人CTNNB1基因突变的数字PCR检测方法及应用与流程

人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用。


背景技术：

2.ctnnb1基因编码的蛋白β-catenin是一种粘着连接蛋白，与钙粘蛋白、α-catenin共同组成粘附连接(adherens junctions,ajs)复合体，通过调控细胞生长以及细胞间的粘附，对上皮细胞层的构建与维持起着重要作用。β-catenin可与apc蛋白结合，发生突变后可导致肝癌，结直肠癌，毛母质瘤，髓母细胞瘤与卵巢癌。
3.经meta分析，细胞内异常表达的β-catenin与肝细胞癌的不良预后、疾病进展和肿瘤侵袭性密切相关。β-catenin异常表达对于肝细胞癌患者预后及其临床病理特征意义的meta分析与肝细胞癌ctnnb1基因突变检测研究表明，细胞内β-catenin的异常表达可以作为hcc患者术后整体生存期缩短、肿瘤早期复发及肿瘤恶性生物学行为的标志物，因此β-catenin可能是肝细胞癌分子靶向治疗的新靶点。
4.目前获批肝癌的免疫药物有opdivo(nivolumab，o药)和keytruda(pembrolizumab，k药)这2种，且都是二线获批，所以很多肝癌患者在既往索拉非尼治疗进展后都纷纷开始免疫治疗。
5.有研究发现在晚期肝癌hcc中，wnt/ctnnb1突变的肝癌为免疫豁免类肿瘤，也就是常说的“冷”肿瘤，出现wnt/ctnnb1基因突变的肝癌患者对pd-1/pd-l1单抗先天耐药，但wnt/ctnnb1突变与否对索拉非尼影响不大。
6.nature genetics杂志一篇研究对1122例egfr突变晚期nsclc患者的cfdna进行了检测，发现超过92.9％的患者有1种以上的共存突变，大部分(89.8％)为功能性突变，功能性驱动基因突变包括pik3a,braf,met,myc,cdk6,ctnnb1等基因，egfr与ctnnb1或pik3ca发生共存突变时会协同促进肿瘤转移或egfr tki耐药，多基因突变与egfr tki一线治疗患者缓解率和生存负相关。
7.尽管目前市场上还没有明确针对ctnnb1突变的肿瘤靶向药，但是基于目前的研究，对ctnnb1的检测有助于临床上对肿瘤患者进行预后判断，且在一定程度上指导肝癌患者是否适合使用免疫治疗。
8.然而，在实际检测结肝癌患者的ctnnb1基因突变的过程中，仍然面临着检测样本质量等问题。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(circulating free dna,简称“cfdna”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfdna的变化，进而监控病情变化。
9.然而，采用无细胞的核酸(如cfdna)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfdna检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中
的cfdna含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(circulating tumor dna,简称“ctdna”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。
10.不仅如此，cfdna检测方法特异性有待提高。douillard等人报道，使用血浆检测egfr突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
11.此外，目前虽然有一些基于cfdna来检测ctnnb1基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。
12.因此，本领域迫切需要开发基于cfdna的高灵敏度和高特异性检测ctnnb1基因突变的方法。


技术实现要素：

13.本发明的目的在于提供一种基于cfdna的高灵敏度和高特异性检测ras基因突变的方法。
14.在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂选自下组用于检测ctnnb1突变的第一引物对，其中第一引物对包括seq id no:1和2所示的引物；
15.在另一优选例中，所述的ctnnb1 s45和t41所在序列位于ng_013302.2:30121～30246。
16.在另一优选例中，所述的ctnnb1 s45的野生型序列的核酸序列如seq id no.:8所示。
17.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45f突变指ctnnb1蛋白氨基酸序列的第45位的丝氨酰胺s突变为苯丙氨酸f(即s45f)。
18.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45p突变指ctnnb1蛋白氨基酸序列的第45位的丝氨酰胺s突变为脯氨酸p(即s45p)。
19.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45f突变指ctnnb1基因核酸序列的第134位的胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t(ctnnb1 c.134c》t)。
20.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45p突变指，ctnnb1基因核酸序列的第133位的胸腺嘧啶t突变为胞嘧啶c(ctnnb1 c.133t》c)。
21.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45f突变型核酸序列如seq id no:9所示。
