一种PHA复合材料、PHA微球的制备方法及其应用与流程

一种pha复合材料、pha微球的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于材料技术领域，具体涉及一种pha复合材料、pha微球的制备方法及其应用。


背景技术：

2.随着人类年龄增长或受某些疾病影响，人体中肌肉和胶原蛋白组织会产生不同程度的功能性退化，造成皮肤凹陷、胃液反流等问题，因此人们发明了多种填充剂，以此来填补凹陷皮肤或通过异物刺激肌肉和胶原蛋白的再生长，如玻尿酸、牛胶原蛋白等。但这些物质作为填充剂所起到的填充效果维持时间较短，需要频繁在注射保持其填充效果。为达到长期填充效果，人们又尝试使用生物的不可降解的材料制作成微球作为填充剂，如聚乙烯醇(pva)，聚甲基丙基酸甲酯(pmma)等。尽管这些填充剂的填充效果维持时间明显增长，但这些材料在体内留存过久，会释放有害物质，并因此引发一系列的副反应，危害人体健康。
3.近年来，生物可降解的高分子材料走入人们的视野，该类型材料对人体无毒无排斥反应，并可以随着人体代谢逐渐降解后排出体外，且可以通过调节材料的分子量等参数，使降解时间从一周到长达数年不等。聚羟基脂肪酸酯，英文名为polyhydroxyalkanoates，简称pha，是一种天然的高分子生物材料，由微生物合成的一种细胞内聚酯。由于pha具有良好的生物相容性能、生物可降解性，是当下最为理想的生物医学材料之一。pha在体内与细胞具有良好的细胞相容性，细胞可以在此种支架上良好生长，且该种支架可以降解为co2和h2o。
4.目前，在将pha材料制备可注射微球时，通常是制备纯pha微球，或者通过化学合成的pha复合材料，纯的pha微球是疏水性的，其静态水接触角大于150度，无法与细胞进行良好地粘附，用于组织填充时，其相容性差。且，目前pha微球的粒径高，分散性高，利用其作为医美注射微球时，还需要对其进行筛分，步骤繁琐。
5.因此，亟需提供一种pha微球的制备方法，能够制备出具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控的pha微球。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种pha微球的制备方法，能够制备出具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控的pha微球。
7.本发明第一方面提供了一种pha复合材料的制备方法。
8.具体地，一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
9.将pha溶于溶剂中，然后与聚合物混合，再去溶剂，制得所述pha复合材料；
10.所述聚合物为聚乙二醇(peg)、胶原蛋白、透明质酸或聚赖氨酸中的一种。
11.优选地，所述聚合物为聚乙二醇，如peg4000、peg6000等。聚乙二醇具有优异的水溶性、生理惰性、温和性、润滑性等。通过选用聚乙二醇对pha改性，可以提高pha的亲水性，
使其具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性。
12.优选地，所述pha(聚羟基脂肪酸酯)包括但不限于聚-β-羟丁酸(phb)，3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(phbv)，3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯(phbhhx)，以及聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(p34hb)。
13.优选地，所述pha的重均分子量为20000-1000000；进一步优选地，所述pha的重均分子量为30000-200000。
14.优选地，所述聚乙二醇的重均分子量为400-20000。通进一步优选地，所述聚乙二醇的重均分子量为2000-10000。过对聚乙二醇的分子量进行控制，可以进一步提高pha复合材料的细胞粘附性。
15.优选地，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的至少一种。
16.优选地，所述聚合物占所述pha复合材料的质量的1％-90％；进一步优选地，所述聚合物占所述pha复合材料的质量的10％-80％；更优选地，所述聚合物占所述pha复合材料的质量的20％-60％。
17.优选地，所述去溶剂的过程为于20-100℃下旋转蒸发后，进行冷冻干燥。
18.更为具体地，一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
19.向重均分子量为2000-1000000的pha中加入溶剂，制备浓度为5-40mg/ml的pha溶液；然后取400mlpha溶液，然后加入聚乙二醇(peg)、胶原蛋白或聚赖氨酸中的一种，搅拌溶解，于20-100℃下旋转蒸发，进行冷冻干燥，制得pha复合材料。
20.本发明第二方面提供了一种pha微球的制备方法。
21.具体地，一种pha微球的制备方法，包括以下步骤：
22.将上述制备方法制得的pha复合材料溶于溶剂中，得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得水相；将所述油相和所述水相混合得混合物，将所述混合物乳化后，固化，即制得pha微球。
23.优选地，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的至少一种。
24.优选地，在所述油相中，所述pha复合材料的质量浓度为0.1-80mg/ml；进一步优选地，在所述油相中，所述pha复合材料的质量浓度为5-60mg/ml；更优选地，在所述油相中，所述pha复合材料的质量浓度为10-50mg/ml。
25.优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.1％-8％；进一步优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.5％-5％；更优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.5％-3％。
26.优选地，所述油相和所述水相的体积比为1：(3-15)；进一步优选地，所述油相和所述水相的体积比为1：(5-10)。
27.优选地，所述乳化的压强为0.005-0.05mpa；进一步优选地，所述乳化的压强为0.005-0.03mpa；更优选地，所述乳化的压强为0.008-0.015mpa。因为人体吞噬细胞的存在，用于医美的pha微球的直径通常需要在20μm以上，但微球过大又会堵塞针头，甚至引起皮肤破裂。因此用于注射的微球粒径通常为20-60μm。本技术通过对制备方法的控制，尤其是乳化中压强的控制，能够使pha微球的粒径控制在20-60μm，其分布均匀，可较少筛分的工艺。
28.优选地，所述固化的过程为向乳化后的混合物中加入水，搅拌，去溶剂。
29.选选地，所述去溶剂的过程包括挥发法、固液分离法和喷雾干燥法等。
30.更为具体地，一种pha微球的制备方法，包括以下步骤：
31.将上述制备方法制备的pha复合材料溶于溶剂中，配制成质量浓度为0.1-80mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得质量百分比为0.1％-8％的水相；然后将所述油相和所述水相按照1：(3-15)的体积比混合，得混合液；再将所述混合液于0.005-0.05mpa的压强下进行乳化，最后经固化，干燥，制得所述pha微球。
