标志物及其检测试剂在制备筛查和/或辅助诊断ASD的试剂盒中的应用

标志物及其检测试剂在制备筛查和/或辅助诊断asd的试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明涉及医学技术领域，尤其涉及标志物及其检测试剂在制备筛查和/ 或辅助诊断asd的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.孤独症是一种复杂的神经系统发育疾病，出现在生命的最初几年，可能导致终生残疾。近年来asd的发病率显着增加，但由于asd的病因和发病机制尚未完全了解，目前缺乏有效的生理诊断及医疗干预措施。传统的asd诊断仅通过行为量表进行(cars、dsm-5、abc、adi-r、ados 等)，该方法基于观察和问卷评分综合判定，与生理学改变相比，比较滞后。虽然目前已出现基于血液尿液代谢物、生物酶以及肠道菌群的诊断标志物，但因这些因素与疾病的关系复杂，上述诊断标志物，准确率和灵敏度无法满足临床应用。
3.asd的主要病理生理特征之一是神经系统和肠道粘膜的慢性炎症，越来越多的证据表明人类肠道微生物群与asd的发展有关。然而，现有 asd菌群特征多由普通的宏基因组丰度差异分析获得，与病情严重程度相关性不大，不能建立清晰的发病机制，准确性较低，存在大量假阳性和假阴性。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提供了标志物及其检测试剂在制备筛查和/或辅助诊断 asd的试剂盒中的应用，所述标志物所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体、链球菌毒力因子中的至少一种。本发明以口腔链球菌及口腔链球菌噬菌体和/或链球菌毒力因子为标志物可准确进行asd的诊断和患病风险评估，并可作为asd生物治疗的靶点。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.标志物在制备筛查和/辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体、链球菌毒力因子中的至少一种。
7.本发明中，所述链球菌毒力因子包括virulence factor database(vfdb) 数据库中所有可检出的链球菌毒力因子。
8.本发明还提供了检测标志物的试剂制备筛查和/辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体和链球菌毒力因子中的至少一种。
9.在本发明的上述应用中，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体和链球菌毒力因子中的至少两种。优选地，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体和链球菌毒力因子中的至少两种。
10.一些实施方案中，所述链球菌毒力因子包括virulence factor database (vfdb)数据库中所有可检出的毒力因子，具体包括：
11.[0012][0013]
一些实施方案中，所述检测标志物的试剂包括检测所述标志物的引物、探针和/或抗体。
[0014]
一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括dna提取试剂盒，蛋白提取试剂盒，pcr扩增试剂盒中的至少一种。
[0015]
一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括用于基因测序和/或免疫检测的其他试剂。
checklist，孤独症行为量表)量表进行行为评估。对于对照组，进行了体检和家长面谈，以排除任何精神疾病。如果参与者在入组前三个月出现感染或服用精神药物、抗生素、益生菌、益生元或特殊饮食，则被排除在外。进行专业口试和问卷调查，以评估每个参与者的口腔状况。经过标准检查和卫生清洁，采集牙菌斑用于代表口腔微生物群落。病例组和对照组在蛀牙和填充牙齿的数量、牙垢指数和牙结石指数方面相似，口腔卫生没有显着差异。
[0029]
利用宏基因组shotgun测序分析对上述52例口腔样本进行微生物鉴定，分析结果如图1-2所示，与正常儿童相比，asd儿童口腔链球菌科细菌 (streptococcaceae)携带噬菌体的比例显著高于正常儿童，并且asd儿童口腔中链球菌噬菌体(streptococcal phages)丰度显著高于正常儿童。利用线性判别分析(linear discriminant analysis,lda)对噬菌体所属宿主进行鉴定分析结果如图3显示，链球菌噬菌体在asd组中效应值最高的(|score|》2)。对于口腔链球菌属细菌，asd儿童口腔链球菌携带毒力因子水平和链球菌属细菌丰度显著高于正常儿童(如图4)。
[0030]
实施例2口腔链球菌噬菌体、链球菌属细菌与孤独症临床表现的相关性
[0031]
ados的总分由四个领域的分数组成：(1)语言与交流(lc)；(2)互惠社会互动(rsi)；(3)刻板行为和限制利益(sbri)；(4)玩耍，分数越高表明临床表现越严重。经过spearman关联性分析，结果如图5所示，链球菌噬菌体的丰度与ados评估总分和lc分数呈强正相关(图5a，分别是 rho＝0.52，rho0.65)。其次，链球菌毒力因子(streptococcal vfs)的丰度也与 ados总分和lc分值呈正相关(图5b，分别是rho＝0.35，rho＝0.49)。链球菌属细菌的总丰度与ados总分和lc分数呈现强正相关(图5c，分别是 rho＝0.55，rho＝0.42)。持续的强相关性提示口腔链球菌及其噬菌体以及所携带的毒力因子在asd发病机制中的潜在贡献，并且与疾病严重程度密切相关。
[0032]
实施例3用于asd预测的随机森林分类模型的构建
[0033]
以实施例1中的asd儿童和正常样本为对象，基于口腔链球菌属细菌和链球菌噬菌体丰度数据构建了用于诊断asd的随机森林分类模型，具体构建方法如下：模型由50％的样本通过双重交叉验证进行训练，并对所有样本进行测试，自展(bootstrapping)1000次。对于每个bootstrap结果，记录每个酶对模型的贡献和每个受试者的诊断分数。然后根据auc(roc曲线下面积)评估模型的诊断准确性和特异性，结果如图6所示。
[0034]
结果显示，该模型对asd的预测准确率可达0.91(如图6所示，auc值为曲线下面积，代表预测准确度)，置信区间0.8366-0.9844，表面该模型可用于 asd的评估。
[0035]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


技术特征：
1.标志物在制备筛查和/辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体、链球菌毒力因子中的至少一种。2.检测标志物的试剂制备筛查和/辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体和链球菌毒力因子中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述链球菌毒力因子包括virulence factor database数据库中所有可检出的至少一种链球菌毒力因子。4.筛查和/辅助诊断孤独症的试剂盒，其特征在于，包括检测标志物的试剂；所述所述标志物包括口腔链球菌、链球菌噬菌体、链球菌毒力因子中的至少一种。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述链球菌毒力因子包括包括virulence factor database数据库中所有可检出的至少一种链球菌毒力因子。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测所述标志物的引物、探针和/或抗体。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括dna提取试剂盒，蛋白提取试剂盒，pcr扩增试剂盒中的至少一种。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于基因测序和/或免疫检测的其他试剂。9.一种辅助治疗孤独症的产品，其特征在于，所述产品能够降口腔链球菌、链球菌噬菌体和链球菌毒力因子中的一种或多种的丰度和/或含量。

技术总结
本发明提供了标志物及其检测试剂在制备筛查和/或辅助诊断ASD的试剂盒中的应用。本发明研究发现口腔链球菌Streptococcaceae(科)丰度、口腔链球菌噬菌体(Streptococcalphages)丰度以及所携带的毒力因子(virulence factors，VFs)丰度，在ASD与正常儿童口腔中有显著差异，且与ADOS评分和语言交流评分等临床表现的严重程度密切相关，在平行的肠道菌群取样中未观察到这些变化，这表明ASD发病机制与链球菌噬菌体过度富集之间存在一种前所未有的口腔特异性关联，并且与疾病严重程度密切相关。重程度密切相关。


技术研发人员：康禹 楚亚男 邵长君 王建 陈婧
受保护的技术使用者：中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/7/29