二氢吡唑并嘧啶酮衍生物的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一类二氢吡唑并嘧啶酮衍生物化合物、其药学上可接受的盐、及其立体异构体，含有所述化合物、其药学上可接受的盐及其立体异构体的药物组合物及制剂，制备所述化合物、其药学上可接受的盐及其立体异构体的方法，以及所述化合物、其药学上可接受的盐及其立体异构体的用途。


背景技术：

2.癌症是全世界难治疗的恶性疾病，治疗难度大，死亡率高。2018年最新的全球肿瘤统计结果显示，目前为止，全球估计有1819万癌症新增病例以及960万癌症死亡病例。2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。每年全国恶性肿瘤发病约392.9万人，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5人被确诊为癌症。癌症已成为影响我国居民健康的主要疾病，癌症防治也面临着严峻的形式。
3.目前，放疗以及化疗是除手术切除外治疗癌症的最有效手段，同时放疗是对恶性肿瘤最有效的非手术治疗方法。放射线和相当多的抗癌药物均可导致dna损伤。dna损伤后，会引发受损dna修复等一系列细胞反应，以提高肿瘤细胞的存活，这也是肿瘤细胞对放化疗抵抗的机制之一。损伤的dna如果不及时和完整修复，肿瘤细胞则会因细胞凋亡或/和有丝分裂障碍导致细胞死亡。因此，只要抑制这些dna损伤的修复，就可以提高癌细胞对放化疗的敏感性，抑制细胞增殖。
4.wee1蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，最早由nurse等人在裂殖酵母细胞(s.pombe)中分离出来。在人体中，wee1含有647个氨基酸，具有96kda的分子量。dna单链损伤修复的通路中，wee1处于atr信号通路的下游，在atr信号通路激活之后，随之磷酸化chk1，活化的chk1会激活wee1，同时抑制cdc25(解除cdk1/cyclin b复合物的磷酸化，恢复其调控细胞周期的活性)，进而磷酸化cdk1/cyclin b，使cdk1/cyclin b复合物进入非活跃状态，使细胞周期在g2/m期阻滞，为dna损伤修复赢得时间；除此之外，weel还可以通过磷酸化cdk2，阻滞细胞周期s期，调控dna复制过程中出现的dna双链断裂的修复。
5.在整个ddr(dna damage repair)通路中，wee1主要在g2/m期检查点发挥作用。对于p53突变的肿瘤细胞，由于本身存在g1/s检查点缺陷，因此更加依赖于g2/m期检查点来修复dna损伤，从机制而言，wee1抑制剂对p53突变的肿瘤细胞更加敏感。此外，wee1抑制剂还可以与ddr通路上的其他靶点进行联合，例如肿瘤细胞存在atm缺陷/突变、与atr抑制剂进行联用等，可以更完全地阻断dna的损伤修复，实现“协同致死”效应。
6.综上所述，wee1激酶抑制剂不仅可协同增强放疗和化疗效果，有效抑制肿瘤生长，还可降低对正常细胞的损伤和减少副作用。目前，该靶点药物的研究仍处于临床实验阶段，尚无药物上市。因此，开发一款高效的wee1激酶抑制剂具有重要的临床意义，无论是单用还是联合其他药物应用均有广阔的市场前景。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的、对wee1有抑制活性的二氢吡唑并嘧啶酮衍生物化合物。进一步的，该类化合物可用于抑制wee1激酶活性，从而增强机体对肿瘤的免疫作用。更进一步的，该类化合物还可用于治疗由wee1所介导的一种或多种疾病，尤其是癌症。该类化合物对多种癌细胞具有良好的抑制作用，在生物体内具有较高的暴露量和较好的体内药效。
8.本发明的技术方案如下：
9.在一方面，本发明提供了如下通式(i)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，
[0010][0011]
其中，
[0012]
x1、x2、x3分别独立地选自-c(r2)-或-n-；
[0013]
x4、x5分别独立地选自-ch-或-n-；
[0014]
每个l分别独立地选自-c(r3)(r4)-、-o-、-n(r5)-或-s-；
[0015]
环a选自任选被1-4个q1取代的3-10元环烷基、3-10元杂环基、6-10元芳基或5-10元杂芳基；
[0016]
环b选自任选被1-4个q2取代的3-10元环烷基、3-10元杂环基、6-10元芳基或5-10元杂芳基；
[0017]
环c选自任选被1-4个q3取代的5-15元桥环基、5-10元螺环基、5-15元桥杂环基或5-10元螺杂环基，其中所述的5-15元桥环基、5-10元螺环基、5-15元桥杂环基或5-10元螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0018]
每个q1分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0019]
每个q2、每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基、卤代c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷硫基、羟基c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷硫基、氨基c
1-6
烷氧基、氨基c
1-6
烷硫基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0020]
r1选自任选被取代基取代的c
1-6
烷基、c
2-6
烯基或c
2-6
炔基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷基羰基；
[0021]
r2、r3、r4、r5分别独立的选自氢、卤素、羟基、氨基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷氧基或c1-6
烷基羰基；
[0022]
m、n分别独立地选自0、1、2或3。
[0023]
在某些实施方案中，所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，其中，
[0024]
环a选自任选被1-4个q1取代的3-8元单环环烷基、3-8元单杂环基、苯基或5-8元单杂芳基；
[0025]
每个q1分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0026]
环b选自任选被1-4个q2取代的苯基或5-8元单杂芳基；
[0027]
每个q2分别独立的选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基、卤代c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷硫基、羟基c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷硫基、氨基c
1-6
烷氧基、氨基c
1-6
烷硫基；
[0028]
环c选自任选被1-4个q3取代的5-15元桥杂环基或5-10元螺杂环基，其中所述的5-15元桥杂环基或5-10元螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0029]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基、卤代c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷硫基、羟基c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷硫基、氨基c
1-6
烷氧基或氨基c
1-6
烷硫基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0030]
r1选自任选被取代基取代的c
1-6
烷基、c
2-6
烯基或c
2-6
炔基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷基羰基；
[0031]
r2、r3、r4、r5分别独立的选自氢、卤素、羟基、氨基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷基羰基；
[0032]
m、n分别独立地选自0、1或2。
[0033]
在某些实施方案中，环a选自任选被1-3个q1取代的苯基或5-6元含氮单杂芳基；
[0034]
每个q1分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0035]
在某些实施方案中，环a选自被1个q1取代的苯基或5-6元含氮单杂芳基；
[0036]
优选的，环a选自被1个q1取代的苯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；q1选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基。
[0037]
在某些实施方案中，环a选自被1个q1取代的苯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；q1选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-6元环烷基、-(ch2)
m-3-6元杂环烷基、-(ch2)
m-5-6元杂芳基或-(ch2)
m-6-8元芳基。
[0038]
在某些实施方案中，环a选自被1个q1取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；q1选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基或羧基。
[0039]
在某些实施方案中，环b选自任选被1个或2个q2取代的苯基或5-6元单杂芳基；每个q2分别独立的选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或氨基c
1-6
烷氧基。
[0040]
在某些实施方案中，环b选自任选被1个或2个q2取代的苯基、吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；每个q2分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或氨基c
1-6
烷氧基。
[0041]
在某些实施方案中，环b选自任选被1个或2个q2取代的苯基、吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；每个q2分别独立的选自氟、氯、溴、碘、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、一氟甲氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。
[0042]
在某些实施方案中，环a选自任选被1-3个q1取代的苯基或5-6元含氮单杂芳基；
[0043]
每个q1分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-3-10元环烷基、-(ch2)
m-3-10元杂环烷基、-(ch2)
m-5-10元杂芳基或-(ch2)
m-6-10元芳基；
[0044]
环b选自任选被1个或2个q2取代的苯基或5-6元单杂芳基；每个q2分别独立的选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或氨基c
1-6
烷氧基。
[0045]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-4个q3取代的5-15元含氮桥杂环基或5-10元含氮螺杂环基，其中所述的5-15元含氮桥杂环基或5-10元含氮螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0046]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基、卤代c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷硫基、羟基c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷硫基、氨基c
1-6
烷氧基或氨基c
1-6
烷硫基。
[0047]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-9元含氮桥杂环基或7-9元含氮螺杂环基，其中所述的7-9元含氮桥杂环基或7-9元含氮螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0048]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基或羟基c
1-6
烷氧基。
