一种质粒重组单核细胞增多性李斯特菌及其构建方法和应用

技术特征：
1.一种质粒重组单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，其所携带的质粒上克隆有绿色荧光蛋白基因gfp。2.如权利要求1所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，所述绿色荧光蛋白基因gfp的序列如seq id no.1所示。3.一种质粒重组单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，所述质粒重组单核细胞增多性李斯特菌为listeria monocytogenes cctcc-lm1055，保藏编号为cctcc no:m20211306。4.一种如权利要求1-3任一项所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、pcr扩增gfp基因，获得的pcr扩增产物与pksv7质粒连接获得重组质粒pksv7-gfp；步骤二、将所述的重组质粒pksv7-gfp转化至单核细胞增多性李斯特菌，获得所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌。5.一种如权利要求1-3任一项所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌用作内标菌的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌在作为从动物粪便中提取细菌质粒组dna中的内标菌中的应用。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述质粒重组单核细胞增多性李斯特菌的应用，其在用于计算和/或监测动物粪便中的细菌质粒组dna的提取率中的应用。8.一种从动物粪便样品中提取细菌质粒dna的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将上述所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌与动物粪便混合，裂解提取并得到细菌质粒组dna；2)检测所提取质粒组dna中gfp基因的拷贝量，计算得到粪便样品中细菌质粒组dna的提取率。9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中，以动物粪便的总质量为基准计，所述的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌的添加量为1
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107cfu/g；和/或，步骤2)中，gfp基因的拷贝量采用荧光定量pcr检测，采用的pcr引物的序列分别如seq id no.4所示序列和seq id no.5所示。10.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，步骤1)的混合质粒重组单核细胞增多性李斯特菌与动物粪便后，还包括如下步骤：(1)均质处理；滤膜过滤，过滤液离心，收集沉淀a；(2)沉淀a与溶菌酶在缓冲液中作细胞壁裂解反应，固液分离，收集沉淀b；(3)沉淀b与sds、醋酸钾和rnase a在缓冲液中进行裂解、凝聚，固液分离，收集质粒组dna粗提物上清液；(4)粗提物上清液用苯酚、氯仿和异戊醇纯化后，用异丙醇沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤后，灭菌水溶解，获得纯化的质粒组dna溶液。

技术总结
本发明公开了一种质粒重组单核细胞增多性李斯特菌，其所携带的质粒上克隆有绿色荧光蛋白基因GFP。本发明还公开了所述质粒重组单核细胞增多性李斯特菌的构建方法和应用。本发明的质粒重组单核细胞增多性李斯特菌，可以作为内标菌从动物粪便中提取细菌质粒组DNA。且作为内标菌检测粪便中的细菌质粒组DNA提取率具有特异性。具有特异性。


技术研发人员：林颖峥 魏人杰 李树清 桑益旸 王恒安 周琬 陈志飞
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2022/7/29