22.在另一优选例中，所述ctnnb1 s45p突变型核酸序列如seq id no.:10所示。
23.在另一优选例中，所述ctnnb1 t41a突变指ctnnb1蛋白氨基酸序列的第41位的苏氨酸t突变为丙氨酸a(即t41a)。
24.在另一优选例中，所述ctnnb1 t41a突变是指ctnnb1基因核酸序列的第121位的腺嘌呤a突变为鸟嘌呤g(即ctnnb1 c.121a》g)。
25.在另一优选例中，所述ctnnb1 t41a突变型核酸序列如seq id no.:11所示。
26.在另一优选例中，所述试剂还包括：
27.(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：seq id no:3所示的探针、seq id no:4所示的探针、seq id no:5所示的探针、或其组合；
28.在另一优选例中，所述试剂还包括：
29.(b1)与第一引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：seq id no:6所示的探针、seq id no:7所示的探针、或其组合。
30.在另一优选例中，所述的第一探针和第二探针为单链的核酸探针。
31.在另一优选例中，所述的核酸探针含有一个或多个锁核苷酸。
32.在另一优选例中,所述第一探针的结构(5'-3')如式i所示：
33.z1-z2-z3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀi34.其中，
35.z1为荧光基团；
36.z2为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
37.z3为淬灭基团；
38.“-”
为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
39.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向野生型ctnnb1 s45位点。
40.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 s45f位点。
41.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 s45p位点。
42.在另一优选例中，所述的z2含有锁核苷酸修饰。
43.在另一优选例中，所述的z2的序列选自下组：
44.agctcct t ctctgagtg(seq id no:3)；
45.cacagctcctt t tctgagtg(seq id no:4)；
46.cacagctcct cctctgagt(seq id no:5)；
47.各式中，“ t”表示锁核苷酸t，“ c”表示锁核苷酸c。
48.在另一优选例中，所述的荧光基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
49.在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的5'端、3'端、和/或中部。
50.在另一优选例中，所述荧光基团包括与dna探针交联的荧光基团。
51.在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、vic、hex、fitc、bodipy-fl、g-dye100、fluorx、cy3、cy5、texas red，或其组合。
52.在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：dabcyl、tamra、bhq 1、bhq 2、bhq3、mgb、bbq-650、tq1-tq6、qsy 7carboxylic acid、tq7、eclipse，或其组合。
53.在另一优选例中，所述的核酸探针为wtp-s45(seq id no:3)。
54.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-s45f(seq id no:4)。
55.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-s45p(seq id no:5)。
56.在另一优选例中，所述第二探针的结构(5'-3')如式ii所示：
57.z1'-z2'-z3'
ꢀꢀꢀꢀꢀ
ii
58.其中，
59.z1'为荧光基团；
60.z2’为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
61.z3'为淬灭基团；
62.“-”
为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
63.在另一优选例中，所述的z2'特异性核酸序列靶向野生型ctnnb1 t41位点。
64.在另一优选例中，所述的z2'特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 t41a位点。
65.在另一优选例中，所述的z2’含有锁核苷酸修饰。
66.在另一优选例中，所述的z2'的序列选自下组：
67.tgccact a ccacagctc(seq id no:6)；
68.tgccact g ccacagc(seq id no:7)；
69.各式中，“ a”表示锁核苷酸a，“ c”表示锁核苷酸c,“ g”表示锁核苷酸g。
70.在另一优选例中，所述的核酸探针为wtp-t41(seq id no:6)。
71.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-t41a(seq id no:7)。
72.在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有第一方面所述的用于检测基因突变的试剂。
73.在另一优选例中，所述的试剂盒还含有与第一引物对配合使用的第一探针；和/或与第一引物对配合使用的第二探针。
