一种水果混菌发酵除臭剂及其制备方法与流程

1.本发明属于生物除臭领域，具体涉及一种水果混菌发酵除臭剂及其制备方法。


背景技术：

2.随着我国果园种植面积逐年递增，水果产量也逐年升高。同时伴随着科学技术的进步和人民生活消费水平的提高，消费者对水果品质的要求也越来越高，因此残次果数量也逐年升高。如果对这部分水果直接丢弃会造成大量浪费。
3.好氧堆肥及干化焚烧是国内目前残次果最主要的两种处理方式。堆肥在生产上需要占用相当的空间；干化焚烧在处理中会产生大量有害气体，不仅大量可被利用的残次果被浪费，同时也给环境带来二次污染和危害。
4.混菌发酵技术是以残次果为原料，利用科学复配的微生物菌群对水果原料进行发酵的处理技术。传统发酵多采用自然发酵的方式，利用水果表面自然附着的酵母菌、乳酸菌、米曲霉等微生物进行发酵，发酵时间长，且易受杂菌污染，发酵成品质量参差不齐。如果采用人工接种的方式进行发酵，则菌种的选择及复配对发酵成品的制备时间及质量起关键性作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种水果混菌发酵除臭剂及其制备方法。
6.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，于2021年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23388。
7.相应的，一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其16s rdna 序列如seq id no:1所示。
8.相应的，所述植物乳杆菌在除臭中的应用。
9.相应的，利用所述植物乳杆菌制备的除臭剂。
10.优选的，利用包括所述植物乳杆菌的混合微生物发酵获得。
11.优选的，所述混合微生物中包括醋酸醋杆菌(acetobacterium sp.)。
12.优选的，所述醋酸醋杆菌的保藏编号为：cgmcc no.23389。
13.优选的，按活菌比，植物乳杆菌与醋酸醋杆菌的用量比为2:3。
14.优选的，所述混合微生物中，活菌浓度≥2
×
108cfu/ml。
15.优选的，所述发酵的底物为水果。
16.本发明具有以下有益效果：
17.发明人研究发现，使用单一菌种会使发酵成品功能欠佳，如单独使用乳酸菌或醋酸菌发酵，会导致发酵成品的单一种类的酸占比过大，同时发酵时间较长；而单独使用酵母菌会导致发酵成品酒味变浓，不利于后期除臭功能的实现。因此本产品利用筛选出的高效
耐高温乳酸乳杆菌和醋酸醋杆菌作为混菌发酵菌种，通过科学复配实现菌株间的互利共生，同时首创40℃高温发酵，有效提升了发酵效率，大幅缩短了发酵时间，从而节省发酵成本。
18.经筛选出的植物乳杆菌和醋酸醋杆菌在发酵进程中协同作用，分工明确。发酵前期，醋酸菌通过消耗营养物质，产生大量醋酸等有机酸，抑制水果表面自带的某些霉菌，同时制作低ph的环境，利于植物乳杆菌的生长，引导发酵进程迅速进入发酵后期。发酵后期，在低ph条件下，植物乳杆菌起主导作用，产生乳酸等有机酸。从而是发酵产物中含有多种有机酸，可共同发挥作用。
19.发酵成品中，总酸含量高、有益菌数量大，可以用于公共厕所、畜禽养殖场畜禽舍、粪污储存池等恶臭污染源的治理。发酵成品中，有机酸、活菌和芳香物质共同发挥除臭效果，有机酸可在添加除臭剂初期降低整体待处理体系中的ph，一方面抑制体系中产臭菌的生长，另一方面也可为除臭剂中的乳酸菌、醋酸菌提供良好的生长环境。一段时间后，体系中乳酸菌、醋酸菌占据体系中的主导地位，通过占位作用抑制产臭菌生长，发挥持久的抑菌除臭效果。同时，发酵成品中含有多种芳香类、酯类化合物，一方面可对臭气进行遮蔽作用，另一方面也与臭气化合物发生化学反应以减少臭气浓度，使恶臭组分降解为无味、无害的终产物。
