同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片及制备和使用方法

1.本发明涉及基因芯片检测技术领域，特别是一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片及制备和使用方法。


背景技术：

2.冬春交替、气候多变，常见呼吸道病原体如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和新型冠状病毒等同处流行季节，而疾病早期通过临床表现无法准确区分判断患者是2019-ncov感染、还是其他常见呼吸道病毒感染，需依赖病原体诊断，尤其在新型冠状病毒世界大流行的当下，准确鉴别呼吸道感染病原体种类愈发重要。
3.呼吸道感染是世界各地传染病监测的关注重点，呼吸道感染不论是在发展中国家还是在发达国家都是一个重要的公共卫生健康问题。若能在感染早期做出正确的诊断，使用正确的治疗方法，可有效缩短病程、减少感染人群的不适性和避免其他并发症的发生。因此快速、准确的早期诊断非常关键。传统的呼吸道病原体的检测方法主要有分离培养、pcr和免疫学诊断。但分离培养耗时长，操作复杂；pcr和免疫学方法只能检测一种或几种病原体，不能完全满足同时、快速检测多种病原体的需求。而基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点，适用于呼吸道病原体的高通量、快速检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片及制备和使用方法，适用于呼吸道病原体的高通量、快速检测。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.本发明的第一个目的是要提供一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片，该基因芯片用于同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型，所述基因芯片包括设置于载体上的若干个相同的探针阵列，每个探针阵列分别包含多个片基质控探针、多个阳性对照探针、多个甲型流感病毒特异性寡核苷酸探针、多个乙型流感病毒特异性寡核苷酸探针、多个腺病毒特异性寡核苷酸探针、多个呼吸道合胞病毒特异性寡核苷酸探针、多个人偏肺病毒特异性寡核苷酸探针、多个内标探针1、多个新型冠状病毒orf1ab基因特异性寡核苷酸探针2、多个新型冠状病毒n基因特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒1型特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒2型特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒3型特异性寡核苷酸探针、多个内标探针2、多个阴性对照探针、多个空白对照探针。
7.优选地，所述载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片中的一种。
8.本发明的第二个目的是要提供一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、获取新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、
人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型共九种病原体基因序列，在九种病原体基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针及特异性引物，每条探针的3’端加入12个碱基t且3’末端t用氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在载体上；片基质控探针为20t序列，片基质控探针3’末端t进行nh2修饰，5’端同时标记生物素bio标记；阴性对照探针为与呼吸道病原体无关的植物基因序列，用来指示特异性；
10.s2、将合成后的特异性寡核苷酸探针用去离子水稀释成100μm，分别取10μl探针溶液，和10μl芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μm，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用点样仪将特异性寡核苷酸探针点制在载体上形成探针阵列，每个探针的点样量均为3nl，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，点制好的芯片常温干燥保存，即得同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片。
11.进一步地，所述步骤s1中设计10条特异性寡核苷酸探针及8对引物，特异性寡核苷酸探针长度为31-44nt，引物长度为18-27nt。
12.本发明的第三个目的是要提供一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：
13.步骤一，提取呼吸道病毒核酸；
14.步骤二，多重不对称pcr扩增：扩增使用pcr试剂将整个扩增体系分为a、b两管，a管包括甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，人偏肺病毒，内标1；b管包括新型冠状病毒orf1ab基因，新型冠状病毒n基因，腺病毒，副流感病毒，内标2；扩增按以下循环参数进行扩增：50℃反转录20min，95℃预变性3min，95℃20s、60℃40s共40个循环，72℃延伸5min，4℃保存或进行下一步实验；
15.步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％sds和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的a管产物2.5μl和b管产物2.5μl与5μl杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；
16.步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1
×
ssc 0.2％sds、0.2
×
ssc和0.1
×
ssc中各清洗30s，最后将基因芯片表面液体离心干燥；
17.步骤五，样品标记：向芯片加入10μl标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；
18.步骤六，样品标记：向芯片加入10μl底物液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；
19.步骤七，样品标记：向芯片加入10μl纳米颗粒，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；
20.步骤八，成像：向芯片反应区加入1:1混合的显色液a和b组成的混合溶液30μl，用移液器涂匀后避光反应约5分钟，用纯净水冲洗终止显色反应，晾干后于可视化芯片成像仪上扫描成像；
21.步骤九，数据分析：成像结束后使用分析软件进行芯片探针信号分析，每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针cutoff值，探针信号值》该探针cutoff值的判读为该探针信号阳性。
22.进一步地，所述步骤二中pcr扩增使用的反向引物5’端修饰分子为cy3、cy5、生物素bio中的一种。
23.进一步地，所述步骤三中使用的杂交液组分为8
×
ssc，0.6％sds，10％甲酰胺，10
×
denhardt。
24.进一步地，所述步骤八中，显色试剂a液是浓度为1-5mg/ml的醋酸银，显色试剂b是浓度为5-20mg/ml的氢醌。
25.与现有技术相比，本发明建立了一种基于酪酰胺信号放大技术、可视化成像法的基因芯片，可同时甄别九种重要的呼吸道病原体，包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为呼吸道病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发明的基因芯片以对九种不同的呼吸道病原体进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片对九种呼吸道病原体的检测灵敏度能达到1000copies/ml。
附图说明
26.图1为本发明同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的阵列示意图。
27.图2为同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片上每个阵列上具体排列布局。
28.图3为同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片检测图；其中1-9依次为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型九种呼吸道病原体检测芯片检测结果。
29.图4为同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片特异性检测结果图；其中1-9依次为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型的检测结果图。
