一种制备卟啉锌纳米空心球的方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种制备卟啉锌纳米空心球的方法及其应用，属于纳米材料技术领域。


背景技术：

2.传统的癌症治疗方法有手术切除、放疗、化疗等，这些方法虽然能在一定程度上缓解病情，但有严重的副作用，给患者带来极大的痛苦，同时，这些方法难以抑制癌症复发和转移，因此整体治疗效率低下。
3.近年来，纳米医学的快速发展为解决传统癌症治疗方法的难题提供了新思路。纳米材料较高的水溶性，良好的生物相容性和靶向性，能精准破坏癌细胞，并且最大限度减轻了对正常组织的伤害，因此兴起了癌症光疗法。
4.光疗法包括光动力疗法(pdt)和光热疗法(ptt)。其中，光动力疗法是指光敏剂在特定波长的光照下，将氧分子转化成细胞毒性活性氧(ros)，特别是导致细胞死亡的单线态氧(1o2)。光热疗法则是将光敏剂注射入生物体内部，通过靶向识别和epr效应聚集在肿瘤部位，并在激光照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞。光动力疗法和光热疗法均为非侵入性的癌症治疗方法，能最大限度减轻副作用，在肿瘤治疗方面极具应用前景。
5.卟啉及其衍生物具有高效光动力和光热转换特性，因此通常作为光敏剂同时用于癌症的光动力治疗以及光热治疗。然而，由于具有水溶性较低，在近红外区域吸收率较低，不具备靶向性等缺陷，卟啉及其衍生物在肿瘤治疗的临床应用上受到诸多因素的限制。
6.为了实现卟啉及其衍生物在肿瘤上的高效治疗，研究者们开发了一系列新的卟啉基系统(具体可参见文献：“梁文青.以卟啉基金属聚合物为前体合成多功能磁性纳米材料及其应用研究[d].太原理工大学,2016.”、“王奎.卟啉基纳米材料的制备及其抗肿瘤研究[d].中国科学技术大学,2019.”和“张玉.卟啉衍生物纳米粒子的制备及其在增强光动力疗法中的应用[d].东北师范大学， 2020”等)，这些新的卟啉基系统虽然在一定程度上提高了卟啉及其衍生物的肿瘤治疗效果，但是仍难以达到预期目标。
[0007]
同时，若要同时实现卟啉及其衍生物在肿瘤光动力治疗和肿瘤光热治疗上的效果，通常需要两种不同吸收波长的光敏剂，因此需要两个激发光源，这无疑增大了使用卟啉及其衍生物进行肿瘤治疗的操作难度，同时，降低了使用卟啉及其衍生物进行肿瘤治疗的治疗效果。


技术实现要素：

[0008]
为解决上述缺陷，本发明提供了一种制备卟啉锌纳米空心球的方法，所述方法为：将卟啉锌衍生物溶解于酸性溶液中，得到溶解液；将溶解液与表面活性剂溶液混合，得到ph为5～8的反应体系；将反应体系进行反应，得到含有卟啉锌纳米空心球的反应液；将反应液进行分离，得到卟啉锌纳米空心球。
[0009]
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的ph为7～8。
[0010]
在本发明的一种实施方式中，所述卟啉锌衍生物为四苯基卟啉锌。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，所述酸性溶液为盐酸溶液、冰醋酸溶液、硝酸溶液或硫酸溶液中的一种或一种以上。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述酸性溶液为浓度0.1～2mm的盐酸水溶液。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，所述酸性溶液为浓度0.65mm的盐酸水溶液。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述溶解液中，四苯基卟啉锌的浓度为 0.1～2mg/ml。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述溶解液中，四苯基卟啉锌的浓度为 1～2mg/ml。