32.本发明第三方面提供了一种pha微球。
33.具体的，一种pha微球，由上述制备方法制得，所述pha微球的粒径为20-60μm；所述pha微球的静态水接触角为60-90度；所述pha微球对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g。
34.优选地，所述pha微球的粒径为20-40μm；所述pha微球的静态水接触角为60-80度；所述pha微球对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g。
35.优选地，所述聚合物占所述pha微球的质量的1％-90％；进一步优选地，所述聚合物占所述pha微球的质量的10％-80％；更优选地，所述聚合物占所述pha微球的质量的20％-60％。
36.本发明第四方面提供了上述pha微球在制备组织填充物或医美产品中的应用。
37.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
38.(1)本发明采用聚合物聚乙二醇(peg)、胶原蛋白或聚赖氨酸对pha进行改性，制得pha复合材料；再利用该pha复合材料为油相，与水相进行乳化，制备pha微球。通过对原料和工艺的控制，使制得的pha微球的粒径能够控制在20-60μm，静态水接触角为60-90度，对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g；具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控，能够广泛应用于制备组织填充物和医美产品。
39.(2)本发明提供的制备方法简单，操作步骤少，不需要复杂的筛分就能得到均一的pha微球。
附图说明
40.图1为实施例1制备的pha微球的扫描电镜图；
41.图2为实施例1制备的pha微球的粒径分布图；
42.图3为牛血清白蛋白吸附实验中的标准曲线图。
具体实施方式
43.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
44.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
45.实施例1
46.一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
47.以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/ml的p34hb(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁
酸酯)，重均分子量为3-6w)溶液；然后取400ml p34hb溶液，加入8g peg4000，搅拌溶解，放入1l的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得pha复合材料(peg4000&p34hb)。
48.一种pha微球的制备方法，包括以下步骤：
49.(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的pha复合材料配制成质量浓度为30mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；
50.(2)将聚乙烯醇(pva)溶于280ml水中，配制pva质量浓度为1.5％的水相；取40ml步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
51.(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015mpa，检查气密性：0.03mpa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012mpa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280ml水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得pha微球。实施例1制备的pha微球的扫描电镜图如图1所示，由图1可知，微球的粒径均一，球形良好。
52.实施例2
53.一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
54.以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/ml的pha(pha的重均分子量为3-6w)溶液；然后取400ml p34hb溶液，加入0.89g peg4000，搅拌溶解，放入1l的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得pha复合材料(peg4000&p34hb)。
55.一种pha微球的制备方法，包括以下步骤：
56.(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的pha复合材料配制成质量浓度为30mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；
57.(2)将聚乙烯醇(pva)溶于280ml水中，配制pva质量浓度为1.5％的水相；取40ml步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
58.(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015mpa，检查气密性：0.03mpa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012mpa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280ml水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得pha微球。
59.实施例3
60.一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
61.以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/ml的p34hb(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6w)溶液；然后取400ml p34hb溶液，加入3.4g peg4000，搅拌溶解，放入1l的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得pha复合材料(peg4000&p34hb)。
62.一种pha微球的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的pha复合材料配制成质量浓度为30mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；
64.(2)将聚乙烯醇(pva)溶于280ml水中，配制pva质量浓度为2.0％的水相；取40ml步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