74.在另一优选例中，所述的第一引物对、第一探针、第二探针如上所述。
75.在另一优选例中，所述的试剂盒包括seq id no:1和2所示的第一引物对，seq id no:3、4和5所示的第一探针。
76.在另一优选例中，所述的试剂盒包括seq id no:6和7所示的第二探针。
77.在本发明的第三方面，提供了第一方面所述的用于检测基因突变的试剂或第二方面所述的试剂盒的用途，用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于评判对象是否适合用免疫治疗，或预先评估对象采用免疫治疗药物的效果。
78.在另一优选例中，所述的免疫治疗药物选自下组：如pd-1单抗、pd-l1单抗、opdivo(nivolumab，o药)、keytruda(pembrolizumab，k药)、或其组合。
79.在另一优选例中，所述的产品是针对cfdna样本进行检测。
80.在另一优选例中，所述的cfdna来自对象的血液、血浆、或血清。
81.在另一优选例中，所述的对象为肿瘤患者。
82.在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、或其组合。
83.在本发明的第四方面，提供了一种检测待测样本是否含有基因突变的方法，包括步骤：
84.(s1)提供一pcr反应体系，所述pcr反应体系中含有作为模板的待测样本、以及用于扩增的引物对，所述的引物对选自下组：
85.(a)用于检测ctnnb1突变的第一引物对，其中第一引物对包括seq id no:1和2所示的引物；
86.第一方面所述的检测基因突变的试剂；
87.(s2)对步骤(s1)的所述pcr反应体系进行pcr反应，从而获得扩增产物；
88.(s3)对步骤(s2)中产生的扩增产物进行分析，从而获得所述待测样本是否含有基因突变的分析结果。
89.在另一优选例中，所述的分析结果为定性结果。
90.在另一优选例中，所述的pcr反应体系为数字pcr反应体系。
91.在另一优选例中，所述的数字pcr为ddpcr。
92.在另一优选例中，所述ddpcr中的待检测的靶标核酸分子在微滴中的浓度为1至1
×
10
15
拷贝/毫升，较佳地1至10
10
拷贝/毫升，更佳地1至105拷贝/毫升。
93.在另一优选例中，步骤(s2)中，所述pcr反应的退火温度为58
±
2℃，较佳地58
±
1℃，更佳地58
±
0.5℃。
94.在另一优选例中，所述的pcr反应体系中，还含有：
95.(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：seq id no:3所示的探针、seq id no:4所示的探针、seq id no:5所示的探针、或其组合；和/或
96.(b1)与第一引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：seq id no:6所示的探针、seq id no:7所示的探针、或其组合。
97.在另一优选例中，用于检测野生型基因的探针(seq id no:3和seq id no:6)采用相同的第一荧光标记物(如hex、fam)。
98.在另一优选例中，用于检测突变型基因的探针(seq id no:4、5和7)采用相同的第二荧光标记物(如hex、fam)，并且第一荧光标记物和第二荧光标记物是不同的。
99.在另一优选例中，所述的探针中含有锁核苷酸。
100.在另一优选例中，所述的方法为非诊断和非治疗性的。
101.在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
102.在另一优选例中，所述方法检测精确度为0.06％-1％，较佳地为0.0625％-0.08％。
103.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
104.图1显示了ctnnb1 5对引物pcr电泳结果(m：dna marker)
105.图2显示了检测ctnnb1基因s45f突变taqman-ddpcr方法的退火温度优化，孔b02,b06,b10代表退火温度梯度28℃、60℃、62℃。其中a是fam通道检测阳性对照(100％s45f突变)的1-d振幅图；b是hex通道检测阴性对照1-d振幅图
106.图3显示了检测ctnnb1基因s45p突变taqman-ddpcr方法的退火温度优化,孔d09、d05、d01代表退火温度梯度60℃、58℃、56℃。其中a是fam通道检测阳性对照(100％s45p突变)的1-d振幅图；b是hex通道检测阳性对照1-d振幅图
107.图4显示了检测ctnnb1基因t41a突变taqman-ddpcr方法的退火温度优化,孔b10、b06、b02代表退火温度梯度62℃、60℃、58℃。其中a是fam通道检测阳性对照(100％t41a突变)的1-d振幅图；b是hex通道检测阳性对照1-d振幅图
108.图5显示了对于ctnnb1 s45f基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％
109.图6显示了对于ctnnb1 s45p基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％。
110.图7显示了对于ctnnb1 t41a基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％。
111.图8显示了病例“ms1117”经数字pcr检测为ctnnb1阴性。从上至下分别为45f、
s45p、t41a的检测二维图(fam-hex通道的2d振幅图)。其中绿色为野生型信号。
112.图9显示了病例“ms2614”经数字pcr检测ctnnb1 s45f检测的二维图(fam-hex通道的2d图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了病例“ms1129”经数字pcr检测为ctnnb1 s45f阳性。