[0049]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-8元含氮桥杂环基或7-8元含氮螺杂环基，其中所述的7-8元含氮桥杂环基或7-8元含氮螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0050]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0051]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-8元含1-2个氮的桥杂环基或7-8元含1-2个氮的螺杂环基，其中所述的桥杂环基或螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0052]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0053]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-8元含2个氮的桥杂环基或7-8元含2个氮的螺杂环基，其中所述的桥杂环基或螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0054]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0055]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的如下基团：
[0056][0057]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0058]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-9元含氮桥杂环基，其中所述的7-9元含氮桥杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0059]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-8元含1-2个氮的桥杂环基，其中所述的桥杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0060]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0061]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：2-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，7-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基，3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-烯基或3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0062]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0063]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：
[0064][0065]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0066]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：2-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，7-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基或3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0067]
每个q3分别独立地选自氟、氯、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、羟基甲基、羟基乙基、羟基异丙基、三氟甲基、三氟甲氧基或环丙基。
[0068]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基或3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0069]
每个q3分别独立地选自氟、氯、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、羟基甲基、羟基乙基、羟基异丙基、三氟甲基、三氟甲氧基或环丙基。
[0070]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-9元含氮螺杂环基，其中所述的7-9元含氮螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0071]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0072]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的7-8元含1-2个氮的螺杂环基，其中所述的螺杂环基中的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0073]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0074]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：5-氮杂螺[2.4]庚烷基，2-氮杂螺[3.3]庚烷基，2-氮杂螺[3.5]壬烷基，2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷基，2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷基，2,5-二氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基，6-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[3.4]辛烷基，6-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[4.4]壬烷基，2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷基，6-氮杂螺[3.4]辛-7-烯基，2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛-7-烯基或2-氮杂螺[4.4]壬-7-烯基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0075]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0076]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：
[0077][0078]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基、羟基c
1-6
烷氧基或3-4元环烷基。
[0079]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：5-氮杂螺[2.4]庚烷基，2-氮杂螺[3.3]庚烷基，2-氮杂螺[3.5]壬烷基，2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷基，2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷基，2,5-二氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基，6-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[3.4]辛烷基，6-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[4.4]壬烷基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0080]
每个q3分别独立地选自氟、氯、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、羟基甲基、羟基乙基、羟基异丙基、三氟甲基、三氟甲氧基或环丙基。
[0081]
在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷基，2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷基，2,5-二氮杂螺[3.4]辛烷基，其中，所述基团成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0082]
每个q3分别独立地选自氟、氯、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、羟基甲基、羟基乙基、羟基异丙基、三氟甲基、三氟甲氧基或环丙基。在某些实施方案中，环c选自任选被1-2个q3取代的下列基团：2-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，7-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷基，2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基，3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基，3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷基，2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷基，8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基，3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-6-烯基，3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷基，5-氮杂螺[2.4]庚烷基，2-氮杂螺[3.3]庚烷基，2-氮杂螺[3.5]壬烷基，2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷基，2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷基，2,5-二氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基，6-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[3.4]辛烷基，6-氮杂螺[3.4]辛烷基，2-氮杂螺[4.4]壬烷基，2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷基，6-氮杂螺[3.4]辛-7-烯基，2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛-7-烯基或2-氮杂螺[4.4]壬-7-烯基，其中，所述基团的成环碳原子可任选的被氧取代形成羰基；
[0083]
每个q3分别独立地选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基或羟基c
1-6
烷氧基。
[0084]
在某些实施方案中，r1选自任选被取代基取代的c
2-4
烯基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基。
[0085]
在某些实施方案中，r1选自任选被取代基取代的-ch
2-ch＝ch2，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基。
[0086]
在某些实施方案中，r1选自-ch
2-ch＝ch2。
[0087]
在某些实施方案中，本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，其中，x1、x2、x3分别独立地选自-c(r2)-或-n-；
[0088]
x4、x5分别独立地选自-ch-或-n-；
[0089]
每个l分别独立地选自-c(r3)(r4)-、-o-、-n(r5)-或-s-；
[0090]
r2、r3、r4、r5分别独立地选自氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基；
[0091]
r1选自任选被取代基取代的c
2-6
烯基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基。
