4)，其通过采用含有强吸电子硝基的2,4-二硝基氟苯单元猝灭分子荧光，硫化氢分子可与上述单元发生芳香亲核取代反应，导致2,4-二硝基氟苯单元从硫化氢荧光探针 (式4)分子中脱离，从而恢复分子荧光信号，实现硫化氢的检测。经过测试，本发明的这种硫化氢检测荧光探针的检测灵敏度高达36纳摩，可用于细胞这一特殊环境中硫化氢的监测。
[0025]
说明书附图
[0026]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0027]
图1是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子的核磁共振氢谱。
[0028]
图2是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子的核磁共振氢谱在化学位移为6.0-8.8区域的放大图。
[0029]
图3是本发明第三实施例合成的硫化氢检测荧光探针的核磁共振氢谱。
[0030]
图4是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子在甘油-水组成的不同粘度体系中的荧光发射图。
[0031]
图5是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子在甘油-水组成的不同粘度体系中的荧光强度与粘度的定量关系图。
[0032]
图6是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子在不同极性溶剂中的荧光发射图。
[0033]
图7是本发明第一实施例合成的粘度和极性响应型平台荧光探针分子在不同极性溶剂中的荧光发射波长的定量关系图。
[0034]
图8是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针与28种分析物分别反应后的荧光谱图。
[0035]
图9是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针与28种分析物分别反应后530nm处的荧光强度图。
[0036]
图10是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针在不同干扰物 (存在下与硫化钠反应后530nm处的荧光强度图。
[0037]
图11是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针与硫化钠反应不同时间点的荧光强度图。
[0038]
图12是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针与不同浓度硫化氢反应相同时间后的荧光强度图。
[0039]
图13是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针与硫化氢反应相同时间后的荧光强度与硫化氢浓度的线性关系图。
[0040]
图14是不同浓度的第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针处理hela 细胞后的细胞存活率结果图。
[0041]
图15是本发明第二实施例合成的硫化氢检测荧光探针对细胞中硫化氢的荧光共
聚焦成像应用结果图。
具体实施方式
[0042]
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
[0043]
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的工艺进一步说明。
[0044]
第一实施例
[0045]
一种粘度和极性响应型平台荧光探针的制备方法，参考反应路线1，包括步骤：
[0046][0047]
(1)称取4mmol 4-二乙氨基水杨醛(式2)、1mmol式1所示化合物以及20ml甲醇于三颈烧瓶中，上述体系于50℃下加热反应。
[0048]
(2)tlc监测反应，待反应中间体消失，将反应液冷却室温，旋蒸除去部分溶剂，反应液冷却后有大量晶体析出；抽滤固液混合物，得到橙色固体即为粘度和极性响应型平台荧光探针，如式3所示。
[0049]
本实施例合成的式3所示的粘度和极性响应型平台荧光探针的核磁共振氢谱如图1、图2所示。其中，图1是该荧光探针分子的核磁共振氢谱，图2是该荧光探针分子的核磁共振氢谱在化学位移为6.0-8.8区域的放大图。由图1和图2可确定所述粘度和极性响应型平台荧光探针的结构式3 所示。
[0050]
本实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针的结构表征数据如下：1hnmr(500mhz,dmso-d6),δ(ppm):12.39(s,1h),8.75(d,j＝ 1.55hz,1h),8.01(dd,j1＝8.60hz,j2＝1.70hz,1h),7.41(d,j＝8.55hz, 1h),7.20(d,j＝9.00hz,1h),6.33(dd,j1＝8.95hz,j2＝1.90hz 1h),6.13(d, j＝2.00hz,1h),4.40(q,j＝7.15hz,2h),3.42(q,j＝7.15hz,4h),1.43(t,j ＝7.15hz,3h),1.23(t,j＝7.15hz,6h)；esi-ms:m/z[m h]

calcd for: c
23h24
n3o4:406.1；found 406.1.esi-ms:m/z[m h]

