一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途。


背景技术：

2.青稞(hordeum vulgare linn.var.nudum hook.f.)是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。青稞有着广泛的药用以及营养价值，已推出了青稞挂面、青稞馒头、青稞营养粉等青稞产品。
3.花青素是从红、蓝、紫色的花果和叶片中提取的黄酮类化合物的总称。其中，花青素骨架物质如花翠素、芍药素在植物中不稳定，需要经过特定的修饰后(例如甲基、丙二酰、糖基化等修饰)才能以稳定的形式存在于植物体内。有研究报道糖基化修饰的花青素通过酰基化修饰后才能被花青素转运蛋白识别进而转运到液泡中储存(zhao,j.(2015).flavonoid transport mechanisms:how to go,and with whom.trends plant sci.20:576
–
585)。矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷是一种能够在植物中稳定存在的花青素类衍生物，它是在矢车菊素的3号位置上经过糖基化和丙二酰化修饰后加了一个甲基和丙二酰基形成的化合物，它不仅具有抗氧化、清除自由基、抑制炎症和抗癌的作用，还能有效预防慢性疾病(pojer,e.,mattivi,f.,johnson,d.,&stockley,c.s.(2013).the case for anthocyanin consumption to promote human health:a review.comprehensive reviews in food science and food safety,12(5),483-508.；verediano,t.a.,stampini duarte martino,h.,dias paes,m.c.,&tako,e.(2021).effects of anthocyanin on intestinal health:a systematic review.nutrients,13(4),1331.)
4.因此，开发出一种高产矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的青稞品种具有重要价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途。
6.本发明提供了一种基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了一种重组载体，它包括seq id no.1所示的核苷酸序列；优选地，所述重组载体是重组pgex-6p-1。
8.本发明还提供了一种重组菌，它包含上述的重组载体；优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌；更优选地，所述重组大肠杆菌为重组transetta(de3)。
9.本发明还提供了一种制备氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白的方法，它是采用上述的重组菌发酵制得的。
10.进一步地，所述方法包括以下步骤：
11.(1)取重组菌，活化，扩增，得活化菌液；
12.(2)将活化菌液接种到培养基中培养，3～4小时后加入诱导剂诱导表达，收集菌
体；
13.(3)取菌体，破菌，离心，取上清纯化后得到氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白。
14.进一步地，步骤(1)中，所述活化菌液的浓度为1
×
106～1
×
107cfu/ml；
15.步骤(2)中，所述活化菌液与培养基的体积比为1:(10～100)，所述培养基为含抗生素的lb培养基，所述培养的温度为30～40℃，所述诱导剂为iptg诱导剂，所述诱导表达的温度为15～25℃，诱导表达的时间为8～16小时；
16.步骤(3)中，所述纯化方法为gst标签融合蛋白纯化方法。
17.进一步地，步骤(2)中，所述活化菌液与培养基的体积比为1:50，所述抗生素的为氨苄西林，所述培养的温度为37℃，所述诱导表达的温度为20℃，诱导表达的时间为10～14小时；
18.步骤(3)中，所述纯化方法为：取上清上树脂柱，穿流2次；先用lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；然后用还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白。
19.本发明还提供了一种生产高产矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷转基因植物的方法，其特征在于，它是将上述基因转入植物中，获得表达氨基酸序列如seq id no.2所示蛋白的植物。
20.进一步地，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、peg介导法、脂质体法、磷酸钙-dna共沉淀法中的一种；所述植物为烟草或青稞。
21.本发明还提供了上述基因、上述重组载体、上述重组菌在制备高产矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷转基因植物中的用途；所述植物优选为烟草或青稞。
22.本发明中，诱导过夜指诱导12
±
2小时。