[0092]
在某些实施方案中，r2、r3、r4、r5分别独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基或三氟甲氧基。
[0093]
在某些实施方案中，x1、x2、x3分别独立地选自-c(r2)-或-n-；
[0094]
x4、x5分别独立地选自-ch-或-n-；
[0095]
每个l分别独立地选自-c(r3)(r4)-、-o-、-n(r5)-或-s-；
[0096]
r2、r3、r4、r5分别独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基或三氟甲氧基；
[0097]
r1选自任选被取代基取代的c
2-6
烯基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基、卤代c
1-6
烷基、羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基。
[0098]
在某些实施方案中，r1选自任选被取代基取代的c
2-4
烯基，优选任选被取代基取代的丙烯-3-基，所述取代基分别独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷基或卤代c
1-6
烷氧基。
[0099]
在某些实施方案中，x1、x2分别独立地选自-n-。
[0100]
在某些实施方案中，x3为-ch-。
[0101]
在某些实施方案中，x4、x5分别独立地为-n-。
[0102]
在某些实施方案中，本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，具有如下通式(ii)所示的结构：
[0103][0104]
其中，环a、环b、环c、q1、q2、q3、l、r3、r4、r5、r1、m、n的定义如前文所述。
[0105]
在某些实施方案中，本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，具有如下通式(iii)所示的结构：
[0106][0107]
其中，环a、环b、环c、q1、q2、q3、l、r3、r4、r5、m、n的定义如前文所述。
[0108]
在某些实施方案中，本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，具有如下通式(iii)所示的结构：
[0109][0110]
其中，环a选自被1个q1取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；q1选自氟、氯、溴、羟基、氨基、硝基、氰基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述取代基分别独立地选自氟、氯、溴、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-环丙烷基、-(ch2)
m-环丁烷基、-(ch2)
m-环戊烷基或-(ch2)
m-环己烷基；
[0111]
环b为苯基或吡啶基；
[0112]
每个l分别独立地选自-c(r3)(r4)-或-n(r5)-；r3、r4、r5分别独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、一氟甲氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基；
[0113]
m选自0、1或2；n为1。
[0114]
在某些实施方案中，本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，其中，
[0115]
环a选自被1个q1取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；q1选自氟、氯、溴、羟基、氨基、硝基、氰基或任选被1-3个取代基取代的如下基团：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述取代基分别独立地选自氟、氯、溴、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、-(ch2)
m-环丙烷基、-(ch2)
m-环丁烷基、-(ch2)
m-环戊烷基或-(ch2)
m-环己烷基；
[0116]
环b选自苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基。
[0117]
在某些实施方案中，环b为苯基或吡啶基。
[0118]
在某些实施方案中，每个l分别独立地选自-c(r3)(r4)-或-n(r5)-；r3、r4、r5分别独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、一氟甲氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。
[0119]
在某些实施方案中，每个l分别独立地选自-n(r5)-；r5分别独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；优选的，l为nh。
[0120]
在某些实施方案中，m选自0、1或2。
[0121]
在某些实施方案中，n选自0、1或2；优选的，n为1。
[0122]
本发明中各技术方案之间可以相互组合形成新的技术方案，所形成的新的技术方
案同样包括在本发明的范围之内。
[0123]
在某些实施方案，前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所示的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，选自如下化合物：
[0124][0125][0126]
本发明还提供了一种药物组合物，其含有前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，及一种或多种药用载体和/或稀释剂；所述药物组合物可以制成临床上或药学上可接受的任一剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、栓剂、吸入剂或喷雾剂等。
[0127]
在本发明的某些实施方案中，上述药物制剂可以以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。用于口服给药时，所述药物组合物可制成口服制剂，例如可以制成常规的口服固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，上述药物制剂也可制成注射剂、包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配置注射剂时，可以不加入附加剂，也可以根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，所述药物组合物可制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物组合物可制成吸入剂或喷雾剂等。
[0128]
本发明的药物组合物或药物制剂中可用的药用载体和/或稀释剂可以是药物制剂领域中任何常规的载体和/或稀释剂，特定载体和/或稀释剂的选择将取决于用于治疗特定
患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。
[0129]
在另一方面，本发明还涉及前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所述化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体在制备预防和/或治疗由wee1所介导的疾病及相关疾病的药物中的用途，所述药物可与一种或多种其他药物联用以预防或治疗由wee1所介导的疾病及相关病症。所述疾病及相关病症选自癌症或良性肿瘤，所述癌症包括原位癌和转移的癌症。进一步的，所述癌症包括但不限于肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌、甲状腺癌、雌性生殖道癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、白血病、胶质瘤或肉瘤等。
[0130]
进一步的，本发明还涉及含有前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所述化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物制剂在制备药物中的用途，所述药物可与一种或多种药物联用以治疗及/或预防由wee1所介导的疾病及相关病症。
[0131]
在另一方面，本发明涉及的含有前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所述化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物可以单独给药，或者与一种或多种第二治疗活性剂联合使用，所述第二治疗活性剂与本技术的wee1抑制剂化合物组合用于治疗和/或预防由wee1所介导的疾病和相关病症。因此，在某些实施方案中，所述的药物组合物还含有一种或多种第二治疗活性剂。在某些实施方案中，所述的第二治疗活性剂选自抗癌剂，包括有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、反义dna或rna、抗肿瘤抗生素、生长因子抑制剂、信号传导抑制剂、细胞周期抑制剂、酶抑制剂、类维生素a受体调控剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、激素类药物、血管再生抑制剂、细胞生长抑制剂、靶向抗体、hmg-coa还原酶抑制剂和异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂。
[0132]
在某些实施方案中，待组合的各成分(例如，本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体与第二治疗活性剂)可同时给药或依次顺序地分开用药。例如，可以在施用本发明化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体之前、同时或之后，施用第二治疗活性剂。此外，待组合的各成分还可以以同一制剂形式或以分开的不同制剂的形式联合给药。
[0133]
在另一方面，本发明还提供了一种治疗由wee1介导的疾病及相关病症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的前述通式(i)所述的化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体，前述制剂或药物组合物；所述由wee1介导的疾病及相关病症如上定义。
[0134]
所述的“有效量”是指能够减轻、延缓、抑制或治愈受试者病症的药物剂量。给药剂量的大小与药物给药方式、药剂的药代动力学、疾病的严重程度、受试者的个性体征(性别、体重、身高、年龄)等来确定。
[0135]
本发明涉及的含有前述通式(i)、通式(ii)或通式(iii)所述化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体的药物还可通过与放疗组合，提高放疗的治疗效果，即可作为放疗敏化剂使用。
[0136]
在另一方面，本发明化合物在癌症治疗领域还可作为其他抗癌剂的敏化剂使用。所述抗癌剂如前所述。所述敏化剂表示，在癌症治疗领域，通过与放疗和或使用抗癌剂的化学疗法组合使用，相加或协同地提高这些放疗和/或化学疗法的治疗效果的药物。
[0137]
【发明详述】
[0138]
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义，然而为了更好的理解本发明，下面提供了部分术语的定义。当本发明所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不符的时候，以本发明所提供的术语的定义和解释为准。
[0139]
本发明所述的“卤素”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
[0140]
本发明所述的“c
1-6
烷基”表示直链或支链的含有1-6个碳原子的烷基，包括例如“c
1-4
烷基”、“c
1-3
烷基”、“c
1-2
烷基”、“c
2-6
烷基”、“c
2-5
烷基”、“c
2-4
烷基”、“c
2-3
烷基”、“c
3-6
烷基”、“c
3-5
烷基”、“c
3-4
烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。本发明所述的“c
1-4
烷基”指c
1-6
烷基中的含有1-4个碳原子的具体实例。
[0141]
本发明所述的“c
1-6
烷氧基”是指“c
1-6
烷基-o
‑”
，所述的“c
1-6
烷基”如前文所定义。本发明所述的“c
1-4
烷氧基”是指“c
1-4
烷基-o
‑”
，所述的“c
1-4
烷基”如前文所定义。
[0142]
