一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片及其应用

1.本发明属于生物医药学技术领域，尤其是涉及一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片及其应用。


背景技术：

2.吉兰巴雷综合征(guillain
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syndrome,gbs)系一类免疫介导的急性炎性周围神经病，是引起急性对称性迟缓性麻痹最常见的原因。gbs以周围神经和神经根的脱髓鞘病变以及小血管炎性细胞浸润为病理特点，目前认为针对雪旺细胞、髓鞘或轴索的细胞或者体液免疫参与了发病，感染性及非感染性因素均可诱发该病。gbs大多急性起病，首发症状多为四肢对称性迟缓性瘫痪，腱反射消失或减弱，肢体无力常始于远端，可波及躯干及颅神经(以面神经最常见)，部分可出现自主神经功能障碍甚至累及呼吸肌；症状多在2-4周内达峰，呈单相自限性病程，恢复期可持续数周、数月甚至数年。有关gbs发病原因的研究显示，多种病原体感染，包括甲肝病毒，单纯疱疹病毒，西尼罗病毒，寨卡病毒亚洲型和非洲型，巨细胞病毒，乙脑病毒，空肠弯曲菌，eb病毒，黄热病毒，丙肝病毒，戊肝病毒等，都成为gbs发病的诱因。而目前尚缺乏特异性检测这些病原体感染的诊断试剂。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对目前尚缺乏特异性检测这些病原体感染的诊断试剂存在的问题提供一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片及其应用。
4.本发明的基本构思：微流控芯片技术是一种芯片集成技术，可以在一张高度集成化的芯片上面，完成待测样品的制备、分离、检测等，实现了“样品进、结果出”的即时检测，能够满足生命科学各领域开展大样本的快速检测需求，是未来临床医学检测的一个发展方向。
5.环介导等温扩增pcr技术(loop-mediated isothermal amplification pcr，lamp)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规pcr相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。lamp是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于pcr技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量pcr。
6.因此，基于lamp恒温扩增pcr技术和蝶式微流控芯片技术设计的12种脑炎病毒基因检测芯片及其应用，将为临床诊断感染性脑炎的致病菌类型，明确临床诊断及指导临床用药等提供依据。
7.本发明的技术方案为：一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片，该基因芯片制备包括如下步骤：
8.(1)制备蝶式微流控基因芯片
9.①
待检病原体的选择
10.通过临床资料和相关文献，选择甲肝病毒，单纯疱疹病毒，西尼罗病毒，寨卡病毒亚洲型和非洲型，巨细胞病毒，乙脑病毒，空肠弯曲菌，eb病毒，黄热病毒，丙肝病毒，戊肝病毒等12种吉兰巴雷综合征相关病原体为待检病原体；
11.②
待检病原体引物设计
12.根据12种病原体靶基因ncbi的taxonomy数据库中拉丁文标准名称和taxonomy id，在ncbi数据库中搜集各菌靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了blast比较。根据12种待检病原体靶基因ncbi的taxonomy数据库中拉丁文标准名称和taxonomy id，在ncbi数据库中搜集各病原体靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了blast比较。确保所选靶基因在种内相似度均在95％以上，具有很高的保守性，能够用于突变株的检测；
13.利用环介导等温扩增技术(lamp)引物设计在线工具primerexplore v4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，针对12种待检病原体靶基因6个不同区域(即靶基因3’端的f3c区、f2c区和f1c，以及靶基因5’端的b1区、b2区和b3区)，设计2-3对环介导等温扩增技术(lamp)引物组。其中必须引物为fip、bip、f3、b3，加速引物为lf、lb，增加dna合成的起始点，加快反应速度；
14.③
基因芯片结构布局
15.本发明所用的碟式微流控基因芯片包含24个反应池，逆时针依次编号，其中进出样口1对应的为1号反应池，采用博奥碟式芯片微量点样技术，在特定反应池包埋固定一套lamp引物用于一种核酸靶序列的扩增与检测特定病原体的特定基因，或者对照基因芯片的结构布局；
16.④
基因芯片试剂配制
17.每一组引物为6条核苷酸序列(有的为四条)，引物包括f3，b3，fip，bip，lf，lb.将6条引物按照如下比例混合，如果该组引物只有四条，则用水补足空余部分体积，保证终浓度不变；