113.图10显示了病例“ms1925”经数字pcr检测ctnnb1 s45p检测的二维图(fam-hex通道的2d图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了经数字pcr检测为ctnnb1 s45p阳性。
114.图11显示了病例“ms3182”经数字pcr检测ctnnb1 t41a检测的二维图(fam-hex通道的2d图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了经数字pcr检测为ctnnb1 t41a阳性。
115.图12显示了病例“ms2023”经数字pcr检测为ctnnb1阳性。fam-hex通道的2d图；蓝色和橙色为突变信号。
具体实施方式
116.本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，尤其是通过优化引物序列和探针的优化，再结合数字pcr平台，可以有效提高基因突变检测效果，并突破了现有基因突变检测技术中病理组织作为起始材料、准确度低、灵敏度低等问题，提供了一种高特异性、高灵敏度、抗干扰能力强地检测ctnnb1基因突变的方法。在此基础上，本发明人完成了本发明。
117.具体地，本发明提供了一种针对ctnnb1 s45f、ctnnb1 s45p以及ctnnb1t41a突变基因的检测方法，即通过提供特别优化的1对针对ctnnb1 s45和ctnnb1 t41所在序列的引物对、探针和针对ctnnb1 s45f、ctnnb1 s45p、ctnnb1t41a突变基因的特别优化的探针，建立数字pcr检测体系，从而定性定量的检测出ctnnb1基因的突变情况。本发明的方法和试剂用于检测ctnnb1基因突变时，具有出乎意料的高灵敏和高特异性，并且且可以检测不同难度样本。
118.术语
119.为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
120.术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
121.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
122.序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
123.数字pcr(digital pcr)技术
124.数字pcr(digital pcr)技术，基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀
释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过pcr循环之后，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析，有核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
125.数字pcr与常规的qpcr相比，其能够精确地定量分析和高灵敏度地检测靶核酸分子。分析常规qpcr的结果的方法是模拟方法，其中，所述数字pcr方法，其结果是通过数字方法(因为得到的信号具有“0”或“1”的数值)分析的，具有可分析大体积样本、可同时检测不同样本以及同时进行不同测试的优点。数字pcr技术是一种可使用不具有标准曲线的单分子计数法来绝对定量dna样本的技术，并且可以通过pcr对每孔单个液滴进行更精确的绝对定量(参见gudrun pohl和le-ming shih，数字pcr的原理和应用(principle and applications of digital pcr)，expert rev.mol.diagn.4(1),41-47(2004))。数字pcr具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
126.在数字pcr中，含有经制备从而可用于稀释至平均拷贝数目为0.5-1的样本基因模板、扩增引物和荧光探针的各液滴分配到单个孔中，并进行微乳液pcr。然后，显示荧光信号的孔计数为数值“1”，因为具有基因拷贝数目为1的样本分配到所述孔中并且扩增后显示荧光信号，而没有显示信号的孔计数为“0”，因为具有基因拷贝数目为0的样本分配到所述孔中，由于无扩增，不显示荧光信号。采用这种方式，可以实现绝对定量。
127.引物
128.引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补。
129.在本发明中，为了提高检测体系的灵敏度，预先扩增检测体系中对应基因片段，因而设计了对应于突变所在序列的引物。
130.在一个优选例中，针对ctnnb1 s45、ctnnb1 t41所在序列，分别在ctnnb1基因s45、t41位点上下游设计了多对引物，经过实验测试，最终确定了最优的引物对为seq id no:1和2。
131.探针
132.在本文中，“探针”、“核酸探针”、“基因探针”可以替换，是指一段带有检测标记且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：
①
应是单链，若为双链，必须先行变性处理；
②
应带有容易被检测的标记。核酸探针可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是dna本身，也可以是由之转录而来的rna。本发明中，所述的探针也指一种修饰引物，所述修饰引物的两端或中间带有化学修饰基团，这些化学修饰具有特殊功能包括但不限于：信号指示作用，增强与反应物的连接作用等。
133.z1-z2-z3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀi134.其中，
135.z1为荧光基团；