本发明所述的“c
1-6
烷硫基”是指“c
1-6
烷基-s
‑”
，所述的“c
1-6
烷基”如前文所定义。本发明所述的“c
1-4
烷硫基”是指“c
1-4
烷基-s
‑”
，所述的“c
1-4
烷基”如前文所定义。
[0143]
本发明所述的“羟基c
1-6
烷基、氨基c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基”是指c
1-6
烷基中的一个或多个氢分别被一个或多个羟基、氨基或卤素所取代。c
1-6
烷基如前文所定义
[0144]
本发明所述“羟基c
1-6
烷氧基、氨基c
1-6
烷氧基、卤代c
1-6
烷氧基”是指“c
1-6
烷氧基”中的一个或多个氢被一个或多个羟基、氨基或卤素所取代。
[0145]
本发明所述“羟基c
1-6
烷硫基、氨基c
1-6
烷硫基、卤代c
1-6
烷硫基”是指“c
1-6
烷硫基”中的一个或多个氢被一个或多个羟基、氨基或卤素所取代。
[0146]
本发明所述的“c
1-6
烷基氨基、二(c
1-6
烷基)氨基”分别是指c
1-6
烷基-nh-、
[0147]
本发明所述的“c
2-6
烯基”是指含有至少一个双键且碳原子数为2-6的直链、支链或环状的烯基，包括例如“c
2-4
烯基”等。其实例包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基、环戊烯基、1,3-环戊二烯基、环己烯基、1,4-环己二烯基等。
[0148]
本发明所述的“c
2-6
炔基”是指含有至少一个三键且碳原子数为2-6的直链或支链的炔基，包括例如“c
2-4
炔基”等。其实例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、5-甲基-2-己炔基等。
[0149]
本发明所述的“3-10元环烷基”是指包括“3-8元单环烷基”和“8-10元稠环烷基”。
[0150]
本发明所述的“3-8元单环烷基”是指含有3-8个碳原子的饱和或部分饱和的且不具有芳香性的单环环状烷基，包括“3-8元饱和单环烷基”和“3-8元部分饱和单环烷基”；优选“3-4元单环烷基”、“3-5元单环烷基”、“3-6元单环烷基”、“3-7元单环烷基”、“4-5元单环烷基”、“4-6元单环烷基”、“4-7元单环烷基”、“4-8元单环烷基”、“5-6元单环烷基”、“5-7元
单环烷基”、“5-8元单环烷基”、“6-7元单环烷基”、“6-8元单环烷基”、“7-8元单环烷基”、“3-6元饱和单环烷基”、“5-8元饱和单环烷基”、“5-7元饱和单环烷基”、“5-6元饱和单环烷基”等。所述的“3-8元饱和单环烷基”的具体实例包括但不限于：环丙烷基(环丙基)、环丁烷基(环丁基)、环戊烷基(环戊基)、环己烷基(环己基)、环庚烷基(环庚基)、环辛烷基(环辛基)等；所述的“3-8元部分饱和单环烷基”的具体实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己-1,3-二烯、环己-1,4-二烯、环庚烯基、环庚-1,3-二烯基、环庚-1,4-二烯基、环庚-1,3,5-三烯基，环辛烯基、环辛-1,3-二烯基、环辛-1,4-二烯基、环辛-1,5-二烯基、环辛-1,3,5-三烯基、环辛四烯基等。
[0151]
本发明所述的“8-10元稠环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的碳原子所形成的含有8-10个环原子的、饱和或部分饱和的、非芳香性环状基团，所述的稠环中的一个环可以为芳香性环，但稠环整体不具备芳香性；包括“8-9元稠环基”、“9-10元稠环基”等，其稠和方式可以为：5-6元环烷基并5-6元环烷基、苯并5-6元环烷基、苯并5-6元饱和环烷基等。其实例包括但不限于：二环[3.1.0]己烷基、二环[4.1.0]庚烷基、二环[2.2.0]己烷基、二环[3.2.0]庚烷基、二环[4.2.0]辛烷基、八氢并环戊二烯基、八氢-1h-茚基、十氢化萘基、十四氢菲基、双环[3.1.0]己-2-烯基、双环[4.1.0]庚-3-烯基、双环[3.2.0]庚-3-烯基、双环[4.2.0]辛-3-烯基、1,2,3,3a-四氢并环戊二烯基、2,3,3a,4,7,7a-六氢-1h-茚基、1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢化萘基、1,2,4a,5,6,8a-六氢化萘基、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-十氢菲基、苯并环戊基、苯并环己基、苯并环己烯基、苯并环戊烯基等。
[0152]
本发明所述的“3-10元杂环基”包括“3-8元单杂环基”和“8-10元稠杂环基”。
[0153]
本发明所述的“3-8元单杂环基”是指至少含有一个杂原子(例如，含有1个、2个、3个、4个或5个)的且环原子数为3-8个的饱和或部分饱和的且不具有芳香性的单环环状基团，所述杂原子为氮原子、氧原子和/或硫原子，任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。本发明所述的“3-8元单杂环基”包括“3-8元饱和单杂环基”和“3-8元部分饱和单杂环基”。优选地，本发明所述的“3-8元单杂环基”含有1-3个杂原子；优选地，本发明所述的“3-8元单杂环基”含有1-2个杂原子，且所述的杂原子选自氮原子和/或氧原子；优选地，本发明所述的“3-8元单杂环基”含有1个氮原子。所述“3-8元单杂环基”优选“3-7元单杂环基”、“3-6元单杂环基”、“4-7元单杂环基”、“4-6元单杂环基”、“6-8元单杂环基”、“5-7元单杂环基”、“5-6元单杂环基”、“3-6元饱和单杂环基”、“5-6元饱和单杂环基”、“3-6元含氮单杂环基”、“3-6元饱和含氮单杂环基”、“5-6元含氮单杂环基”、“5-6元饱和含氮单杂环基”等。例如，仅包含1个或2个氮原子，或者，包含一个氮原子和其他的1个或2个杂原子(例如氧原子和/或硫原子)。“3-8元单杂环基”的具体实例包括但不仅限于：氮杂环丙烷基、2h-氮杂环丙烷基、二氮杂环丙烷基、3h-二氮杂环丙烯基、氮杂环丁烷基、1,4-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、1,4-二氧杂环己二烯基、四氢呋喃基、二氢吡咯基、吡咯烷基、咪唑烷基、4,5-二氢咪唑基、吡唑烷基、4,5-二氢吡唑基、2,5-二氢噻吩基、四氢噻吩基、4,5-二氢噻唑基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡啶基、哌啶酮基、四氢吡啶酮基、二氢哌啶酮基、哌嗪基、吗啉基、4,5-二氢噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、2,3-二氢异噁唑基、噁唑烷基、2h-1,2-噁嗪基、4h-1,2-噁嗪基、6h-1,2-噁嗪基、4h-1,3-噁嗪基、6h-1,3-噁嗪基、4h-1,4-噁嗪基、4h-1,3-噻嗪基、6h-1,3-噻嗪基、2h-吡喃基、2h-吡喃-2-酮基、3,4-二氢-2h-吡喃基等。
[0154]
本发明所述“8-10元稠杂环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子所形成的含有8-10个环原子的、且至少一个环原子为杂原子的、饱和或部分饱和的、非芳香性环状基团，所述的稠环中其中一个环可以为芳香性环，但稠环整体不具备芳香性，所述杂原子为氮原子、氧原子和/或硫原子，任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代，包括但不限于“8-9元稠杂环基”、“9-10元稠杂环基”等，其稠和方式可以为5-6元杂环基并5-6元杂环基、5-6元杂环基并5-6元环烷基、苯并5-6元杂环基、苯并5-6元饱和杂环基、5-6元杂芳基并5-6元杂环基、5-6元杂芳基并5-6元饱和杂环基；5-6元杂芳基如前文所定义；所述“8-10元稠杂环基”具体实例包括但不仅限于：吡咯烷基并环丙基、环戊基并氮杂环丙基、吡咯烷基并环丁基、吡咯烷基并吡咯烷基、吡咯烷基并哌啶基、吡咯烷基并哌嗪基、吡咯烷基并吗啉基、哌啶基并吗啉基、苯并吡咯烷基、苯并环戊基、苯并环己基、苯并四氢呋喃基、苯并吡咯烷基、苯并咪唑烷基、苯并噁唑烷基、苯并噻唑烷基、苯并异噁唑烷基、苯并异噻唑烷基、苯并哌啶基、苯并吗啉基、苯并哌嗪基、苯并四氢吡喃基、吡啶并环戊基、吡啶并环己基、吡啶并四氢呋喃基、吡啶并吡咯烷基、吡啶并咪唑烷基、吡啶并噁唑烷基、吡啶并噻唑烷基、吡啶并异噁唑烷基、吡啶并异噻唑烷基、吡啶并哌啶基、吡啶并吗啉基、吡啶并哌嗪基、吡啶并四氢吡喃基、嘧啶并环戊基、嘧啶并环己基、嘧啶并四氢呋喃基、嘧啶并吡咯烷基、嘧啶并咪唑烷基、嘧啶并噁唑烷基、嘧啶并噻唑烷基、嘧啶并异噁唑烷基、嘧啶并异噻唑烷基、嘧啶并哌啶基、嘧啶并吗啉基、嘧啶并哌嗪基、嘧啶并四氢吡喃基；四氢咪唑并[4,5-c]吡啶基、3,4-二氢喹唑啉基、1,2-二氢喹喔啉基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、2h-色原烯基、2h-色原烯-2-酮基、4h-色烯基、4h-色烯-4-酮基、4h-1,3-苯并噁嗪基、4,6-二氢-1h-呋喃并[3,4-d]咪唑基、3a,4,6,6a-四氢-1h-呋喃并[3,4-d]咪唑基、4,6-二氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑基、4,6-二氢-1h-吡咯并[3,4-d]咪唑基、八氢-苯并[d]咪唑基、十氢喹啉基、六氢噻吩并咪唑基、六氢呋喃并咪唑基、4,5,6,7-四氢-1h-苯并[d]咪唑基、八氢环戊烯并[c]吡咯基、4h-1,3-苯并噁嗪基等。
[0155]
术语“苯并环戊基”，其结构是指(亦可称之为2,3-二氢-1h-茚基)；术语“苯并吡咯烷”其结构包括等；术语“吡啶并四氢呋喃基”其结构包括其结构包括前文所定义的其他“定义的其它稠杂环基”的具体实例具有与之类似的环状结构。
[0156]
本发明所述的“6-10元芳基”包括“6-8元单环芳基”和“8-10元稠环芳基”。
[0157]
本发明所述的“6-8元单环芳基”是指含有6-8个环碳原子的单环芳基，其实例包括但不限于：苯基、环辛四烯基等；优选苯基。
[0158]
本发明所述的“8-10元稠环芳基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子所形成的、含有8-10个环碳原子的、不饱和的、具有芳香性的环状基团，优选“9-10元稠环芳基”，具体实例如萘基等。
[0159]
本发明所述的“5-10元杂芳基”包括“5-8元单杂芳基”和“8-10元稠杂芳基”。
[0160]
本发明所述的“5-8元单杂芳基”是指含有5-8个环原子(其中至少一个环原子为杂
原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的具有芳香性的单环环状基团。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。“5-8元单杂芳基”包括例如“5-7元单杂芳基”、“5-6元单杂芳基”、“5-6元含氮单杂芳基”、“6元含氮单杂芳基”等，所述的“含氮杂芳基”中的杂原子至少含有一个氮原子，例如，仅包含1个或2个氮原子，或者，包含一个氮原子和其他的1个或2个杂原子(例如氧原子和/或硫原子)，或者，包含2个氮原子和其他的1个或2个杂原子(例如氧原子和/或硫原子)。“5-8元单环杂芳基”的具体实例包括但不仅限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮杂环庚三烯基、1,3-二氮杂环庚三烯基、氮杂环辛四烯基等。所述“5-6元单杂芳基”是指5-8元杂芳基中含有5-6个环原子的具体实例。
[0161]
本发明所述的“8-10元稠杂芳基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子所形成的、含有8-10个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的、不饱和的具有芳香性的环状结构。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。包括“9-10元稠杂芳基”，“8-9元稠杂芳基”等，其稠和方式可以为苯并5-6元杂芳基、5-6元杂芳基并5-6元杂芳基等；具体实例包括但不限于：吡咯并吡咯、吡咯并呋喃、吡唑并吡咯、吡唑并噻吩、呋喃并噻吩、吡唑并噁唑、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、喹啉基、2-喹啉酮基、4-喹啉酮基、1-异喹啉酮基、异喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并哒嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、嘌呤基、萘啶基等。
[0162]
本发明所述的“5-10元螺环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用一个碳原子所形成的、含有5-10个环碳原子的环状结构。任选地，环状结构中的碳原子可以被氧化。“5-10元螺环基”包括例如“4-10元螺环基”、“6-10元螺环基”、“7-10元螺环基”、“6-9元螺环基”、“7-9元螺环基”、“9-10元螺环基”等。具体实例包括但不仅限于：等。具体实例包括但不仅限于：