18.(2)待测样品中核酸提取
19.根据样品来源选择核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取样品总dna和总rna，将总rna反转录为cdna，将cdna与dna样本按照浓度1:1混合后备用；
20.(3)恒温扩增体系的配制
21.取200μl pcr管，按照1μl混合的核酸样品，25μl dd水，26μl恒温扩增试剂的剂量配制检测体系，涡旋震荡、瞬时离心；
22.(4)碟式微流控基因芯片加样
23.在模板区，吸取在步骤3配制好的核酸扩增反应体系，观察芯片主通道，待样品充满芯片全部主通道并从进出样口2溢出，则停止加样，加样中避免气泡。取一张封口膜封闭进出样口。将芯片固定在低速离心机上，以6000rpm条件离心30秒，观察反应液全部由主通道进入反应仓后备用；
24.(5)恒温扩增检测
25.使用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪rtisochiptm-a进行检测，检测前打开检测光源预热15分钟；
26.点击出仓按钮，待芯片出仓，将芯片标签面向下平稳放置在托盘上，托盘中心定位装置与芯片中心大圆孔对齐，托盘定位小圆柱从芯片中心缺口处穿出以固定芯片，点击“入仓”按钮，将芯片送入核酸分析仪中；
27.在样品信息区域录入样品编号，芯片编号，样品类型等信息。以37℃3分钟，65℃47分钟的条件进行检测，点击开始检测。待检测状态信息的倒计时开始计时，则开始检测。检测后芯片仓会自动出仓；
28.6结果判读
29.检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析，“荧光曲线区域”显示归一化曲线，“检测结果”区域显示质控结果和各检测指标的检测结果，将结果导出报告，可见检测指标的阳性或阴性判读，针对单一病原体的多个引物组(例如甲肝病毒1-4)是为了增加对病原体亚型的识别，其中任意一个或多个反应池结果为阳性则判读该检测样品中含有目标病原体；
30.采用恒温扩增技术和微流控技术，以碟式微流控基因芯片为载体，检测灵敏度为500copies/μl，不算入制备基因芯片的时间，整个样品检测时间能在1小时内完成；
31.7检测实施例
32.使用前文所述方法，选取20例临床诊断为吉兰巴雷综合征患者和20例临床诊断为乙型脑炎患者脑脊液中病原体核酸标本(总dna与cdna混合物)，4℃保存备用。
33.一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片的应用，本发明提供12种与吉兰巴雷综合征相关病原体碟式微流控基因芯片检测试剂盒中的应用，主要病原体包括甲肝病毒，单纯疱疹病毒，西尼罗病毒，寨卡病毒亚洲型和非洲型，巨细胞病毒，乙脑病毒，空肠弯曲菌，eb病毒，黄热病毒，丙肝病毒，戊肝病毒等12种吉兰巴雷综合征相关病原体；该试剂盒使用一步法恒温扩增pcr方法检咽拭子、鼻拭子、外周血、组织液、脑脊液中的12种与吉兰巴雷综合征相关病原体靶基因，试剂盒主要由水，阳性质控，pcr扩增试剂等组成。
34.本发明显著效果是：
35.(1)本发明首次设计针对吉兰巴雷综合征12种相关病原体的碟式微流控基因检测芯片，采用恒温扩增技术，针对甲肝病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒亚洲型、寨卡病毒非洲型、巨细胞病毒、乙脑病毒、空肠弯曲菌、eb病毒、黄热病毒、丙肝病毒，戊肝病毒等12种病原体所有靶基因的6个不同区域(即靶基因3’端的f3c、f2c和f1c区，以及靶基因5’端的b1、b2和b3区)设计lamp引物，在恒温(65℃)条件下利用荧光染料掺入法进行实时荧光检测。扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“s”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测，可同时对12种脑炎致病微生物进行高通量并行检测，是国内目前吉兰巴雷综合征相关病原体检测通量最高的碟式微流控基因芯片产品。
36.(2)本发明公开了一种碟式微流控基因芯片，在其不同的反应池中分别包含甲肝病毒5’非编码区序列、单纯疱疹病毒ul1基因、西尼罗病毒包膜基因、寨卡病毒亚洲型非结构蛋白ns5序列、寨卡病毒非洲型非结构蛋白ns1序列、巨细胞病毒us17基因、乙脑病毒非结构蛋白ns1序列/ns2序列/m基因、空肠弯曲菌gyra基因、eb病毒bamhi w基因、黄热病毒非结构蛋白ns1序列、丙肝病毒5’非编码区序列，戊肝病毒开放阅读框2序列中的一项或更多项特异性引物组。该芯片能够有效并行检测任一项、任两项、任三项、任四项、任五项、任六项、任七项、任八项、任九项、任十项、任十一项、或全部十二项的反应池，在所述反应池中独立
进行lamp扩增反应。
附图说明
37.图1碟式微流控基因芯片示意图；
38.图2吉兰巴雷综合征检测芯片质控及标准品检测结果荧光曲线图；
39.图3代表性乙型脑炎患者和吉兰巴雷综合征患者脑脊液样本芯片检测结果荧光曲线图。
40.图2中：a.阳性质控检测结果；b.吉兰巴雷综合征病原体(乙型脑炎病毒)核酸标准品 阳性质控检测结果。