136.z2为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
137.z3为淬灭基团；
138.“-”
为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
139.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向野生型ctnnb1 s45位点。
140.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 s45f位点。
141.在另一优选例中，所述的z2特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 s45p位点。
142.在另一优选例中，所述的z2含有锁核苷酸修饰。
143.在另一优选例中，所述的z2的序列选自下组：
144.agctcct t ctctgagtg(seq id no:3)；
145.cacagctcctt t tctgagtg(seq id no:4)；
146.cacagctcct cctctgagt(seq id no:5)；
147.各式中，“ t”表示锁核苷酸t，“ c”表示锁核苷酸c。
148.在另一优选例中，所述的荧光基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
149.在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的5'端、3'端、和/或中部。
150.在另一优选例中，所述荧光基团包括与dna探针交联的荧光基团。
151.在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、vic、hex、fitc、bodipy-fl、g-dye100、fluorx、cy3、cy5、texas red，或其组合。
152.在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：dabcyl、tamra、bhq 1、bhq 2、bhq3、mgb、bbq-650、tq1-tq6、qsy 7carboxylic acid、tq7、eclipse，或其组合。
153.在另一优选例中，所述的核酸探针为wtp-s45(seq id no:3)。
154.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-s45f(seq id no:4)。
155.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-s45p(seq id no:5)。
156.在本发明中，针对ctnnb1 t41及其突变型的探针的结构(5'-3')如式ii所示：
157.z1'-z2'-z3'
ꢀꢀꢀꢀꢀ
ii
158.其中，
159.z1'为荧光基团；
160.z2’为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
161.z3'为淬灭基团；
162.“-”
为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
163.在另一优选例中，所述的z2'特异性核酸序列靶向野生型ctnnb1 t41位点。
164.在另一优选例中，所述的z2'特异性核酸序列靶向突变型ctnnb1 t41a位点。
165.在另一优选例中，所述的z2’含有锁核苷酸修饰。
166.在另一优选例中，所述的z2'的序列选自下组：
167.tgccact a ccacagctc(seq id no:6)；
168.tgccact g ccacagc(seq id no:7)；
169.各式中，“ a”表示锁核苷酸a，“ c”表示锁核苷酸c,“ g”表示锁核苷酸g。
170.在另一优选例中，所述的核酸探针为wtp-t41(seq id no:6)。
171.在另一优选例中，所述的核酸探针为mtp-t41a(seq id no:7)。
172.引物和探针的修饰
173.在本发明中，所述引物的核酸序列包括未修饰的或经修饰的的引物序列。
174.优选地，本发明人通过对探针用锁核苷酸进行修饰，可以显著提高探针的特异性，从而提高检测结果的灵敏度和特异性。
175.在本发明的一个优选例中，所述修饰的方式选自：磷酸化(phosphorylation)、生物素(biotin)、地高新(digoxigenin)、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基(thiol)、间臂(spacer)、硫代(phosphorthioate)、脱氧脲嘧啶(deoxyuridine，du)、脱氧次黄嘌呤(deoxyinosine，di)、或其组合。
176.磷酸化修饰：5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止dna聚合酶催化的dna链延伸反应。
177.生物素修饰：引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的dna/rna序列、离子通道构象变化等。
178.地高新修饰：地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的c5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如dna-dna杂交(southern blotting)、dna-rna杂交(northern blotting)、斑点杂交(dot blotting)、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析(elisa)。