[0163]
等。所述的“7-9元螺环基”是指5-10元螺环基中含有7-9个环原子的具体实例。
[0164]
本发明所述的“5-15元桥环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个非相邻碳原子所形成的、含有5-15个环碳原子的环状结构。任选地，环状结构中的碳原子可以被氧代。“5-15元桥环基”包括例如“5-11元桥环基”、“6-11元桥环基”、“5-10元桥环基”、“7-10元桥环基”、“6-9元桥环基”、“7-9元桥环基”、“9-10元桥环基”等。具体实例包括但不仅限于：于：
的结构。
[0169]
本发明所述“任选被取代”是指被取代基上的一个或多个氢原子可以被一个或多个取代基“取代”或“不取代”的两种情形。
[0170]
本发明所述的“药学上可接受的盐”指化合物中存在的酸性官能团(例如-cooh、-oh、-so3h等)与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，包括与碱金属或碱土金属形成的盐、铵盐，以及与含氮有机碱形成的盐；以及化合物中存在的碱性官能团(例如-nh2等)与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，包括与无机酸或有机酸(例如羧酸等)形成的盐。
[0171]
本发明所述的“异构体”是指当本发明化合物含有一个或多个不对称中心，因而可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单一非对映异构体。本发明化合物可以有不对称中心，这类不对称中心各自独立地产生两个光学异构体。本发明的范围包括所有可能的光学异构体和它们的混合物。本发明所述的化合物若含有烯烃双键，除非特别说明，包括顺式异构体和反式异构体。本发明所述的化合物可以以互变异构体(官能团异构体的一种)形式存在，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点，例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。本发明化合物含有螺环结构，受环的立体空间结构的影响，环上的取代基可存在于环两侧从而形成相对的顺式(cis)和反式(trans)异构体。各互变异构体及其混合物都包括在本发明的范围中。所有化合物的对映异构体、非对映异构体、外消旋体、内消旋体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物等，均包括在本发明范围中。
[0172]
本发明化合物可通过对映体特异性合成或从对映异构体混合物拆分以得到个别对映异构体的形式制备。常规拆分技术包括使用光学活性酸形成对映异构体对的每一异构体的游离碱的盐(接着分步结晶和游离碱再生)、使用光学活性胺形成对映异构体对的每一对映异构体的酸形式的盐(接着分步结晶和游离酸再生)、使用光学纯酸、胺或醇形成对映异构体对的每一对映异构体中的每一种的酯或酰胺(接着为色谱分离和手性助剂去除)或使用各种众所周知的色谱方法拆分起始物质或最终产物的对映异构体的混合物。
[0173]
当公开的化合物的立体化学通过结构命名或描绘时，命名或描绘的立体异构体相对于其他立体异构体为至少60％重量、70％重量、80％重量、90％重量、99％重量或99.9％重量纯。当单一异构体通过结构命名或描绘时，所描绘或命名的对映异构体为至少60％重量、70％重量、80％重量、90％重量、99％重量或99.9％重量纯。光学纯度重量％为对映异构体的重量与对映异构体重量加上其光学异构体的重量比率。
[0174]
本发明所述的“剂型”指将药物制成的适用于临床使用的形式，包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、含漱剂或栓剂，更优选散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、注射剂、软膏剂、含漱剂或栓剂。
[0175]
发明的有益效果
[0176]
1、本发明化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体具有优异的wee1活性抑制作用，其在生物体内具有良好的药代动力学性质，作用持久，暴露量和生物利用度高，能够治疗和/或预防由wee1介导的疾病。
[0177]
2、本发明化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体对wee1介导的癌症具有较
好的治疗作用。
[0178]
3、本发明化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体可协同增强放疗和化疗效果，有效抑制肿瘤生长，还可降低对正常细胞的损伤并减少副作用。
[0179]
4、本发明化合物制备工艺简单，药品纯度高，质量稳定，易于进行大规模工业生产。
具体实施方案
[0180]
下面将结合具体实施方式对本发明技术方案进行描述，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0181]
实施例1：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(8-甲基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物1)
[0182]
1. 4-(2-烯丙基-2-(叔丁氧基羰基)肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯的制备
[0183][0184]
1-烯丙基肼-1-羧酸叔丁酯(0.37g,21.5mmol)与4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸乙酯(0.5g,21.5mmol)溶于四氢呋喃(100.0ml)，加入n,n-二异丙基乙胺(0.69g,53.8mmol)，70℃反应16h，旋干溶剂，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝25％)得到产物(0.62g,78.5％)。
[0185]
2. 4-(2-烯丙基肼基)-3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-羧酸乙酯的制备
[0186][0187]
4-(2-烯丙基-2-(叔丁氧基羰基)肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(0.62g,16.8mmol)溶于三氟乙酸(50.0ml)中，70℃下反应1小时，旋干得粗品直接用于下一步。
[0188]
3. 2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0189][0190]
4-(2-烯丙基肼基)-3-(甲硫基)-1,2,4-三嗪-6-羧酸乙酯(上步粗品)溶于70.0ml乙醇中，加入氢氧化钠水溶液(25.6ml,179mmol)，20℃反应30分钟，加入3n稀盐酸调节ph至4，二氯甲烷和5％甲醇(50.0ml)萃取，有机相旋干得到粗品4.0g。
[0191]
4. 2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇的制备
[0192][0193]
6-溴吡啶甲酸甲酯(5.0g，23.3mmol)溶于150ml四氢呋喃中，0℃下加入甲基溴化镁溶液(16.0ml,100.0mmol)，置于25℃反应2h，用饱和氯化铵溶液猝灭反应，乙酸乙酯萃取，浓缩柱层析得4.5g，收率90％。
[0194]
5. 2-烯丙基-1-(6-(2-(羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0195][0196]
2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(上步粗品)溶于1,4-二氧六环(150ml)，加入碘化亚铜(3.4g,18.0mmol),碳酸钾(3.5g,25.2mmol),n,n
’‑
二甲基乙二胺(3.2g，36.0mmol)，2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(5.1g,23.4mmol)，95℃反应16h，浓缩柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝50％)得到产物4.0g，三步总收率：66.61％。
[0197]
6.(1r,5s)-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯的制备
[0198][0199]
3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(0.5g,2.4mmol)，溶于n,n-二甲基乙酰胺(10.0ml)，加入1-氟-4-硝基苯(0.33g,2.4mmol)，n,n-二异丙基乙胺(0.9g,7.2mmol)，90℃反应16h，浓缩柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝25％)得到产物(0.33g,41.3％)。
[0200]
7.(1r,5s)-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
[0201][0202]
(1r,5s)-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(0.15g,0.45mmol)，溶于10.0ml二氯甲烷，加入3.0ml三氟乙酸，室温下反应，1h，旋干得190.0mg粗品。
[0203]
8.(1r,5s)-8-甲基-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
[0204][0205]
(1r,5s)-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(上步粗品)溶于12.0ml n,n-二甲基甲酰胺，加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.3g,1.6mmol)，甲醛溶液(0.2g，5.4mmol)，
20℃反应3h，加入10.0ml水猝灭反应，二氯甲烷萃取，浓缩得0.27g。
[0206]
9. 4-((1r,5s)-8-甲基-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)苯胺的制备
[0207][0208]
(1r,5s)-8-甲基-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(0.25g，1.0mmol)，溶于6.0ml甲醇中，0.2g钯碳(10％)，反应1h，浓缩得粗品0.23g。
[0209]
10. 2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(8-甲基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0210][0211]
2-烯丙基-1-(6-(2-(羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(0.29g，0.81mmol)，溶于3.0ml甲苯，加入85％间氯过氧苯甲酸(m-cpba,0.21g,1.2mmol)，室温下反应30分钟，加入n,n-二异丙基乙胺(0.54g,4.2mmol)，4-((1r,5s)-8-甲基-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)苯胺(0.23g,1.1mmol)，室温反应16h，饱和碳酸氢钠猝灭反应，乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩反相柱层析(水/甲醇＝60％)得产物23.0mg，收率5.5％。
[0212]
分子式:c
29h34
n8o2分子量:526.0lc-ms(m/e):527.0(m h

)
[0213]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.81(s,1h),7.84(t,j＝7.8hz,1h),7.75(d,j＝8.0hz,1h),7.51-7.39(m,2h),7.32(d,j＝7.6hz,1h),6.78(d,j＝8.2hz,2h),5.74-5.65(m,1h),5.03(d,j＝10.1hz,1h),4.93(d,j＝17.2hz,1h),4.73(d,j＝6.0hz,2h),3.96(s,1h),3.34(d,j＝10.5hz,2h),3.28(s,2h),3.02(d,j＝10.5hz,2h),2.36(s,3h),2.04-2.03(m,2h),1.79-1.77(m,2h),1.58(s,6h).