calcd for: c
29h26
n5o8:572.1；found 572.2.
[0051]
第二实施例
[0052]
一种粘度和极性响应型平台荧光探针的制备方法，参考上述反应路线 1，包括步骤：
[0053]
(1)称取1mmol 4-二乙氨基水杨醛(式2)、1mmol式1所示化合物以及5ml dmf于三
颈烧瓶中，上述体系于100℃下加热反应。
[0054]
(2)tlc监测反应，待反应中间体消失，将反应液冷却室温；将上述反应液缓慢加入到50ml的饱和食盐水中、有大量固体析出；抽滤固液混合物，得到橙色固体即为粘度和极性响应型平台荧光探针，如式3所示。
[0055]
本实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针的结构表征数据如下：1hnmr(500mhz,dmso-d6),δ(ppm):12.39(s,1h),8.75(d,j＝ 1.55hz,1h),8.01(dd,j1＝8.60hz,j2＝1.70hz,1h),7.41(d,j＝8.55hz, 1h),7.20(d,j＝9.00hz,1h),6.33(dd,j1＝8.95hz,j2＝1.90hz,1h),6.13 (d,j＝2.00hz,1h),4.40(q,j＝7.15hz,2h),3.42(q,j＝7.15hz,4h),1.43(t, j＝7.15hz,3h),1.23(t,j＝7.15hz,6h)；esi-ms:m/z[m h]

calcd for: c
23h24
n3o4:406.1；found 406.1.
[0056]
第三实施例
[0057]
一种硫化氢检测荧光探针的制备方法，参考反应路线2，包括步骤：
[0058][0059]
(1)称取0.5mmol第一实施例合成的式3所述的粘度和极性响应型平台荧光探针、0.6mmol 2,4-二硝基氟苯、0.55mmol三乙胺及10ml二氯甲烷于三颈烧瓶中；上述混合物于35℃下反应加热。
[0060]
(2)tlc监测反应完全，将反应液冷却室温，反应液用去离子水萃取洗涤三次，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂得到粗产物。粗产物用乙醇和二氯甲烷(乙醇：二氯甲烷＝1：1)的混合液重结晶，抽滤后得到红色固体即为所述硫化氢检测荧光探针，如式4所示。
[0061]
本实施例合成的式4所示的硫化氢检测荧光探针的核磁共振氢谱如图 3所示，由图3可确定所述硫化氢检测荧光探针的结构式4所示。
[0062]
本实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针的结构表征数据如下：1hnmr(500mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.94(s,1h),8.92(d,j＝ 2.75hz,1h),8.35(dd,j1＝9.20hz,j2＝2.75hz,1h),8.28(d,j＝1.75hz, 1h),8.25(d,j＝9.15hz,1h),8.03(dd,j1＝8.70hz,j2＝1.80hz,1h),7.43 (d,j＝8.60hz,1h),7.10(d,j＝9.30hz,1h),6.73(dd,j1＝9.15hz,j2＝2.50 hz,1h),6.25(d,j＝2.50hz,1h),4.43(q,j＝7.10hz,2h),3.49(q,j＝7.05 hz,4h),1.44(t,j＝7.15hz,3h),1.27(t,j＝6.95hz,6h)；esi-ms:m/z [m h]

calcd for:c
29h26
n5o8:572.1；found 572.2.
[0063]
第四实施例
[0064]
一种硫化氢检测荧光探针的制备方法，参考上述反应路线2，包括步骤：
[0065]
(1)称取0.5mmol第一实施例合成的式3所述的粘度和极性响应型平台荧光探针、0.6mmol 2,4-二硝基氟苯、0.55mmol三乙胺及10ml乙腈于三颈烧瓶中；上述混合物于35℃
下反应加热。
[0066]
(2)tlc监测反应完全，停止反应，旋蒸除去溶剂，用10ml二氯甲烷溶解产物，饱和食盐水洗涤三次，有机层用无水硫酸钠干燥，后旋蒸除去溶剂得到粗产物。粗产物用乙醇和二氯甲烷(乙醇：二氯甲烷＝1：1)的混合液重结晶，抽滤后得到红色固体即为所述硫化氢检测荧光探针，如式 4所示。
[0067]
本实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针的结构表征数据如下：1hnmr(500mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.94(s,1h),8.92(d,j＝ 2.75hz,1h),8.35(dd,j1＝9.20hz,j2＝2.75hz,1h),8.28(d,j＝1.75hz, 1h),8.25(d,j＝9.15hz,1h),8.03(dd,j1＝8.70hz,j2＝1.80hz,1h),7.43 (d,j＝8.60hz,1h),7.10(d,j＝9.30hz,1h),6.73(dd,j1＝9.15hz,j2＝2.50 hz,1h),6.25(d,j＝2.50hz,1h),4.43(q,j＝7.10hz,2h),3.49(q,j＝7.05 hz,4h),1.44(t,j＝7.15hz,3h),1.27(t,j＝6.95hz,6h)；esi-ms:m/z [m h]