附图说明
20.图1为植物乳杆菌的系统发育树图；
21.图2为醋酸醋杆菌的系统发育树图；
22.图3为植物乳杆菌的显微镜照片；
23.图4为植物乳杆菌的菌落示意图；
24.图5为醋酸醋杆菌的显微镜照片；
25.图6为醋酸醋杆菌的菌落示意图。
26.本发明提供了一种可制备除臭剂的微生物复合菌剂。所述微生物复合菌剂包括植物乳杆菌和醋酸醋杆菌。优选的方案为，所述植物乳杆菌为：cgmcc no.23388；所述醋酸醋杆菌为：cgmcc no.23389。优选的方案为：所述复合菌剂中，按活菌比，植物乳杆菌与醋酸醋杆菌的用量比为2:3。优选的方案为：所述复合菌剂中，活菌浓度≥2
×
108cfu/ml。
27.本发明还提供了所述微生物复合菌剂的制备方法。
28.1、菌株活化。将菌种从保藏状态恢复到室温状态，通过无菌划线操作于固体平板对其进行3代的复壮过程，使其逐渐适应培养环境。植物乳杆菌接入mrs固体培养中活化备用，醋酸醋杆菌接入gyc固体培养基中活化备用。
29.2、菌株发酵培育。将活化后的植物乳杆菌接入mrs液体培养基，醋酸醋杆菌接入gyc液体培养基，于30℃、150r/min的条件下进行发酵培养，两株菌培养时间均不少于24小时。
30.3、调节菌株发酵液的初始浓度。将植物乳杆菌和醋酸醋杆菌的初始发酵液浓度调节为od
600
＝1.0。
31.4、菌液的有机复配。将植物乳杆菌和醋酸醋杆菌按比例混匀即为所需的微生物复合菌剂。
32.本发明还提供了所述除臭剂的制备方法。
33.1、将水果切碎、混匀。优选的方案为：选取水果各组分占配方量的质量百分比如下：柑橘50％、苹果30％、梨20％。
34.按水果：红糖：水＝3:1:10的质量比配料并装入容器内，并将微生物复合菌剂按已装入物质总质量比的5％无菌接入容器内，装样量总体积占容器体积80％～85％，搅拌均匀。
35.2、密封容器口部，在40℃下静置发酵，发酵初期(发酵的第2～5 天)每天打开容器进行放气并搅拌均匀；
36.3、静置发酵30～45天。发酵完成后过滤去除滤渣，即得所需除臭剂(液体)。滤液可常温常压、阴凉干燥环境密闭保存3个月，优选为在0～5℃下低温保存。使用时按需要取滤液直接使用或者稀释使用即可。
37.本发明还提供了所述除臭剂的使用方法。可以根据实际需要，将除臭剂液体直接喷施到待除臭物体上或与之混合；或将除臭剂液体通过干燥、制粒等技术制备为粉剂、颗粒剂或其他剂型，再将除臭剂置于待除臭物体上或与之混合即可。
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
39.本发明涉及培养基如下：
40.(1)mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母膏5g/l，葡萄糖5g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸二铵2g/l，吐温80 1g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸氢二钾2g/l，ph＝6.2。加入琼脂20g/l后为mrs 固体培养基。
41.(2)gyc培养基；酵母粉10g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖30g/l，ph＝6.0，灭菌完成后加20ml/l过0.28um膜的无水乙醇。加入琼脂20g/l后为gyc 固体培养基；如为固体培养基，则无水乙醇在固体凝固前加入。
42.实施例一：微生物的筛选、鉴定与保藏