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液、十六烷基三甲基氯化铵溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液或聚乙二醇溶液中的一种或一种以上。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂溶液为浓度5～500mm的十六烷基三甲基溴化铵溶液。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂溶液为浓度10～20mm的十六烷基三甲基溴化铵溶液。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，所述溶解液与十六烷基三甲基溴化铵溶液的混合体积比为0.5～20:1。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，所述溶解液与十六烷基三甲基溴化铵溶液的混合体积比为0.5～1.5:1。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为：于避光、4000～8000rpm 下搅拌0.5～24h。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为：于避光、4500～6500rpm 下搅拌5～15h。
[0023]
本发明还提供了一种卟啉锌纳米空心球，所述卟啉锌纳米空心球由上述方法制得。
[0024]
本发明还提供了一种肿瘤光热治疗药物，所述药物含有上述卟啉锌纳米空心球。
[0025]
本发明还提供了上述方法或上述卟啉锌纳米空心球在制备肿瘤光热治疗药物中的应用。
[0026]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0027]
1、本发明提供了一种卟啉锌纳米空心球，所述卟啉锌纳米空心球是通过将四苯基卟啉锌和十六烷基三甲基溴化铵于ph为5～8的反应体系中进行反应制得的；所述卟啉锌纳米空心球能够高效地在光照下产生单线态氧，具有良好的水溶性和生物相容性，能够高效地被癌细胞摄取，并且，能够在光照下高效杀死癌细胞，因此，使用所述卟啉锌纳米空心球进行肿瘤光动力治疗和肿瘤光热治疗的治疗效果好；所述卟啉锌纳米空心球能够在同一激发波长下表现出高效的光动力和光热效果，因此，使用所述卟啉锌纳米空心球进行肿瘤光动力治疗和肿瘤光热治疗时，仅需一个激发光源，这无疑降低了使用卟啉及其衍生物进行肿瘤治疗的操作难度，同时，有助于进一步增加使用卟啉及其衍生物进行肿瘤治疗的治疗效果。
[0028]
2、本发明提供了一种制备卟啉锌纳米空心球的方法，所述方法为将四苯基卟啉锌
和十六烷基三甲基溴化铵于ph为5～8的反应体系中进行反应；所述方法仅需使用四苯基卟啉锌和十六烷基三甲基溴化铵这两种反应原料以及酸性溶液这一种种反应ph调节剂，并且，所述方法仅有一步反应，因此，所述方法具有制备原料简单易得、制备方法简单的优势，易实现规模化生产，极具工业化前景。
[0029]
进一步地，所述反应体系的ph为7～8；此ph下可以更好地控制纳米粒子的形貌，合成预期尺寸的粒子，该预期尺寸的粒子能更好地进入细胞，提高使用卟啉及其衍生物进行肿瘤治疗的后续治疗效果。
附图说明
[0030]
图1：水溶液中卟啉锌纳米空心球的透射电镜(tem)照片。
[0031]
图2：水溶液中卟啉锌纳米空心球的紫外-可见吸收光谱。
[0032]
图3：水溶液中卟啉锌纳米空心球的荧光光谱(450nm激发)。
[0033]
图4：水溶液中卟啉锌纳米空心球的荧光光谱(650nm激发)。
[0034]
图5：卟啉锌纳米空心球水溶液在光照下的温度变化曲线(650nm， 0.5w/cm2)。
[0035]
图6：卟啉锌纳米空心球水溶液在光照下的单线态氧生成(650nm， 0.5w/cm2)。
[0036]