calcd for:c
29h26
n5o8:572.1；found 572.2.
[0068]
第五实施例
[0069]
一种硫化氢检测荧光探针的制备方法，参考反应路线3，包括步骤：
[0070][0071]
(1)称取0.5mmol第一实施例合成的式3所述的粘度和极性响应型平台荧光探针、0.5mmol 2,4-二硝基氟苯、0.5mmol碳酸钾及10ml二氯甲烷于三颈烧瓶中；上述混合物于35℃下反应加热。
[0072]
(2)tlc监测反应完全，将反应液冷却室温，反应液用去离子水萃取洗涤三次，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂得到粗产物。粗产物用乙醇和二氯甲烷(乙醇：二氯甲烷＝1：1)的混合液重结晶，抽滤后得到红色固体即为所述硫化氢检测荧光探针，其核磁共振氢谱显示结构如式5所示。
[0073]
第六实施例
[0074]
一种硫化氢检测荧光探针的制备方法，参考反应路线4，包括步骤：
[0075][0076]
(1)称取0.6mmol第一实施例合成的式3所述的粘度和极性响应型平台荧光探针、0.9mmol 2,4-二硝基氟苯、0.9mmol三乙胺及10ml氯仿于三颈烧瓶中；上述混合物于35℃下
反应加热。
[0077]
(2)tlc监测反应完全，将反应液冷却室温，反应液用去离子水萃取洗涤三次，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂得到粗产物。粗产物用乙醇和二氯甲烷(乙醇：二氯甲烷＝1：1)的混合液重结晶，抽滤后得到红色固体即为所述硫化氢检测荧光探针，其核磁共振氢谱显示结构如式6所示。
[0078]
性能指标测试
[0079]
1、称取第一实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子 (式3)，溶于dmso中、配制成1mm的探针分子溶液；取上述1mm 的探针分子溶液于甘油-水组成的不同粘度体系中、配制成10μm/l的探针溶液。
[0080]
(1)测试所述探针溶液中的荧光强度的变化，结果如图4所示。由该图4可知，所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子对溶液体系的不同粘度表现出独特的敏感性，荧光强度随着体系粘度的增大而增强。
[0081]
(2)测试所述该探针溶液的荧光强度与体系粘度进行线性拟合，结果如图5所示。由该图5可知，所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子在 530nm处的荧光强度与体系的粘度之间有良好的线性关系(r2＝0.99)，可作为一种优良的粘度变化荧光探针。
[0082]
2、称取第一实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子 (式3)，溶于dmso中，配制成1mm的探针分子溶液；取上述1mm 的探针分子溶液于不同极性溶剂(包括：乙酸乙酯(etoac)、甲醇(meoh)、乙醇(etoh)、异丙醇(ipa)、二甲基亚砜(dmso)、水(h2o))中、配制成10 μm/l的不同极性溶剂的探针溶液。分别测试该不同极性溶剂的探针溶液的荧光发射，结果如图6所示。由该图可知，探针分子对不同极性的溶剂表现出独特的敏感性，在不同溶剂中具有不同的荧光发射波长。
[0083]
3、称取第一实施例合成的所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子 (式3)，溶于dmso中、配制成1mm的探针分子溶液；取上述1mm 的探针分子溶液于不同极性溶剂(包括：乙酸乙酯(etoac)、甲醇(meoh)、乙醇(etoh)、异丙醇(ipa)、二甲基亚砜(dmso)、水(h2o))中配制成10μm/l 的不同极性溶剂的探针溶液。
[0084]
(1)分别测试所述不同极性溶剂的探针溶液的荧光发射波长的定量关系图，结果如图7所示。由图7可知，所述粘度和极性响应型平台荧光探针分子在这些溶剂中的最大发射波长与介电常数呈定量关系(r2＝0.99)，说明探针分子可用于环境极性变化的定量分析。
[0085]
4、称取第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)，溶于dmso 中、配制成1mm的探针分子溶液。取该探针分子溶液于tirs-hcl缓冲溶液中(dmso/h2o＝1/1,v/v,ph＝7.4)、配制成10μm/l的探针缓冲液。
[0086]
向三份相同的所述探针缓冲液中加入分析物：阳离子和阴离子(al
3
、 ca
2
、cd
2
、co
2
、cr
3
、cu
2
、k