65.(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015mpa，检查气密性：0.03mpa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012mpa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280ml水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得pha微球。
66.对比例1
67.一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
68.以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/ml的p34hb(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6w)溶液；然后取400ml p34hb溶液，加入100g peg4000，搅拌溶解，放入1l的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得pha复合材料(peg 4000&p34hb)。
69.一种pha混合物的制备方法，包括以下步骤：
70.(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的pha复合材料配制成质量浓度为30mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；
71.(2)将聚乙烯醇(pva)溶于280ml水中，配制pva质量浓度为1.5％的水相；取40ml步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
72.(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015mpa，检查气密性：0.03mpa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012mpa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280ml水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得pha混合物。在该方法下所制得的材料，球形皱缩严重，95％呈不规则碎片状，无法制成微球。
73.对比例2
74.一种pha复合材料的制备方法，包括以下步骤：
75.以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/ml的p34hb(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6w)溶液；然后取400ml p34hb溶液，加入90g peg4000，搅拌溶解，放入1l的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得pha复合材料(peg 4000&pha)。
76.一种pha混合物的制备方法，包括以下步骤：
77.(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的pha复合材料配制成质量浓度为30mg/ml的pha复合材料溶液，即得到油相；
78.(2)将聚乙烯醇(pva)溶于280ml水中，配制pva质量浓度为1.5％的水相；取40ml步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
79.(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015mpa，检查气密性：0.03mpa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012mpa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280ml水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得pha混合物。此方法下无法成球，制备的材料呈块状。
80.对比例3
81.对比例3为实施例1中使用的纯p34hb(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6w)。
82.产品效果测试
83.(1)静态水接触角数据
84.在室温下，将实施例1-3制备的pha微球和对比例3中纯pha，进行干燥，然后放到静态接触角测定仪上进行测试，分别在每个试样取六个点进行测量，计算平均值。
85.(2)采用激光粒度仪分析pha微球的粒径分布，测试pha微球的平均粒径以及span值(粒径分布离散程度)。
86.(3)牛血清白蛋白(bsa)吸附实验
87.a.绘制蛋白生长曲线：将bsa配成3mg/ml的溶液，用分光光度计全波长扫描，检测蛋白的最大吸收波长为278.58nm。然后配置0.5、1、1.5、3、4、5mg/ml等系列浓度梯度的溶液，在278.58nm处检测各浓度的溶液的吸光值，绘制标准曲线。标准曲线如图3所示。
88.b.然后配制5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，分别孵育实施例1-3制备的pha微球，具体孵育过程为：取10ml牛血清白蛋白溶液，分别加入0.03g实施例1-3制备的pha微球，于25℃下孵育5小时，然后检测孵育后牛血清白蛋白溶液(上清溶液)的吸光值，根据标准曲线计算具体的吸附浓度。
89.测试结果如表1所示。
90.表1
[0091][0092]
由表1可知，经检测，纯pha的静态水接触角为155度，而实施例1-3经过peg改性后制备的pha微球的静态水接触角在60-90度之间，尤其实施例1和3制备的pha微球的静态水接触角在60-80度，还出现散晕，细胞能够更好地粘附、培养，更适用于组织填充、医美注射等。且经过检测，实施例1-3制备的pha微球各个点位、正反、内外部的接触角都基本一致，其均匀度高，材料具有一体性。
[0093]
由表1可知，本发明制备的pha微球的平均粒径在20-60μm，更精确的为20-40μm，且span值较小，粒径分布集中。其中实施例1制备的pha微球的粒径分布图如图2所示。本发明通过对原料组分的选择以及乳化压力的控制，能够将pha微球的粒径控制在20-60μm，其分布均匀，可较少筛分的工艺。
[0094]
生物材料与生理环境相接触时，生物材料想要在体内不被排斥，没有严重的填充物相关副作用，需要很好的细胞粘附性，而细胞粘附性中一个很重要的点，在于细胞表面粘附有大量蛋白，而蛋白吸附是一个重要的细胞粘附推动力。ct1电荷球是常用的细胞培养微载体，数值越高，蛋白吸附性越好。经测试ct1电荷球吸附牛血清白蛋白的值600μg/g。由表1可知，实施例1制备的pha微球对牛血清白蛋白的吸附浓度为4800μg/g；实施例2制备的pha微球对牛血清白蛋白的吸附浓度为4100μg/g；实施例3制备的pha微球对牛血清白蛋白的吸
附浓度为4300μg/g。经对比分析，本发明制备的pha微球具有优异的蛋白吸附性，吸附浓度是ct1电荷球的7-8倍，进而表明其具有优异的细胞粘附性，可以用于医美填充、细胞培养、植入医疗器械等。
[0095]
实验发现，其他pha材料，如聚-β-羟丁酸(phb)，3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(phbv)，3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯(phbhhx)，采用相同的方法制备pha微球材料，能够达到类似的效果。