179.内部氨基修饰：主要用c6-dt aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)，目前提供内部氨基修饰介导的dt-dabcyl、dt-biotin和dt-digoxingenin修饰。
180.5'氨基修饰：可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在dna芯片(dna microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5'c6氨基修饰和5'c12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近dna链而被淬灭时。
181.3'氨基修饰：目前提供3'c6氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32p或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
182.巯基修饰：5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体(5'-thiol-modifier c6-ce phosphoramidite或thiol-modifier c6 s-s ce phosphoramidite)。用5'-thiol-modifier c6-ce单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl)，而thiol-modifier c6 s-s ce单体修饰后须用dtt将二硫键还原成巯基。
183.间臂修饰：spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于dna发夹结构和双链结构研究。c3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-spacer c3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。spacer 18常用于引进一个强亲水基团。
184.硫代修饰：硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的tm值会降低，为了降低这种这种影响，可
以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
185.脱氧脲嘧啶修饰：脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7℃。
186.脱氧次黄嘌呤修饰：脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为di:dc》di:da》di:dg》di:dt.在dna聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dc结合。
187.cfdna
188.血浆中的游离核酸(circulating free dna,简称“cfdna”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfdna的变化，进而监控病情变化(cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients)。但是应用cfdna检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfdna含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(circulating tumor dna,简称“ctdna”)质量更是参差不齐、含量高低不一。不仅如此，cfdna检测方法特异性有待提高。doui llard et al报道，使用血浆检测egfr突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
189.本发明的主要优点包括：
190.1、灵敏度高：由于本方法采用数字pcr平台，能将反应体系分成约20000个微小反应，理论上能够检测到单个拷贝突变，具有其他技术无法匹敌的灵敏优势。本发明的检测方法通过验证能达到0.06％的最低检测限。
191.2、特异性强：设计的特异性引物针对ctnnb1基因s45和ctnnb1基因t41所在的序列，能特异性扩增目标位置的野生型和突变型模板；设计的特异性探针覆盖突变位点，针对ctnnb1的野生型(共2条)和突变型分别设计(共3条)，野生型探针5'端有hex荧光基团修饰，突变型探针5'端有fam应该基团修饰，同时，ctnnb1探针在突变碱基处带有锁核酸(lna)修饰，大大增强此处核苷酸的结合力，ctnnb1探针在3'端带有bhq1，能有效区分一个碱基差异的模板，上述引物和探针的设计大大提高了检测的特异性。
192.3、对样本的类型与质量要求宽松，抗干扰力强。由于其灵敏度高的特性，本发明适用的样本类型除了一般方法常用的新鲜组织样本、石蜡切片，还可以使用的外周血样本(此样本较容易获得,但dna含量低且破碎)；并且，由于其数字pcr平台的独特性，即能将反应体系分成约20000个小体系，同时也能将干扰物质分成约20000份，能够大大减少干扰物质对反应的影响，当然也就可以检测更复杂背景的样本。这是其他平台无法做到的。
193.4、阳性判读方法简单：由于本发明采用的是绝对定量的方法，无须设置对照标准曲线，结果根据荧光的二维图，即可判定是否含有目标突变模板(表1)。
194.表1.检测结果表
[0195][0196]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0197]
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
[0198]
引物、探针和扩增片段的序列