23.本发明首次发现了青稞中的一种新的基因：青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)，该基因表达的蛋白——青稞矢车菊素丙二酰基转移酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)可以将矢车菊素3-o-葡萄糖苷转化为矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷，提高青稞的保健价值。本发明以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素丙二酰基转移酶，在体外反应中将丙二酰辅酶a作为酰基供体，矢车菊素3-o-葡萄糖苷作为受体，成功地制备得到了矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷。本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达矢车菊素丙二酰基转移酶，进一步产生矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷，提高了烟草植株的价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。
24.本发明的新的基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高青稞对矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的合成，实现青稞的定向改良。
25.本发明的转基因植物构建方法，为青稞的定向改良提供了重要的参考。
26.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
27.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
28.图1为目的蛋白的sds-page电泳图，左侧marker：100,70,55,40,35,25kda。
29.图2为体外催化反应的lc-ms图，图中，cyanidin 3-o-galactoside为矢车菊素3-o-葡萄糖苷，cyanidin o-malonylhexoside为矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷。
30.图3为转基因烟草提取物中矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的质谱图。
31.图4为烟草转基因后目的产物的含量对比，其中，ck表示未转基因的空白对照，ox-1表示转基因株系1，ox-2表示转基因株系2，ox-3表示转基因株系3。
32.图5为矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的结构。
具体实施方式
33.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
34.实施例1目的基因的制备和目的蛋白的表述
35.1、目的基因hovusg2274400的制备
36.称取2克青稞新鲜叶片，提取青稞rna，用thermo fisher公司的m-mlv reverse transcriptase(反转录酶)合成互补dna(cdna)，利用以下引物对进行pcr扩增，得到目的基因hovusg2274400(又称青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因)，pcr产物用胶回收试剂盒(gel extraction kit d2500-02，omega)纯化。
37.上述引物对的序列如下：
38.f:gaacagcatggagcattt(seq id no.3)，
39.r:atatagaccttctctggcat(seq id no.4)。
40.目的基因hovusg2274400的核苷酸序列(seq id no.1)为：
41.atgggcgccaacagcaacctccgcgtcctggacgccggtgtggtcaggccgtccgacctcgacctgccgccgcactccctcccgctcaccttcttcgacgtcaaatggctccgcccgccgcccgtccagcggctcttcctctaccgcctccccctgcataaccacgacaccacccgcctcatgtccgacctcaaggcctccctctccaaggccctcgatctcttctacccgctcgccggccacgttcgcctaaccccggacagcaaccgctacgagctcttctaccagcctggcgacggcgtcgccttcaccgtcgccgagtacgacgccgacctcgaacaagaccttgccaacgccgagccagcccaggtggccaagctggcgcctctcgtgccgtcgctgccgaagggccgtgcggtgctcgccgtgcaggccacggtccttctcgggggggtccggggcctcgctctgggtgtcaccttgcaccactctgcctgtgacggcgccagctccacccacttcctgcacacatgggccgccctctgcgccggcgctgctgaaacgccgccgccacccgtcatcgaccgcacgctcatcgctgatcccaggggcctctacgacatctactccaaaggaatgccgagcgacggcagcgggatcgagttcgtgagcagcagcgtgtcctctgtccccgacgaccagctcctcggcaccttcacactgcctcaggagctcctgcgtggcatcaaggacacggtcgcccgtgaggctgccaggcacggcgcgccacctcccagatgctcgtcgctgctcgccaccttcagtttcatgtggtcctgctactgccgagccaaacaggaacacaaccaaactaaaaaaacctacttccttttctccgttgatcaccggacccggttgaagccgcccgtccccgacaggtacctgggcaactgtctaggtccggccatcgccgccgcgcaccatgacgagcttgcggctccgggcacggacggcctctttgcggcgttcatggcgatcgctagtgccctccaggaagaggtgggcgagggatcacaggacaggtgggacgggtgtgttgagcgggtgaaggaagcggcgaaggctggcctgttctccgtcgccggttcaccgaggttccgcgtgtacggcatcgatttcgggtttgggccaccggcgaaggtggacgtagtgtccgtggcaaagaccggcgctatgtcaatggcggaggcacgtgacgggcatggcggcatcgaggtagggatctcactgccgacgaacagcatggagcattttcgacggtgctttgccgatgacgtacgtaccatcggcatgccagaga
aggtctatatatag。
42.本发明的目的基因hovusg2274400基因可以通过上述方法获得，也可以直接进行合成。
43.2、载体的构建
44.将基因hovusg2274400转入载体pgex-6p-1中，得到重组载体。
45.3、重组菌株的构建
46.将重组载体转入大肠杆菌transetta(de3)中，得到含有目的基因的重组菌株。
47.4、目的蛋白的表达
48.1.pcr检测阳性克隆，抽提质粒测序。
49.2.将测序正确的质粒载体热击转化大肠杆菌transeta(de3)，抗性cn。
50.3.随机挑取2个正常大小克隆于5ml含有氨苄西林(amp)的lb培养基中，37℃摇瓶培养7小时。将4ml活化菌液(浓度为1
×
106～107cfu/ml)按照1:50比例转接到200ml大瓶lb培养基中，37℃摇床培养，转速200rpm。3～4小时后，在200ml培养基中加入2ul 1m的iptg诱导剂，于20℃，160rpm条件下诱导过夜。剩余1ml菌液用来保菌。
51.4.第二天早上收集菌体，装入500ml离心瓶中于4000rpm下离心10min。
52.5.用50ml lysis buffer重悬菌体，涡旋混匀，转入50ml离心管中，分别加入50ul pmsf，10ulβ-巯基乙醇，混匀放置冰上。
53.6.采用高压破碎仪破碎大肠杆菌细胞。
54.7.取20ul破碎后的样品作为总蛋白样品。再取1ml破碎后的样品4℃，13000rpm下离心10min，取20ul上清作为上清液样品。在上清液样品中加入等体积载样缓冲液(loading buffer)，煮沸5min，sds-page电泳检测蛋白表达情况。剩余上清暂冻存于-20℃冰箱，剩余破碎后未离心样品冻存于-80℃冰箱。
55.8.sds-page电泳完毕，加入考马斯亮蓝染色液，微波炉煮沸1min后染色半小时，加入脱色液脱色。每隔1h换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，转至清水中。
56.9.gst标签融合蛋白纯化。将剩余破碎后的所有样品离心，上清与1ml树脂(glutathione sepharosetm 4b，ge公司)在4℃混匀仪上混合3h。混匀后，将混合液穿过层析柱，穿流2次。先用预冷的lysis buffer冲洗树脂，同时用bradford assay(考马斯亮蓝法)检测流出液用，直至不变蓝色表示杂蛋白冲洗干净。然后，用15mmol/l还原型谷胱甘肽溶液(0.09g溶解于20ml lysis buffer)洗脱目的蛋白，每次加入1ml，层析柱底部用1.5ml的离心管收集，每管约1ml，分别记为e1、e2、e3、e4、e5、e6，直至bradford assay检测洗脱液中不含蛋白。未用完的还原型谷胱甘肽溶液继续全部洗脱树脂，然后分别用lysis buffer，ddh2o 20％乙醇冲洗，保存于20％乙醇中。
57.10.收集的目的蛋白用sds-page检测，得到76kda的条带(图1)，gst标签的分子量为26kda，剩余目的蛋白的分子量为50kda，与氨基酸计算的分子量相同，说明本发明制备得到了带有gst标签的目的蛋白。
58.目的蛋白的氨基酸序列(seq id no.2)为：
59.mgansnlrvldagvvrpsdldlpphslpltffdvkwlrpppvqrlflyrlplhnhdttrlmsdlkaslskaldlfyplaghvrltpdsnryelfyqpgdgvaftvaeydadleqdlanaepaqvaklaplvpslpkgravlavqatvllggvrglalgvtlhhsacdgassthflhtwaalcagaaetppppvidrtliadprglydiyskgmpsdgsgi
efvsssvssvpddqllgtftlpqellrgikdtvareaarhgappprcssllatfsfmwscycrakqehnqtkktyflfsvdhrtrlkppvpdrylgnclgpaiaaahhdelaapgtdglfaafmaiasalqeevgegsqdrwdgcvervkeaakaglfsvagsprfrvygidfgfgppakvdvvsvaktgamsmaeardghggievgislptnsmehfrrcfaddvrtigmpekvyi。
60.实施例2转基因烟草的构建
61.①
用含有目的基因的瞬时表达载体(瞬时表达载体peaq，来自john innes centre)转化农杆菌(eha105)；
62.②
挑取阳性农杆菌克隆于500ul含有相应抗生素(kn)的lb中，培养20-24小时；
63.③
转接200ul于5ml含有相应抗生素(kn)的lb培养基中，28℃摇床培养(220rpm)至od值＝2.0左右。
64.④
10000rpm常温离心2min后收集菌体，用提前配制的转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；转化缓冲液成分以及浓度如下：10mm mes(ph5.7)，10mm mgcl2，100μ丙二酰辅酶a。