30.图5为九种呼吸道病原体体外转录rna和质粒dna参考品的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
32.实施例1
33.首先从ncbi基因数据库中下载这九种呼吸道病原体的靶基因序列，序列下载完成后，使用vector nti advance 10(invitrogen)软件包中的alignx程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对，根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性引物，选择新型冠状病毒n基因、新型冠状病毒orf1ab基因、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒选择f gene、甲型流感病毒选择ns gene、乙型流感病毒选择np gene、腺病毒选择aq gene、副流感病毒1型、2型、3型选择hn gene的编码区为扩增靶区域，可以实现九种呼吸道病毒靶基因片段的扩增。优选八对引物序列及其对应的扩增靶标，如表1所示。
34.表1
[0035][0036]
根据九种呼吸道病原体基因序列间的比对及每种病原体种内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。九种病原体特异性探针序列以及对应的靶标，如表2所示。
[0037]
表2
[0038][0039]
将合成后的特异性寡核苷酸探针用去离子水稀释成100μm，分别取10μl探针溶液，和10μl芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μm，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用personal arrayer
tm
16个人点样仪将特异性寡核苷酸探针点制在载体上形成探针阵列，每个探针的点样量均为3nl，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，点制好的芯片常温干燥保存，即得同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片，该基因芯片如图1，基因芯片包括设置于载体上的若干个相同的探针阵列(本实施例设置了10个探针阵列)，每个探针阵列上的探针排列布局如图2所示，图中一个圆点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。图2中：1号对应的是片基质控探针；2号对应的是阳性对照探针；3号对应的是甲型流感病毒特异性探针；4号对应的是乙型流感病毒特异性探针；5号对应的是腺病毒特异性探针；6号对应的是呼吸道合胞病毒特异性探针；7号对应的是人偏肺病毒特异性探针；8号对应的是内标探针1；9号对应的是新型冠状病毒orf1ab基因特异性探针2；10号对应的是新型冠状病毒n基因特异性探针；11号对应的是副流感病毒1型特异性探针；12号对应的是副流感病毒2型特异性探针；13号对应的是副流感病毒3型特异性探针；14号对应的是内标探针2；15号对应的是阴性对照探针；16号对应的是空白对照探针。
[0040]
实施例2
[0041]
使用上述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片对呼吸道病原体进行检测时，具体操作如下：
[0042]
步骤一，使用市售商品化病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取呼吸道病毒核酸；
[0043]
步骤二，多重不对称pcr扩增：本实施例所用的多重不对称pcr体系配方如表3所
示，扩增使用pcr试剂将整个扩增体系分为a、b两管，a管包括甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，人偏肺病毒，内标1；b管包括新型冠状病毒orf1ab基因，新型冠状病毒n基因，腺病毒，副流感病毒，内标2；扩增按以下循环参数进行扩增：50℃反转录20min，95℃预变性3min，95℃20s、60℃40s共40个循环，72℃延伸5min，4℃保存或进行下一步实验；
[0044]
表3
[0045][0046]
步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置于0.2％sds和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的a管产物2.5μl和b管产物2.5μl与5μl杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；
[0047]
步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1
×
ssc 0.2％sds、0.2
×
ssc和0.1
×
ssc中各清洗30s，最后将基因芯片表面液体离心干燥；
[0048]
步骤五，在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-hrp)，37℃水浴放25min；取出后用pbst洗液(1
×
pbs 0.05％tween20)清洗10s，重复3次，置室温晾干；在芯片反应区加入10μl底物液——生物素基酪氨酰胺(biotin-tyramide，bio-tyr)，37℃水浴放25min；取出后用pbst洗液(1
×
pbs 0.05％tween20)清洗10s，重复3次，置室温晾干；在芯片反应区加入10μl纳米颗粒——量子点标记的链霉亲和素(qds-sa)，37℃水浴放25min；取出后用pbst洗液(1
×
pbs 0.05％tween20)清洗10s，重复3次，置室温晾干。
[0049]
步骤六，将显色试剂a液(浓度为1-5mg/ml的醋酸银)和b液(浓度为5-20mg/ml的氢醌)等体积混合，每个芯片反应区立即加入30μl的a、b混合液，避光显色4-5分钟，待基因芯片上出现清晰黑色圆点信号后，用去离子水终止显色反应，晾干；将基因芯片放入便携式生物芯片成像仪中扫描成像，收集的芯片杂交信号使用arrayvision7.0分析软件进行芯片探针信号分析，每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针cutoff值，探针信号值》该探针cutoff值的判读为该探针信号阳性。
[0050]
特异性是诊断方法最重要的考核指标，使用上述实施例的基因芯片分别检测了新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感
病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型，由附图4可以看出，图4中1-9依次为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型的检测结果图，上述病毒检测结果都呈阴性，特异性良好。本发明检测九种呼吸道病原体，由附图3可以看出，九种病原体可以明显区分，图3中1-9依次为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型九种呼吸道病原体检测芯片检测结果，说明本发明特异性良好。
[0051]
实施例3
[0052]
进一步，为了验证本发明的基因芯片的检测灵敏度，构建九种病原体质粒dna作为检测参考品，从105copies/μl梯度稀释至1.0
×
101copies/μl，进行芯片检测，结果见附图5，图5中1-4依次为甲型流感病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；5-8依次为乙型流感病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；9-12依次为腺病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；13-16依次为呼吸道合胞病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；17-20依次为人偏肺病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；21-24依次为新型冠状病毒5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；25-28依次为副流感病毒1型5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；29-32依次为副流感病毒2型5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果；33-36依次为副流感病毒3型5.0
×
103copies/ml、2.5
×
103copies/ml、1.0
×
103copies/ml参考品和阴性对照检测结果。由附图5可以看出，本发明的检测限：九种病原体的检测限均能达到1
×
1000copies/ml。
[0053]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。