[0199]
实施例中，使用的引物、探针及扩增的dna片段的核酸序列信息如表2所示：
[0200]
表2：引物、探针及dna片段的核酸序列
[0201]
[0202]
注：“ a”表示锁核苷酸a，“ t”表示锁核苷酸t，“ c”表示锁核苷酸c，“ g”表示锁核苷酸g。
[0203]
实施例1引物对的筛选
[0204]
根据ctnnb1外显子序列(s45/t41位点)，设计5对引物对(引物合成自上海生工生物有限公司)，具体序列如下表3。
[0205]
表3.筛选用于扩增ctnnb1 s45/t41的5对引物对
[0206][0207][0208]
筛选pcr体系:taq hs聚合酶0.2ul，10
×
hs pcr缓冲液2ul，dntp混合物1.6ul，上游引物1ul，下游引物1ul，tgdna(人白细胞基因组dna，作为模板)5ul，水补齐体系至20ul。
[0209]
筛选pcr程序：95℃10min，30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃20s)。经过pcr筛选，ctnnb1引物对5(ctnnb1-f5/ctnnb1-r5)对目的片段扩增效率较高(条带亮)，扩增产物较短，且不产生引物二聚体，整体效果最好，可作为ctnnb1基因突变检测的引物对。见图1。
[0210]
实施例2taqman探针和数字pcr反应程序的优化
[0211]
在本实施例中，合成了taqman探针并进行优化，并基于优化的taqman探针对数字pcr反应程序进行优化。
[0212]
2.1 taqman探针
[0213]
在本实施例中，所检测ctnnb1基因突变为对应于s45f、s45p、t41a的核苷酸突变(表5)；
[0214]
表4：ctnnb1基因突变信息表
[0215]
检测位点突变类型cosmic编号基因变化s45f点突变cosm5667c.134c》ts45p点突变cosm5663c.133t》ct41a点突变cosm5664c.121a》g
[0216]
基于人ctnnb1的基因组序列和突变位点，设计相应的taqman探针并进行优化，优
化后的taqman探针含有特定的锁核苷酸( n)，分别为wtp-s45、mtp-s45f、mtp-s45p、以及wtp-t41和mtp-t41a，探针的具体信息见表2：
[0217]
2.2 数字pcr反应程序的优化
[0218]
基于实施例1确定的最优引物对(seq id no:1和2)和实施例2.1确定的优化的探针，对于数字pcr反应程序进行进一步优化。数字pcr反应程序优化实验，需要综合分析随着退火温度的变化，野生型模板和突变型模板的数字pcr扩增情况。最优的退火温度应满足两个条件：阴性对照(野生型模板)背景干净(fam通道无微滴)、突变型模板内阳性信号和阴性信号容易区分(fam通道和hex通道荧光强度高)。
[0219]
实验方法如下：
[0220]
在试剂准备区配置以下pcr体系：2
×
ddpcr supermix(no dutp)11ul，上游引物(ctnnb1-f)1.1ul，下游引物(ctnnb1-r)1.1ul，探针1(wtp-s45或wtp-t41)0.55ul，探针2(mtp-s45f/mtp-s45p/mtp-t41a)0.55ul，模板5.5ul，加水补齐至22ul。
[0221]
在样本制备区按照以下顺序加入模板：阴性对照、阳性对照。阴性对照为正常人白细胞基因组(tgdna)，阳性对照为含ctnnb1 s4或t41对应突变序列的基因组dna溶液。
[0222]
在微滴生成区，按照仪器要求进行微滴生成。
[0223]
在样本分析区，进行pcr反应并进行分析。
[0224]
ctnnb1 s45f及t41a优化实验pcr程序：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(62℃、60℃、58℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s。
[0225]
ctnnb1 s45p及t41a优化实验pcr程序：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(60℃、58℃、56℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s。
[0226]
完成pcr后，按照仪器及实验要求进行设置，选择fam/hex检测通道，开始读板。
[0227]
结果见图2～图4。其中，fam通道指示mtp探针检测突变型模板的微滴及其荧光强度(amplitude)，hex通道指示wtp探针检测野生型模板的微滴及其荧光强度(amplitude)。fam-hex双阳性的微滴代表既有野生型模板又有突变型模板存在。通过fam通道的微滴数可以推测数字pcr体系中是否存在突变型模板并可精确计算拷贝数(copies/ul)。
[0228]
图2～图4的结果表明，58℃退火15s，数字pcr阴性对照无污染、阴性信号和阳性信号之间区分最明显，整体效果较好，为最优退火温度。
[0229]
实施例3数字pcr法检测ctnnb1基因突变的灵敏度验证
[0230]
根据实施例1计算野生型模板拷贝数(copies/ul)、突变型模板基因组拷贝数(copies/ul)和突变率(％)，用te将二者均稀释至4000copies/ul。将含突变基因组模板中掺入tgdna，使得突变模板比例分别为0.06％、0.13％、0.25％、0.5％、1％，制作成梯度稀释模板。
[0231]
验证数字pcr体系：2
×
ddpcr supermix(no dutp)11ul，引物1(ctnnb1-f)1.1ul，引物2(ctnnb1-r)1.1ul，探针1(wtp-s45/wtp-t41)0.55ul，探针2(mtp-s45f/mtp-s45p/mtp-t41a)0.55ul，模板5.5ul，加水补齐至22ul。
[0232]