图7：卟啉锌纳米空心球在4t1细胞中荧光成像图片。
[0037]
图8：卟啉锌纳米空心球在活死细胞中的染色荧光图片。图8中，-：未进行光照， ：光照，650nm、0.5w/cm2、2min。
[0038]
图9：不同反应液的透射电镜(tem)照片。
具体实施方式
[0039]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0040]
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0041]
实施例1：一种制备卟啉锌纳米空心球(nps)的方法
[0042]
本实施例提供了一种制备实施例1所述卟啉锌纳米空心球的方法，所述方法为：将5mg四苯基卟啉锌溶解在5ml盐酸水溶液(hcl:0.65mm)中后，于室温(25℃)、25khz下超声5min，得到溶解液；将溶解液添加至5ml十六烷基三甲基溴化铵水溶液中(ctab:15mm)，得到ph为7.5的反应体系；将反应体系于避光、5000rpm下搅拌12h，得到反应液；将反应液于8000rpm下离心10min，收集沉淀；将沉淀用纯净水洗涤后，于8000rpm下离心10min，待离心结束后，再次收集沉淀，即得卟啉锌纳米空心球(cds)。
[0043]
实施例2：一种卟啉锌纳米空心球(nps)
[0044]
本实施例提供了一种卟啉锌纳米空心球(nps)，所述卟啉锌纳米空心球是由实施例1的方法制备得到的。
[0045]
实验例1：卟啉锌纳米空心球的性能检测实验
[0046]
本实验例提供了实施例2所述卟啉锌纳米空心球的性能检测实验，实验方法及结果如下：
[0047]
实验一：取10μg实施例2的卟啉锌纳米空心球溶于5ml去离子水，得到卟啉锌纳米空心球水溶液；用h-600透射电子显微镜(fei，美国)拍摄卟啉锌纳米空心球水溶液，得到水溶液中卟啉锌纳米空心球的透射电镜(tem)照片，照片见图1。从图1中可以看出，水溶液中的卟啉锌纳米空心球呈均一空心球结构，粒径约为30nm。
[0048]
实验二：取10μg卟啉锌溶于5ml去离子水，得到卟啉锌原溶液；以卟啉锌原溶液为对照，取实验一制得的卟啉锌纳米空心球水溶液，用紫外-可见光分光光度计(hitachi，日本)检测卟啉锌纳米空心球水溶液，得到水溶液中卟啉锌纳米空心球的紫外-可见吸收光谱图，以及，水溶液中卟啉锌纳米空心球在 450nm和650nm激发下的荧光光谱图，检测结果见图2～4。从图2中可以看出，卟啉锌纳米空心球不仅在q带有明显的吸收，在625nm左右，也有明显的吸收峰，而卟啉锌原溶液并不具备这一特性，此结果证明了卟啉锌纳米空心球的形成。从图3中可以看出，卟啉锌纳米空心球与卟啉锌原溶液相似，在600～700nm 有明显的荧光发射，在675nm有明显的发射峰，呈红色，同时，卟啉锌纳米空心球在820nm处出现一个荧光发射峰，而卟啉锌原溶液在该波段无明显的发射。从图4中可以看出，在650nm激发下，卟啉锌纳米空心球在近红外波段有明显的荧光发射，在820nm有明显的发射峰，而卟啉锌原溶液在该波段并无荧光发射。以上实验结果说明，卟啉锌纳米空心球在近红外区域有明显的荧光发射，因此可应用于肿瘤光热治疗。
[0049]
实验三：以去离子水为对照，取实验一制得的卟啉锌纳米空心球水溶液使用激光器于650nm、0.5w/cm2下进行光照，光照过程中，不间断地使用温度计检测卟啉锌纳米空心球水溶液的温度，检测结果见图5。分析图5可以看出，卟啉锌纳米空心球水溶液的温度随光照时间的增加不断升高，光照10min后，温度升高到60.6℃，而水在同等条件下温度没有明显的变化，此结果说明卟啉锌纳米空心球在光照下具有优异的光热转换能力，有利于肿瘤光热治疗。
[0050]