43.1、微生物的筛选。
44.(1)植物乳杆菌的筛选：本发明提供的植物乳杆菌是从粪便样品中通过稀释涂布法筛选得到，从大量样品中反复筛选获得的生长速度快、产乳酸能力强的微生物。并进一步进行高温条件下的活性及产乳酸能力试验，最终筛选出一株可在高温环境下保持较高活性并稳定产乳酸的微生物。在相同的实验室条件下培养24h后，上述植物乳杆菌与一般市售乳酸菌的生物量及产酸结果如表1所示。表1中植物乳杆菌、乳酸菌的产酸量指产乳酸的量。需要说明的是，发明人还发现，该植物乳杆菌在10℃乃至5℃的低温环境下依然可以良好生长并保持良好的除臭性能。
45.(2)醋酸醋杆菌的筛选：本发明提供的醋酸醋杆菌是从醋糟样品中通过稀释涂布法筛选得到的，从多种醋糟样品中反复筛选获得的生长速度快，产醋酸能力强的微生物。且进一步进行高温条件下的活性及产醋酸能力试验，最终筛选出一株可在高温环境下保持较高活性并稳定产醋酸的微生物。实验室条件下培养24h后，上述醋酸醋杆菌与一般市售醋酸醋杆菌的生物量及产酸结果如表1所示。表1中醋酸醋杆菌、醋酸菌的产酸量是指产醋酸的量。
46.表1微生物在不同温度下的产酸情况示意表
[0047][0048][0049]
2、微生物分子鉴定及保藏。对所述植物乳杆菌进行16s rrna测序，结果如seq id no:1所示，根据系统发育树(图1)，发现植物乳杆菌与 lactobacillus plantarum strain cip 103151(nr 104573.1)的亲缘关系最近，序列相似性99.93％。
[0050]
2021年9月14日，植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23388，分类命名为：植物乳杆菌 (lactobacillus plantarum)。
[0051]
对所述醋酸醋杆菌进行16s rrna测序，结果如seq id no:2所示，根据系统发育树(图2)，发现醋酸醋杆菌与acetobacter tropicalisstrain 3khb(kx 424636.1)的亲缘关系最近，序列相似性99.93％。 2021年9月14日，醋酸醋杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏编号为：cgmcc no.23389，分类命名为：醋杆状菌 (acetobacterium sp.)。
[0052]
3、微生物的生理生化鉴定。所述植物乳杆菌的显微镜照片如图3 所示，培养皿中培养的菌落照片如图4所示；所述醋酸醋杆菌的显微镜照片如图5所示，培养皿中培养的菌落照片如图6所示。
[0053]
植物乳杆菌的生理生化鉴定结果如表2所示，醋酸醋杆菌的生理生化鉴定结果如表3所示。表中“ ”代表阳性，
“‑”
代表阴性。
[0054]
表2植物乳杆菌的生理生化鉴定结果
[0055][0056][0057]
表3醋酸醋杆菌的生理生化鉴定结果
[0058][0059]
实施例二：除臭剂的制备及效果展示
[0060]
1、按如上方法制备20组除臭剂，除臭剂中所用微生物复合菌剂的活菌浓度为2
×
108cfu/ml，微生物复合菌剂为5％。各组除臭剂中配方如表4所示。表4中除本发明提供的植物乳杆菌和醋酸醋杆菌外，还市购三种不同厂家来源的乳酸菌和三种不同厂家来源的醋杆菌，分别替换本发明筛选的植物乳杆菌或替换本发明筛选的醋酸醋杆菌，或同时替换本发明筛选的植物乳杆菌和醋酸醋杆菌，在其余条件完全相同的情况下制备除臭剂，作为阳性对照组。市购乳酸菌例如cgmcc no.1.2437，市购醋杆菌例如atcc 15973。表4中，微生物的比例为活菌比，水果组成为质量百分数。需要说明的是，本发明并非只制备并试验了下表所示的除臭剂，例如水果，发明人就进行了多种选择；各阳性对照组也进行了诸多试验，只是出于篇幅考虑，选择了部分具有代表性的组别进行展示。