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、梯度稀释模板。空白对照为水，阴性对照为tgdna，梯度稀释模板为掺入0.06％-1％突变型模板的野生型模板。
[0233]
按照实施例1相同方法将pcr反应体系生成微滴。按照优化pcr程序进行pcr：95℃10min，40个循环(94℃30s，58℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。根据仪器要
求开始读板。
[0234]
数字pcr结果如图5～图7所示。本发明数字pcr法以水或者tgdna为模板，背景干净，无污染。此外，本发明数字pcr法在野生型模板中掺入0.06％-1％突变型模板，检测野生型模板拷贝数正常，检测突变型模板比例(突变型模板除以总模板乘以100％)与理论比例相符，且呈线性相关，r2值大于0.98。即本发明数字pcr法在0.06％-1％灵敏度区间内，检测值准确，即本发明数字pcr法最低检测灵敏度为0.06％。
[0235]
实施例4数字pcr法检出患者ctnnb1突变指导肿瘤靶向药物用药
[0236]
病例“ms2597”、“ms2614”、“ms1925”、“ms3182”、“ms2023”均为晚期肝癌患者。通过采集静脉血，两次离心分离血浆，通过游离核酸抽提试剂盒抽提血浆游离核酸。抽提核酸经qubit定量。定量后储存于样本制备室-20℃冰箱内。
[0237]
本发明数字pcr检测体系见实施例2。
[0238]
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、病例游离核酸、阳性对照(1％)。
[0239]
按照实施例1相同方法将pcr反应体系生成微滴。按照优化pcr程序进行pcr：95℃10min，40个循环(94℃30s，58℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开仪器，按照要求进行设置，开始读板。本次ctnnb1检测以空白对照和阴性对照背景干净，阳性对照拷贝数和突变比例正常。
[0240]
病例核酸样本检测结果见下表5。
[0241]
ms2597判读为阴性(见图8)，不含有ctnnb1 s45f/s45p/t41a突变，预示良好的预后，可以考虑使用免疫治疗；
[0242]
ms2614判读为ctnnb1 s45f阳性(见图9；突变率为0.24％)预示不良预后，可能不适合使用免疫治疗；
[0243]
病例ms1925判读为ctnnb1 s45p阳性(见图10；突变率为1.37％),预示不良预后，可能不适合使用免疫治疗；
[0244]
病例ms3182判读为ctnnb1 t41a阳性(见图11；突变率为1.09％),预示不良预后，可能不适合使用免疫治疗；
[0245]
病例ms2023按照二重组合(ctnnb1 s45f s45p),结果判读为ctnnb1阳性(s45f突变或s45p突变，见图12；突变率为1.28％)，预示不良预后，可能不适合使用免疫治疗。
[0246]
上述病例的具体检测数据见下表5：
[0247]
表5：病例检测基因突变结果
[0248][0249]
讨论：
[0250]
目前，检测基因突变的方法主要有：
[0251]
(1)高分辨率熔解曲线(hrm)。hrm是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术。检测敏感度在1-10％左右。然而，由于染料法假阳性高，后期需要测序验证，导致检测周期较长。
[0252]
(2)探针扩增阻滞突变法(arms-qpcr)。利用pcr引物的3'端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，该检测方法的灵敏度高于hrm，约为1％(cn104099422a)。(3)
[0253]
等位基因特异的taqman聚合酶链式反应(cast-pcr)。cast-pcr通过一段特异设计的mgb探针来阻止引物与野生型dna结合，选择性地优先扩增突变型dna，该检测方法的灵敏度在0.1％-1％左右(专利号cn104099422a)。barbanor.etal应用cast-pcr技术检测临床样本braf基因的v600e和v600k突变，其方法的灵敏度为1％(competitive allele-specific taqman pcr(cast-pcr)is a sensitive,specific and fast method for braf v600mutation detection in melanoma patients)。
[0254]
综上所述，现有基因突变检测技术大都为染料法或者探针法荧光定量pcr技术，该技术存在灵敏度低、准确率低、阳性判读方法复杂等问题，且对于样本的类型与质量要求高，例如有的方法要求提供组织样本，部分方法可以处理血浆/血清样本但要求为肿瘤三期或者四期病人。
[0255]
本发明使用了数字pcr(digital pcr)技术，将一个样本分配至几万个相互独立的小微滴，每个微滴分别对目标分子进行pcr扩增，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析。数字pcr具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
[0256]
本发明针对ctnnb1 s45f/ctnnb1 s45p/ctnnb1 t41a突变，开发了一种高灵敏度和高特异性数字pcr方法，与现有技术hrm、arms-qpcr、cast-pcr等相比，本发明采用taqman探针并结合数字pcr法，可解决灵敏度低、特异性差、对样本的类型与质量要求高、阳性判读方法复杂等问题。经验证本发明方法灵敏度最高可达到0.06％，不仅可以准确检测组织、体液样本，还可以处理血浆/血清等难度高的样本。
[0257]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。