65.⑤
将1ml的注射器去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取1月龄的本氏烟草(nicotiana benthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射将，使农杆菌渗透进去。
66.⑥
将注射农杆菌后的本氏烟草在黑暗处培养24小时，然后移至烟草培养箱中光照培养24-48小时，即得转基因烟草。
67.以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果。
68.试验例1目的蛋白的酶活检测
69.1.实验方法
70.1.1目的蛋白的获取
71.按照实施例1的方法制备得到目的蛋白。
72.1.2酶活检测
73.在100μll tris-hcl缓冲液(100mm，ph 7.4)中，加入矢车菊素3-o-葡萄糖苷(作为糖基受体)使其终浓度为200μm，加入丙二酰辅酶a(作为酰基供体)使其终浓度为100μm，然后加入500ng目的蛋白进行体外反应，孵育10min后，加入300μl冰甲醇停止反应。将反应混合物通过0.2μm的过滤器(微孔)过滤后用液相色谱质谱质谱联用仪(lc-ms)分析。
74.2.结果
75.分析结果显示反应后生成的物质是矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷(图2)。说明本发明目的蛋白能够将矢车菊素3-o-葡萄糖苷转化为矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷。
76.试验例2转基因烟草生产矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷
77.1.实验方法
78.1.1转基因烟草的构建
79.按照实施例2的方法构建转基因烟草。
80.参照实施例2的方法，将注射的菌液替换为等体积的转化缓冲液，作为对照烟草。
81.1.2产物收集和纯化
82.剪取转基因烟草农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的ep管中，做好标记，迅速放置液氮中，进行冻干。取冻干后的样本，利用研磨仪在30hz条件下研磨60s，将研磨好的样本粉末装入2mlep管内。用电子天平称取每个ep管的重量并记录；将已研磨好的
样本取适量(范围30-60mg)于ep管中，称量并记录，算出所有ep管中样本的净重。已知每份样本的净重，按体积v＝样本净重(mg)*12μl/mg在4℃冰上加入70％meoh溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上，然后离心。离心时，先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心。离心后吸取上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μm)过滤，装入上样瓶中，准备lc-ms检测。
83.剪取对照烟草的叶片，按照上述相同的操作处理后准备lc-ms检测。
84.1.3目的产物检测
85.将装有待测提取液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件analyst software，双击hardware configuration，选择lcms-v(有切换阀模式)，点击activate profile，并选择acquire mode模式，点击acquire，点击图上方的equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态ready后，功能区start sample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击start sample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。
86.2.结果
87.质谱图中矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的峰度值为2.0e 06(图3)，表明转基因烟草中目的蛋白的活性高。
88.上述实验结果说明，本发明将目的基因hovusg2274400转移到烟草中，使得烟草植株可以表达矢车菊素丙二酰基转移酶，并诱导烟草积累矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷，提高了烟草的应用价值，同时为高产矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷的青稞的品种制备提供依据。
89.综上，本发明发现了青稞中的一种新的基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)，该基因表达的蛋白(氨基酸序列如seq id no.2所示)可以将矢车菊素3-o-葡萄糖苷转化为矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷，提高青稞的保健价值。本发明以该基因片段进行体外表达，获得了青稞矢车菊素丙二酰基转移酶，在体外反应中将丙二酰辅酶a作为酰基供体，矢车菊素3-o-葡萄糖苷作为受体，成功地制备得到了矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷。本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达矢车菊素丙二酰基转移酶，进一步产生矢车菊素3-o-丙二酰葡萄糖苷，提高了烟草植株的价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。