[0061]
表4各组除臭剂的配方对照表
[0062]
[0063][0064]
2、测定上述各组除臭剂发酵结束后的ph，并测试各组除臭剂对硫化氢、氨气、甲硫醇、甲硫醚的去除效果。测试方法为：在常温(20℃) 常压(1个标准大气压)下，分别将初始浓度为0.15mg/m3的15l硫化氢气体、初始浓度为1.5mg/m3的15l氨气、初始浓度为0.1mg/m3的15l 甲硫醇、0.1mg/m3的15l甲硫醚，以1l/min的流量，通过装有100ml 各除臭剂的大型气泡吸收管，使气体循环24h。随后采集各组处理后的气体，分析各组气体浓度，计算去除率。去除率＝(处理气体的初始浓度-处理后浓度)/处理气体的初始浓度
×
100％。结果如表5所示。需要说明的是，本发明提供的各实施例中，实际处理的除臭效果远优于表格中数据体现的效果。因为表格中的数据只体现了臭气去除效果，而本发明提供的除臭剂还含有大量芳香物质，对臭气还具有良好的遮蔽、掩盖作用。经过试验发现，使用本发明制备的除臭剂，在ou去除率达到50％左右时，就已经闻不到明显臭味。
[0065]
表5各组除臭剂的效果对照表
[0066]
[0067][0068]
考虑到篇幅原因，表4、5中未体现各阳性对照组的组别和数据。发明人对各阳性对照组的除臭剂试验发现，市购的任一乳酸菌或醋杆菌均无法在40℃下良好生存并大量产酸；将本发明筛选的植物乳杆菌和醋酸醋杆菌同时替换为市购的任一乳酸菌和醋杆菌(活菌比为乳酸菌：醋杆菌＝2:3)，均无法在40℃下完成发酵；部分市购乳酸菌和醋杆菌的组合可在30℃下发酵获得除臭剂，但发酵时间在60天及以上才能达到与表4组7相当的效果。
[0069]
实施例三：除臭剂性状及保质期效果展示
[0070]
1、观察并测定实施例二表4组7制备的除臭剂的性状、组分，结果如表6所示。
[0071]
表6除臭剂的性状及组分
[0072][0073][0074]
2、将实施例二表4组7的除臭剂在常温常压、阴凉干燥处保存3 个月以上，每个月都使用实施例二的方法，测定除臭剂对各类臭气的去除效果，并使用稀释涂布平板法测定活菌量和酶活力保存率。该除臭剂在3个月内，每次取样时均无腐败臭味，活菌量均＞2
×
108cfu/ml，酶活力保存率在3个月≥90％。对各类臭气的去除效果与制备后当即使用的效果无显著差异。证明本发明提供的除臭剂保质期在3个月以上。需要说明的是，本发明是只测试到3个月的时间，并非表明其保质期只有 3个月。也可将液体除臭剂干燥后获得粉剂，
在常温常压、阴凉干燥处保存，需要使用时再加水混匀即可，便于运输和保存。
[0075]
实施例四：除臭剂实践效果展示
[0076]
在实践使用时，可以先将除臭剂:水＝1:1的质量比稀释搅拌均匀，得到除臭剂稀释液。可根据情况适当增大或减少稀释比例，稀释倍数过大会影响除臭效果及生效时间。将稀释液按照稀释液:粪污＝1:100～300 的比例喷施于其表面，12h后即可使粪污的臭味明显减弱甚至达到无臭无味的效果。如粪污池体积较大，可间隔时间分批多次投加以强化除臭效果。本实施例所用除臭剂为实施例二表4组7制备的除臭剂。在四川南充市垃圾填埋场进行现场除臭，经过60天对各类臭气及综合臭气浓度(ou)的连续监测，结果如表7所示。
[0077]
表7除臭剂现场除臭效果展示
[0078]
臭气初始浓度处理后浓度去除率硫化氢1353375.5％氨气1863640.8％ou902075％
[0079]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。