[0214]
实施例2：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物2)
[0215]
1. 2-甲基-5-(4-硝基苯基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷的制备
[0216][0217]
将2-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(100mg,0.5mmol)溶于10ml乙腈中，加入1-氟-4-硝基苯(141mg,1.0mmol)和n,n-二异丙基乙胺(323mg,2.5mmol)，60℃下反应16h。浓缩，硅胶柱纯化(甲醇:二氯甲烷＝1:7)得目标化合物74mg，收率60.0％。
[0218]
2. 4-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基)苯胺的制备
[0219][0220]
2-甲基-5-(4-硝基苯基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(70mg,0.28mmol)溶于甲醇(5ml)中，加入钯/碳(40mg)，在氢气氛围下16℃反应1小时。浓缩得到粗品(72mg)直接用于下步反应。
[0221]
3. 2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0222][0223]
2-烯丙基-1-(6-(2-(羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3
–
酮(77mg,0.22mmol)溶于甲苯(10ml)，加入62.5％m-cpba(77mg,0.28mmol)，16℃反应1小时。加入n,n-二异丙基乙胺(148mg,1.14mmol)和4-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基)苯胺(70mg,0.32mmol)，16℃反应5小时。浓缩，用c18柱纯化(水:甲醇＝3:1)得目标化合物29mg，收率25.0％。
[0224]
分子式:c
29h34
n8o2分子量:526.6lc-ms(m/e):527.2(m h

)
[0225]1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.12(s,1h),8.79(s,1h),8.03(s,1h),7.76(d,j＝7.6hz,1h),7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.59-7.52(m,2h),6.64(d,j＝8.4hz,2h),5.76-5.63(m,1h),5.32(s,1h),5.00(d,j＝10.4hz,1h),4.85-4.81(m,1h),4.69-4.67(m,2h),3.86(s,1h),3.63(d,j＝9.6hz,1h),3.23(d,j＝9.2hz,1h),2.90(d,j＝8.8hz,1h),2.33(s,3h),2.03-1.96(m,2h),1.83-1.56(m,3h),1.44(s,6h).
[0226]
实施例3：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(((4-(6-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物3)
[0227]
1. 2-甲基-6-(4-硝基苯基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷的制备
[0228][0229]
将2-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷二盐酸盐(100mg,0.54mmol)，对氟硝基苯(83mg,0.59mmol)和n,n-二异丙基乙胺(349mg,2.7mmol)溶于乙腈(20ml)中，60℃反应6h，反应完成，加入饱和碳酸氢钠(3ml)溶液，浓缩，粗品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝
10:1)得产物(100mg,收率79.1％)。
[0230]
2. 4-(6-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯胺的制备
[0231][0232]
将2-甲基-6-(4-硝基苯基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷(30mg,0.13mmol)溶于甲醇(10ml)中，加入钯/碳(15mg)，在氢气氛围下25℃反应0.5小时。过滤，浓缩得到粗品(28mg)直接用于下步反应。
[0233]
3. 2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(((4-(6-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0234][0235]
将2-烯丙基-1-(6-(2-(羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(32mg，0.09mmol)溶于甲苯(7ml)，加入间氯过氧苯甲酸(20mg，0.12mmol)，25℃反应0.5小时。反应完成。加入n,n-二异丙基乙胺(69mg，0.53mmol)和4-(6-甲基-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯胺(28mg)的甲苯(7ml)溶液,25℃反应18h，浓缩，用c18柱纯化(水:甲醇＝1:4)得目标化合物粗品20mg，用prep-tlc纯化(二氯甲烷:甲醇＝12:1)得目标化合物粗品18mg，高压制备液相纯化(水:甲醇＝1:5)，得产物2.3mg,收率5.0％。
[0236]
分子式:c
28h32
n8o2分子量:512.3lc-ms(m/e):513.2(m h

)
[0237]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.83(s,1h),7.86(t,j＝8.0hz,1h),7.76(d,j＝8.0hz,1h),7.54-7.26(m,4h),6.46(d,j＝8.0hz,2h),5.76-5.67(m,1h),5.07-4.94(m,2h),4.75(d,j＝6.0hz,2h),3.96(s,4h),3.42(s,4h),2.35(s,3h),1.60(s,6h).
[0238]
实施例4：的制备6-(4-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)苯基)-3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮(化合物4)
[0239]
1. 3-甲基-2-氧代-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯的制备
[0240][0241]
2-氧代3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯(106mg,0.5mmol)溶于四氢呋喃(10ml)，加入60％氢化钠(40mg,1mmol)，25℃反应2h，加入碘甲烷(142mg,1mmol)，25℃反应2h，饱和食盐水(20ml)淬灭，乙酸乙酯(30ml)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干得粗品，直接用于下一步。
[0242]
2. 3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮盐酸盐的制备
[0243][0244]
3-甲基-2-氧代-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯的上步粗品溶于4m盐酸二氧六环(2ml)中，20℃下反应16小时，旋干得粗品，直接用于下一步。
[0245]
3. 3-甲基-6-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮的制备
[0246][0247]
3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮盐酸盐上步粗品、1-氟-4-硝基苯(141mg,1mmol)和二异丙基乙胺(194mg,1.5mmol)溶于dma(7ml)中，90℃反应16小时，饱和食盐水(15ml)淬灭，乙酸乙酯(30ml)萃取，有机相旋干中压反相制备(0-40％甲醇/水)得到产物(40mg,32.4％)。
[0248]
4. 6-(4-氨基苯基)-3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮的制备
[0249][0250]
3-甲基-6-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮(50mg,0.2mmol)与10％湿钯碳(5mg)溶于甲醇(7ml)，15℃氢气(15psi)下反应1小时，抽滤滤液浓缩得到产物(40mg,91.0％)。
[0251]
5. 2-烯丙基-1-(6-(2-(羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0252][0253]
2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(100mg,0.28mmol)与65％间氯过氧苯甲酸(89mg,0.34mmol)溶于甲苯(2ml)，15℃下反应3小时，浓缩，柱层析(30％四氢呋喃/乙酸乙酯)纯化得到产物(80mg,76.6％)。
[0254]
6. 6-(4-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)苯基)-3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮的制备
[0255][0256]
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(103mg,0.27mmol)、6-(4-氨基苯基)-3-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚-2-酮(40mg,0.18mmol)和二异丙基乙胺(48mg,0.36mmol)溶于thf(12ml)中，15℃反应16小时，旋干，中压反相制备(0-40％乙腈/水)纯化得到产物(10mg,10.3％)。
[0257]
分子式：c28h30n8o3分子量：526.6lc-ms(m/e)：527.2(m h )
[0258]1hnmr(400mhz,cdcl3):δ:10.11(s,1h),8.82(s,1h),8.10-7.95(m,1h),7.80-7.55(m,2h),7.55-7.45(m,2h),6.60-6.50(m,2h),5.70-5.60(m,1h),5.33(s,1h),5.05-4.95(m,1h),4.85-4.75(m,1h),4.75-4.65(m,2h),4.60-4.50(m,1h),4.10-4.05(m,1h),3.65-3.55(m,1h),3.30-3.20(m,1h),2.80-2.70(m,1h),2.57(m,3h),1.95-1.85(m,1h),1.45(s,6h).
[0259]
实施例5：3-(4-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟丙基-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)苯基)-6-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮的制备(化合物5)
[0260]
1. 3-(4-硝基苯基)-2-氧代-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯的制备
[0261][0262]
2-氧代3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯(149mg,0.70mmol)、对硝基碘苯(262mg,1.05mmol)、碘化亚铜(27mg,0.14mmol)、磷酸钾(149mg,3.5mmol)与1,10-菲啰啉(25mg,0.14mmol)溶于dmf(15ml)，110℃反应5小时，饱和食盐水(20ml)淬灭，乙酸乙酯(30ml)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝30％)纯化得到产物(140mg,59.8％)。
[0263]
2. 3-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮三氟乙酸盐的制备
[0264][0265]
将3-(4-硝基苯基)-2-氧代-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-6-羧酸叔丁酯(140mg,
0.42mmol)溶于二氯甲烷(10ml)与三氟乙酸(5ml)中，20℃下反应1小时，旋干得粗品直接用于下一步。
[0266]
3. 6-甲基-3-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮的制备
[0267][0268]
将3-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮三氟乙酸盐上步粗品、37％甲醛水溶液(341mg,4.2mmol)和醋酸硼氢化钠(267mg,1.26mmol)溶于dmf(6ml)中，20℃反应2小时，饱和碳酸氢钠(20ml)淬灭，乙酸乙酯(30ml)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析(甲醇/二氯甲烷＝4％)纯化得到产物(85mg,81.9％)。
[0269]
4. 3-(4-氨基苯基)-6-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮的制备
[0270][0271]
将6-甲基-3-(4-硝基苯基)-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮(85mg,0.34mmol)与10％湿钯碳(8.5mg)溶于甲醇(12ml)，15℃氢气(15psi)氛围下反应1小时，抽滤，滤液浓缩得到产物(70mg,93.7％)。
[0272]
5. 3-(4-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟丙基-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)苯基)-6-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮的制备
[0273][0274]
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(103mg,0.27mmol)和3-(4-氨基苯基)-6-甲基-3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷-2-酮(48mg,0.22mmol)溶于甲苯(8ml)中，40℃反应16小时，旋干，中压反相制备(0-40％乙腈/水)得到产物(20mg,17.2％)。
[0275]
分子式：c
28h30
n8o3分子量：526.6lc-ms(m/e)：527.2(m h

)
[0276]1hnmr(400mhz,cdcl3):δ:10.38(s,1h),8.91(s,1h),8.15-8.05(m,1h),7.80-7.70(m,3h),7.65-7.55(m,1h),7.50-7.40(m,2h),5.70-5.60(m,1h),5.36(s,1h),5.05-4.95(m,1h),4.85-4.75(m,1h),4.75-4.65(m,2h),3.90-3.70(m,3h),3.55-3.45(m,1h),2.60-2.50(m,1h),2.25(m,3h),1.85-1.80(m,1h),1.45(s,6h).