实验四：取实验一制得的卟啉锌纳米空心球水溶液，在卟啉锌纳米空心球水溶液中加入5μl单线态氧绿色荧光探针sosg工作溶液(1μm，购自碧云天生物技术公司)，得到混合液；将混合液置于比色皿中，使用激光器于650nm、 0.5w/cm2下进行光照，光照过程中，间隔2h使用荧光分光光度计检测混合液的荧光强度，检测结果见图6。分析图6可以看出，随着光照时间的增加，混合液的荧光强度不断增强，此结果证明卟啉锌纳米空心球在光照下能高效产生单线态氧，有利于肿瘤光热治疗。
[0051]
实验五(细胞内吞实验)：取实施例2的卟啉锌纳米空心球溶于5mlpbs 缓冲液(购自赛默飞)，得到卟啉锌纳米空心球浓度为3mg/ml的混合液；将 4t1细胞(购自中科院上海细胞库)以5
×
103cfu/ml的接种量接种于添加有 1ml dmem培养基(购自赛默飞)的培养皿中后，于培养箱(37℃，5％co2) 中孵育24h，孵育结束后，在培养皿中加入0.5ml混合液，于培养箱(37℃， 5％co2)再次孵育4h，再次孵育结束后，移除培养皿中的培养基，并用pbs 缓冲液冲洗培养皿3次，冲洗结束后，将1μl dapi荧光染料(购自碧云天生物技术公司)添加到培养皿中，于培养箱(37℃，5％co2)中放置5min对培养皿中4t1细胞的细胞核进行标记，标记结束后，使用pbs缓冲液重新冲洗培养皿3次，重新冲洗结束后，将培养皿在荧光显微镜下观察，观察结果见图7。分析图7可以看出，卟啉锌纳米空心球可进入细胞内并呈现明亮的红
色荧光，同时，卟啉锌纳米空心球并未进入细胞核，此结果说明卟啉锌纳米空心球可以高效地被细胞内吞，有利于肿瘤光热治疗。
[0052]
实验六(活死细胞染色实验)：实验分为四组，四组分别为对照组1、对照组2、实验组1以及实验组2，其中，对照组1为：将4t1细胞(购自中科院上海细胞库)以5
×
103cfu/ml的添加量接种至培养皿；对照组2为：将4t1 细胞(购自中科院上海细胞库)以5
×
103cfu/ml的添加量接种至培养皿后，将培养皿使用激光器于650nm、0.5w/cm2、2min下进行光照；实验组1为：将4t1细胞以5
×
103cfu/ml的添加量接种至添加有0.5ml实验五制得的混合液的中培养皿中后，于培养箱(37℃，5％co2)中共同孵育4h，孵育结束后，移除培养皿中的培养基，并用pbs缓冲液冲洗培养皿3次，冲洗结束后，将培养皿使用激光器于650nm、0.5w/cm2、2min下进行光照；实验组2为：将4t1细胞以5
×
103cfu/ml的添加量接种至添加有0.5ml实验五制得的混合液的中培养皿中后，于培养箱(37℃，5％co2)中共同孵育4h，孵育结束后，移除培养皿中的培养基，并用pbs缓冲液冲洗培养皿3次；待对照组2和实验组1光照结束后，用活死细胞试剂盒(购自碧云天生物技术公司)对四组培养皿中的4t1 细胞进行标记，标记结束后，将四组培养皿置于荧光显微镜下观察，观察结果见图8。分析图8可以看出，实验组1培养皿中，卟啉锌纳米空心球进入细胞，经过光照后，细胞几乎全部死亡，而实验组2培养皿中的细胞生长状态良好，与对照组1培养皿中的细胞没有明显区别，同时，对照组2培养皿中的细胞生长状态也十分良好，与对照组1培养皿中的细胞没有明显区别，此结果说明，单纯的光照对细胞生长没有明显的影响，而卟啉锌纳米空心球在光照下能高效杀死癌细胞，因此可应用于肿瘤光热治疗。
[0053]
实验例2：ph对卟啉锌纳米空心球生成的影响实验
[0054]
本实验例提供了ph对实施例2所述卟啉锌纳米空心球生成的影响实验，实验方法及结果如下：
[0055]
在实施例1的基础上，其余条件不变，仅调节盐酸水溶液的用量，将反应体系的ph由7.5分别调整为2、4、10，得到反应液1～3。
[0056]
用h-600透射电子显微镜(fei，美国)拍摄反应液1～3，得到反应液1～3 的透射电镜(tem)照片，照片见图9。从图1中可以看出，ph为2～4时反应没有生成形貌规则的粒子，当ph为10时，形成1～2μm的棒状粒子，此结果说明以上条件下无法形成规则的卟啉锌纳米空心球。
[0057]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。