41.图3中：a.20例乙型脑炎患者芯片检测的代表性结果，表现为单纯乙型脑炎感染；b.20例吉兰巴雷综合征芯片检测的代表性结果，表现为单纯空肠弯曲菌感染。
具体实施方式
42.一种检测与吉兰巴雷综合征相关12种病原体基因芯片，该基因芯片制备包括如下步骤：
43.(1)制备蝶式微流控基因芯片
44.①
待检病原体的选择
45.通过临床资料和相关文献，选择甲肝病毒，单纯疱疹病毒，西尼罗病毒，寨卡病毒亚洲型和非洲型，巨细胞病毒，乙脑病毒，空肠弯曲菌，eb病毒，黄热病毒，丙肝病毒，戊肝病毒等12种吉兰巴雷综合征相关病原体为待检病原体；
46.②
待检病原体引物设计
47.根据12种病原体靶基因ncbi的taxonomy数据库中拉丁文标准名称和taxonomy id，在ncbi数据库中搜集各菌靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了blast比较。根据12种待检病原体靶基因ncbi的taxonomy数据库中拉丁文标准名称和taxonomy id，在ncbi数据库中搜集各病原体靶基因序列，并且对靶基因序列相似度进行了blast比较。确保所选靶基因在种内相似度均在95％以上，具有很高的保守性，能够用于突变株的检测；
48.利用环介导等温扩增技术(lamp)引物设计在线工具primerexplore v4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，针对12种待检病原体靶基因6个不同区域(即靶基因3’端的f3c区、f2c区和f1c，以及靶基因5’端的b1区、b2区和b3区)，设计2-3对环介导等温扩增技术(lamp)引物组。其中必须引物为fip、bip、f3、b3，加速引物为lf、lb，增加dna合成的起始点，加快反应速度；
49.③
基因芯片结构布局
50.本发明所用的碟式微流控基因芯片(如图1所示)包含24个反应池，逆时针依次编号，其中进出样口1对应的为1号反应池。采用博奥碟式芯片微量点样技术，在特定反应池包埋固定一套lamp引物用于一种核酸靶序列的扩增与检测特定病原体的特定基因，或者对照基因芯片的结构布局如图1所示，其中每个反应池中引物组名称与对应基因名称参见表1；
51.表1.12种脑炎致病微生物基因芯片引物组布局表
[0052][0053]
④
基因芯片试剂配制
[0054]
每一组引物为6条核苷酸序列(有的为四条)，引物包括f3，b3，fip，bip，lf，lb.将6条引物按照如下比例混合，如果该组引物只有四条，则用水补足空余部分体积，保证终浓度不变；
[0055]
表2引物配置浓度
[0056]
[0057][0058]
(2)待测样品中核酸提取
[0059]
根据样品来源选择核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取样品总dna和总rna，将总rna反转录为cdna，将cdna与dna样本按照浓度1:1混合后备用；
[0060]
(3)恒温扩增体系的配制
[0061]
取200μl pcr管，按照1μl核酸样品，25μl dd水，26μl恒温扩增试剂的剂量配制检测体系，涡旋震荡、瞬时离心；
[0062]
(4)碟式微流控基因芯片加样
[0063]
在模板区，吸取在步骤3配制好的核酸扩增反应体系，观察芯片主通道，待样品充满芯片全部主通道并从进出样口2溢出，则停止加样，加样中避免气泡。取一张封口膜封闭进出样口。将芯片固定在低速离心机上，以6000rpm条件离心30秒，观察反应液全部由主通道进入反应仓后备用；
[0064]
(5)恒温扩增检测
[0065]
使用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪rtisochiptm-a进行检测，检测前打开检测光源预热15分钟；
[0066]
点击出仓按钮，待芯片出仓，将芯片标签面向下平稳放置在托盘上，托盘中心定位装置与芯片中心大圆孔对齐，托盘定位小圆柱从芯片中心缺口处穿出以固定芯片，点击“入仓”按钮，将芯片送入核酸分析仪中；
[0067]
在样品信息区域录入样品编号，芯片编号，样品类型等信息。以37℃3分钟，65℃47分钟的条件进行检测，点击开始检测。待检测状态信息的倒计时开始计时，则开始检测。检测后芯片仓会自动出仓；
[0068]
(6)结果判读
[0069]
检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析，“荧光曲线区域”显示归一化曲线，“检测结果”区域显示质控结果和各检测指标的检测结果，将结果导出报告，可见检测指标的阳性或阴性判读，针对单一病原体的多个引物组(例如甲肝病毒1-4)是为了增加对病原体亚型的识别，其中任意一个或多个反应池结果为阳性则判读该检测样品中含有目标病原体；
[0070]
采用恒温扩增技术和微流控技术，以碟式微流控基因芯片为载体，检测灵敏度为500copies/μl，不算入制备基因芯片的时间，整个样品检测时间能在1小时内完成；
[0071]
(7)检测实施例
[0072]
使用前文所述方法，选取20例临床诊断为吉兰巴雷综合征患者和20例临床诊断为乙型脑炎患者脑脊液中的病原体核酸标本(总dna与cdna混合物)，4℃保存备用。
[0073]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。