[0277]
实施例6：2-烯丙基-6-((4-(8-环丙基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)苯基)
氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物6)
[0278]
1. 8-环丙基-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
[0279][0280]
将3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷三氟乙酸盐(2.2g,粗品)溶于甲醇(30ml)，0℃下，依次加入氰基硼氢化钠(3.8g,60.5mmol)，醋酸(5.7ml,99.6mmol)和(1-乙氧基环丙氧基)三甲基硅烷(3.8g,21.8mmol)，60℃下反应4h，lc-ms检测反应完成，反应液用水稀释，二氯甲烷/甲醇(10:1)混合溶剂萃取，有机相干燥，旋干，残余物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)分离，得目标化合物(1.5g)。
[0281]
2. 4-(8-环丙基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛基-3-基)苯胺的制备
[0282][0283]
将8-环丙基-3-(4-硝基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(0.6g，2.2mmol)溶于甲醇(20ml)中，加入钯/碳(1.0g)，氢气置换三次，25℃下反应1.5h，lc-ms检测反应完成，反应液过滤，滤液旋干，得目标化合物粗品(480mg)，直接用于下一步。
[0284]
3. 2-烯丙基-6-((4-(8-环丙基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0285][0286]
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(580mg,粗品)溶于甲苯(20ml)中，加入4-(8-环丙基-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛基-3-基)苯胺(400mg，粗品)和diea(628mg，4.86mmol)，25℃反应14h，lc-ms检测反应完成，反应液旋干，制备薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝12:1，rf～0.5)分离得粗品(500mg)，再经反相柱色谱(c18柱，水：甲醇＝90:10-40:60)分离得目标化合物(98mg，收率11％)。
[0287]
分子式:c
31h36
n8o2分子量:552.7lc-ms(m/z):553.1(m h

)
[0288]1h-nmr(400mhz,cd3od)δ:8.82(s,1h),7.88-7.82(m,3h),7.42-7.25(m,3h),6.80-6.73(m,2h),5.75-5.65(m,1h),5.04(d,1h,j＝10.4),4.95(d,1h,j＝17.2),4.76-4.74(m,2h),4.00(s,1h),3.50-3.46(m,3h),3.38-3.33(m,2h),3.31-2.90(m,2h),2.15-2.00(m,2h),1.93-1.80(m,2h),1.70-1.30(m,6h),0.55-0.45(m,4h).
[0289]
实施例7：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(7-甲基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛基-4-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物8)
[0290]
1. 4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-羧酸叔丁酯的制备
[0291][0292]
将1-碘-4-硝基苯(2.1g,8.3mmol)溶于甲苯(40ml)中，加入4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-羧酸叔丁酯(1.5g，7.1mmol)，二(三叔丁基膦)钯(562mg，1.1mmol)和叔丁醇钠(1.3g，13.8mmol)，110℃下反应4h，lcms检测反应完成，反应液倒入水中，ea萃取，无水硫酸钠干燥，有机相旋干，硅胶柱层析分离(ea:pe＝1：3)得目标化合物(1.8g，收率76.0％)。
[0293]
2. 4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷三氟乙酸盐的制备
[0294][0295]
将4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-羧酸叔丁酯(900mg,2.7mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中，25℃下滴加三氟乙酸(2ml)，25℃下反应1h，lcms检测反应完成，反应液旋干得粗品(1.4g)。
[0296]
3. 7-甲基-4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷的制备
[0297][0298]
将4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷三氟乙酸盐(1.4g，粗品)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入甲醛水溶液(37％)(2.2g，27mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(1.7g,8.1mmol)，后将混合物置于下反应25℃反应1h，体系加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取有机相，有机相浓缩，硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:10)得目标化合物(650mg，两步收率97.4％)。
[0299]
4. 4-(7-甲基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)苯胺的制备
[0300][0301]
将7-甲基-4-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷(650mg，2.63mmol)溶于甲醇(20ml)中，加入钯碳(300mg)，后将混合物置于下反应25℃反应1h，抽滤，滤液浓缩得粗品
(600mg)，直接用于下一步反应。
[0302]
5. 2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(7-甲基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛基-4-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0303][0304]
将2-烯丙基-1-(6-2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(440mg,1.18mmol)溶于甲苯(20ml)中，加入4-(7-甲基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)苯胺(395mg，粗品)和diea(458mg，3.54mmol)，25℃反应16h，lcms检测反应完成，反应液旋干，硅胶柱层析分离(meoh:dcm＝1：10)得粗品，经乙酸乙酯打浆得目标化合物(15mg，收率2.6％)。
[0305]
分子式:c
29h34
n8o2分子量:526.6lc-ms(m/e):527.1(m h

)
[0306]1h-nmr(400mhz,meod)δ:8.81(s,1h),7.95-8.05(m,1h),7.70-7.80(m,1h),7.62-7.68(m,1h),7.55-7.61(m,2h),7.06-7.09(m,2h),5.65-5.75(m,1h),5.05(d,j＝10.4hz,1h),4.90-4.96(m,1h),4.80-4.90(m,2h),4.60(s,1h),3.80-4.00(m,2h),2.95-3.10(m,3h),2.81(s,3h),1.59(s,6h),1.10-1.20(m,2h),0.90-1.10(m,2h).
[0307]
实施例8：2-烯丙基-6-((4-(4-环丙基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备(化合物9)
[0308]
1. 7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-4-羧酸叔丁酯的制备
[0309][0310]
于1-氟-4-硝基苯(1.0g,7.1mmol)的二甲基亚砜(50.0ml)中，加入4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-4-羧酸叔丁酯(1.7g，8.0mmol)和碳酸钾(2.0g，14.2mmol)，70℃反应5h，将反应液倒入水中，固体析出抽滤，滤饼用水洗涤，旋干滤饼得目化合物(2.4g，收率：99.7％)。
[0311]
2. 7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷的制备
[0312][0313]
于7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-4-羧酸叔丁酯(1.8g,5.4mmol)的二氯甲烷(12.0ml)中，加入三氟乙酸(6.0ml)，后将混合物置于25℃下反应1h，反应液浓缩旋干，加水稀释，用饱和的碳酸氢钠溶液调节ph至碱性，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩旋干直接用于下一步。
[0314]
3. 4-环丙基-7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷的制备
[0315][0316]
于7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷(粗品)(500.0mg，2.1mmol)的甲醇(15.0ml)中，加入乙酸(1.3g,22.3mmol)，氰基硼氢化钠(841.5mg,13.4mmol)和(1-乙氧基环丙氧基)三甲基硅烷(836.6g,4.8mmol)，后将混合物置于65℃下反应5h，体系加入水猝灭反应，二氯甲烷萃取，有机相浓缩，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:2)得目标化合物(560.0mg，收率95.6％)。
[0317]
4. 4-(4-环丙基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛基-7-基)苯胺的制备
[0318][0319]
于4-环丙基-7-(4-硝基苯基)-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷(560.0mg，2.0mmol)的甲醇(6.0ml)中，加入钯碳(200mg)，后将混合物置于下反应25℃反应1h，抽滤，滤液浓缩得粗品(500.0mg)，直接用于下一步反应。
[0320]
5. 2-烯丙基-6-((4-(4-环丙基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)苯基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的制备
[0321][0322]
于2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(粗品，500.0mg,1.3mmol)的甲苯(20.0ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(840.5mg,6.5mmol)和4-(4-环丙基-4,7-二氮杂螺[2.5]辛烷-7-基)苯胺(486.8mg,2.0mmol)，后将混合物置于25℃下反应16h，饱和碳酸氢钠猝灭反应，二氯甲烷萃取，有机相浓缩，硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:20)得目标化合物(8.5mg)。
[0323]
分子式:c
31h36
n8o2分子量:552.7lc-ms(m/e):523.0(m h

)
[0324]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:10.20-10.05(m,1h),8.81(s,1h),7.95-8.15(m,1h),7.85-7.70(m,1h),7.59-7.61(m,2h),6.90-6.88(m,2h),5.70-5.50(m,2h),5.31(s,1h),5.05-4.95(m,1h),4.80-4.90(m,1h),4.72-4.62(m,2h),3.20-3.10(m,2h),3.05-2.95(m,4h),2.00(s,1h),1.48(s,6h),0.80-0.70(m,2h),0.55-0.40(m,4h),0.32-0.20(m,2h).