、ni
2
、tb
3
、zn
2
、mg
2
、s2o
32-、so
32-、 so
42-、hs-、hso
3-、hso
4-、no
3-、s
2-、阴离子的钠盐)、氨基酸(甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸)、生物硫醇(半胱氨酸、谷氨酸)，得到三种浓度均为200μm/l的分析物溶液。
[0087]
测试上述三种分析物溶液的荧光光谱和荧光强度，结果如图8、图9所示。由图8、图9可知，所述分析物溶液在硫化氢氛围中荧光强度发生明显改变，荧光发射峰530nm左右，而在其它分析物氛围中并未发现显著的荧光变化。上述实验证实，所述硫化氢检测荧光探针
(式4)可用于硫化氢分子的特异性识别。
[0088]
5、称取第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)，溶于dmso 中、配制成1mm的探针分子溶液。取该探针分子溶液于tirs-hcl缓冲溶液中(dmso/h2o＝1/1,v/v,ph＝7.4)、配制成10μm/l的探针缓冲液。
[0089]
向三份相同的所述探针缓冲液中加入分析物：阳离子和阴离子(al
3
、 ca
2
、cd
2
、co
2
、cr
3
、cu
2
、k

、ni
2
、tb
3
、zn
2
、mg
2
、s2o
32-、so
32-、 so
42-、hs-、hso
3-、hso
4-、no
3-、s
2-、阴离子的钠盐)、氨基酸(甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸)、生物硫醇(半胱氨酸、谷氨酸)，得到三种浓度均为200μm/l的分析物溶液。
[0090]
再向三种所述分析物溶液中分别加入200μm/l的硫化钠。测试得到的三种分析物溶液(含有硫化钠)反应前后530nm处的荧光强度，结果如图 10所示。由该图可知，所述硫化氢检测荧光探针(式4)在其它干扰物氛围中并未发现显著的荧光变化，而向干扰物中加入硫化氢后荧光强度发生明显改变，说明该探针分子可用于硫化氢分子的特异性识别。
[0091]
6、称取第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)，溶于dmso 中、配制成1mm的探针分子溶液。取该探针分子溶液于tirs-hcl缓冲溶液中(dmso/h2o＝1/1,v/v,ph＝7.4)、配制成10μm/l的探针缓冲液。
[0092]
向所述探针缓冲液中加入200μm/l的硫化钠并测试反应不同时间点的荧光强度，结果如图11所示。由该图可知，在530nm处的发射在10min 内几乎达到饱和，荧光增强了95倍，说明该探针分子对硫化氢响应快速。
[0093]
7、称取第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)，溶于dmso 中、配制成1mm的探针分子溶液。取该探针分子溶液于tirs-hcl缓冲溶液中(dmso/h2o＝1/1,v/v,ph＝7.4)、配制成10μm/l的探针缓冲液。
[0094]
向所述探针缓冲液中加入不同浓度的硫化钠并测试荧光强度，记录探针溶液的荧光强度随硫化氢浓度的变化，结果如图12所示。由该图可知，在硫化氢浓度为2～200μm范围内，探针溶液的荧光强度随着硫化氢浓的增加逐渐增加。探针溶液的荧光强度与硫化氢浓度进行线性拟合，结果如图 13所示。由该图可知，在浓度范围为0～20μm的范围内，探针溶液荧光强度与硫化氢浓度间存在线性关系，可用于硫化氢的定量检测。
[0095]
8、称取第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)，溶于dmso 中、配制成的探针分子母液。
[0096]
采用dmem培养基培养hela细胞；以所述探针分子母液为母液，使用mtt法测试不同浓度的所述探针分子母液处理后hela细胞存活率，结果如图14所示。由该图可知，所述硫化氢检测荧光探针(式4)在0～100μm 浓度下对细胞几乎无毒，细胞存活率高。
[0097]
9、采用第三实施例合成的所述硫化氢检测荧光探针(式4)于dmem 培养基中培养hela细胞12小时，然后将上述细胞于含200μm硫化钠的 dmem培养基中孵育12小时，在荧光共聚焦显微镜上对上述细胞进行荧光成像，结果如图15所示。由该图可知，由该图可知，荧光探针对细胞内硫化氢具有较高的信噪比，可以作为高对比度成像探针检测活细胞外源硫化氢。
[0098]
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范
围应以所描述的根据权利要求为准。