[0325]
实验方案
[0326]
以下提供本发明部分化合物的示例性实验方案，以显示本发明化合物有利活性和有益技术效果。但是应当理解，下述实验方案仅仅是对本发明内容的示例，而不是对本发明
范围的限制。
[0327]
实验例1本发明化合物对细胞增殖活性的抑制实验
[0328]
测试物：本发明部分化合物，其结构式和制备方法见本发明制备例。
[0329]
阳性对照药：azd1775，按照现有技术wo2007126128公开的方法制备，其结构如下所示：
[0330][0331]
实验方法
[0332]
1.实验材料和试剂
[0333]
名称来源货号dmem高糖培养基gibco11995-065mem培养基gibco10370-021fbs(胎牛血清)gibco10099-141c马血清solarbios9050丙酮酸钠gibco11360-070谷氨酰胺gibco35050-061青链霉素-双抗gibco1507-0630.25％胰蛋白酶gibco25200-07210
×
dpbs(杜氏磷酸缓冲液)gibco14200-07596孔底透白板corning3610gemcitabine(吉他西滨)mcehy-b0003ctgpromegag7571
[0334]
2.细胞培养基配比及铺板数量
[0335][0336]
3.实验过程
[0337]
3.1化合物准备
[0338]
测试化合物和参照阳性对照药的10mm dmso溶液，用dmso 3倍梯度稀释，8个浓度。测试化合物和参照阳性对照药10mm dmso溶液，用dmso配制为联用浓度的1000倍溶液，即300μm,100μm,30μm。
[0339]
配制吉西他滨(gemcitabine)10mm的储备液，稀释至最高终浓度1000倍，即100μm，再用dmso 3倍梯度稀释5个浓度。
[0340]
3.2试验过程
[0341]
细胞按照来源方建议条件培养，至状态良好的对数生长期，去除培养基，pbs洗一遍，0.25％胰蛋白酶消化，完全培养基终止后收集细胞，重悬至合适的浓度，接种到96孔板,
每孔90μl,37℃，5％co2培养箱培养24小时。
[0342]
化合物单用：终浓度1000倍的化合物溶液，培养基稀释100倍，每孔加入10μl，37℃，5％co2培养箱培养72h后检测。
[0343]
化合物和吉西他滨联用：吉西他滨终浓度1000倍的溶液，培养基稀释100倍，每孔加入10μl，37℃，5％co2培养箱继续培养24小时。终浓度1000倍的化合物溶液，培养基稀释20倍，每孔加入5μl，37℃，5％co2培养箱继续培养24小时后检测。
[0344]
培养板提前放置室温，每孔加入60μl的ctg检测液，避光，在定轨摇床上震动2分钟使细胞裂解，反应共20分钟后，用多功能酶标仪读取冷光值。
[0345]
4.数据处理
[0346]
使用graphpad prism 8.0软件分析数据，利用非线性s曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算ic
50
值。
[0347]
实验结果
[0348]
表1本发明化合物单用体外细胞抑制活性
[0349][0350]
表2本发明化合物与吉西他滨联用体外细胞抑制活性
[0351]
nadph)。该实验同时进行实验孵育体系的阳对药维拉帕米以证明肝微粒体酶活性正常。
[0369]
(2)从-80℃冰箱中取出肝微粒体(20mg蛋白/ml)，置于37℃水浴恒温振荡器上预温孵3min。
[0370]
(3)每个化合物每个种属取1.9ml温孵体系混合溶液1，加入56μl不同种属的微粒体，制备温孵体系混合溶液2(不含供试品和β-nadph)。
[0371]
(4)样品组(含微粒体和β-nadph)：取616μl温孵体系混合溶液2，加入14μl浓度为50μm的供试品工作溶液，加入70μl 10mm的β-nadph工作溶液。混匀，复样。取样时间点为0min，5min，10min，20min，30min，60min。该样品组用于评价化合物经由β-nadph介导的代谢稳定性。
[0372]
(5)对照组(含微粒体，不含β-nadph，以水代替β-nadph)：取264μl温孵体系混合溶液2，加入6μl浓度为50μm的供试品工作溶液，加入30μl水。混匀，复样。取样时间点为0min和60min。该阴性对照组用于评价化合物在肝微粒体孵育体系中是否存在非β-nadph介导的代谢。
[0373]
(6)于各个预定时间点从孵育样品管中取样50μl，加入至终止样品管(内含300μl冷的终止剂，含内标甲苯磺丁脲50ng/ml的乙腈溶液)，涡旋，终止反应。
[0374]
(7)涡旋10min后，离心5min(12000rpm)。
[0375]
(8)取上清液100μl，加入100μl水，涡旋混匀，lc-ms/ms进样分析。
[0376]
数据分析：
[0377]
通过下面公式中供试品与内标峰面积的比值转化成剩余量百分比。
[0378][0379]
实验结果：
[0380]
表4本发明化合物肝微粒体稳定性结果
[0381][0382]
实验结论：
[0383]
本发明化合物在人、猴、犬、大鼠及小鼠肝微粒体中具有良好的稳定性，在小鼠肝微粒体中，稳定性与对照相当；在其余种属肝微粒体中，本发明化合物的稳定性明显优于对照azd1775。
[0384]
实验例3本发明化合物对体外激酶活性的抑制实验
[0385]
测试物：本发明部分化合物，其结构式和制备方法见本发明制备例。下述实验中所用缩写代表的含义如下：
[0386]
dmso：二甲基亚砜；hepes：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
[0387]
实验方法：用adp-glo kinase assay方法，在体外wee1激酶上对化合物进行评价。
[0388]
实验步骤：
[0389]
1.化合物稀释：
[0390]
用100％dmso将待测化合物(10mm储备液)稀释100倍，在384稀释板中(labcyte,pp-0200)以1：3进行等比稀释待测化合物浓度：100μm，33.33μm，11.11μm，3.7μm，1.23μm，0.41μm，0.137μm，0.046μm，0.015μm，0.005μm，0μm。
[0391]
2.用echo转移0.1μl的待测化合物到384反应板中(pe,6007290)，1000rpm/min，离心1min。
[0392]
3.转移5μl的激酶到384反应板中，1000rpm/min，离心1min，25℃孵育15min。
[0393]
4.转移5μl底物混合物到384反应板中，1000rpm/min，离心1min，25℃孵育60min。在反应体系中，待测化合物终浓度1000nm，333.33nm，111.11nm，37.04nm，12.35nm，4.12nm，1.37nm，0.46nm，0.15nm，0.05nm，0nm。dmso终浓度均为1％。
[0394]
5.转移5μl adp-glo到384反应板中1000rpm/min,离心1min，25℃孵育60min。
[0395]
6.转移10μl detection溶液到384反应板中1000rpm/min,离心1min，25℃孵育60min。
[0396]
7.使用envision多功能读板机读取rlu(relative luminescence unit)信号。
[0397]
8.数据计算
[0398]
1)对每个筛板计算dmso和阳性质控化合物azd-1775(1000nm抑制率100％)的平均数据和标准差(sd)作为高对照和低对照。
[0399]
2)抑制百分率(％inh)＝100
×
(最大值-化合物signal)/(最大值-最小值)
[0400]“最小值”为不加化合物的阴性对照样孔读数；“最大值”为加阳性质控化合物azd-1775(1000nm抑制率100％)的阳性对照孔读数。
[0401]
3)利用非线性回归方程拟合化合物ic
50
。
[0402]
实验结果:
[0403]
表5本发明化合物体外酶学抑制活性
[0404][0405]
实验结论:
[0406]
本发明化合物对wee1具有很好的抑制活性。