一种树枝状多重半抗原、人工抗原及制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种树枝状多重半抗原、人工抗原及制备方法。


背景技术：

2.近年来，由食品中化学有害物引发的食品安全问题尤为严重。加强食品安全检测已成为控制污染食品进入市场、保障消费者安全的重要手段之一。目前，用于食品中化学有害物的检测手段主要以基于色谱技术及色谱与质谱联用技术的仪器检测方法为主。仪器法检测虽然准确、可靠，但是需要昂贵的设备、专业的操作人员、复杂的样品前处理及高昂的检测成本，无法满足大批量样品现场检测的需求。以抗原-抗体特异性反应为基础的免疫检测技术具有分析时间短、操作简单、灵敏性高、特异性好及检测成本低等优势，十分符合我国农产品及食品生产经营分散、量大面广的特点。
3.然而，大量试验结果表明：如果目标分析物的分子量小于500da，不能由抗原呈递细胞直接处理和提交，并被特定的b和t细胞直接识别，很难甚至不可能获得高质量的抗体或者进行一系列的免疫学研究。绝大多数小分子物质不具备与大分子载体如蛋白质等连接的基团，如-cooh、-nh2、-oh和-sh等官能团，因此，必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成有效的人工结合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类及半抗原与目标分析物质任何结构上的差异，都可能极大地影响着相应抗体的性质。因此，它是决定产生其特异性抗体质量和建立免疫化学分析方法的关键。
4.虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。如引入标记物放大显示这一反应，则其既具有免疫反应的特异性和灵敏性，又具有标记物易被识别和检测的双重特征，可分析环境、食品、人体液等复杂样本中超微量小分子化合物，具有较好的选择性，灵敏度。操作简单快速、成本低廉。
5.授权公告号为cn106831534b的申请专利公开了一种酚酞半抗原、人工抗原及其制备方法，其因检测中成药或保健品中不知是否含有酚酞成分，目前采用的还是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行大型仪器分析耗时长，成本高。因此，其发明半抗原在保留酚酞基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的酚酞基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。其通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达18.2，可用于酚酞的免疫检测。
6.因此，突破“抗
‘
低分子化合物’的高亲和力抗体制备困难”的技术瓶颈，建立快速免疫分析方法并进行筛查应用，具有重要的理论和现实意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种树枝状多重半抗原、人工抗原及制备方法，可增强小分子化合物抗原免疫性。
8.本发明提供一种树枝状多重半抗原的制备方法，先由含有氨基的小分子化合物和有机酸/酸酐进行醛胺缩合或形成酰胺键，制备出半抗原产物，所得半抗原产物与聚酰胺胺进行脱水缩合获得树枝状多重半抗原，所述小分子化合物的分子量小于500da。
9.优选的，有机酸/酸酐为乙醛酸、马来酸酐或琥珀酸酐。
10.其中，有机酸/酸酐表示有机酸或酸酐。
11.优选的，小分子化合物为尸胺或磺胺。
12.本发明树枝状多重人工抗原制备方法便捷、操作简便，适用于含氨基的小分子化合物。
13.具体的，聚酰胺胺的合成方法如下：
14.先由n，n-二甲基甲酰胺在冰浴下加入浓硫酸，反应后获得酰胺类离子液体，之后与乙二胺和丙烯酸甲酯反应获得所述聚酰胺胺。
15.具体的，半抗原产物的合成方法如下：
16.半抗原产物由含有氨基且分子量小于500da的小分子化合物和乙醛酸、马来酸酐或琥珀酸酐制备，方法过程如图2所示。
17.优选的，催化剂为三乙胺。
18.本发明还提供了一种由树枝状多重半抗原的制备方法制备的树枝状多重半抗原，其分子结构式图3所示。
19.上述树枝状多重半抗原为人工构建的树枝状多重半抗原，该半抗原最大程度保留了小分子的官能团的结构特征，并将小分子化合物暴露在载体蛋白的表面，且该树枝状多重半抗原为高密度半抗原，经此半抗原制备得到的树枝状多重人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，增加小分子化合物的抗原免疫原性。
20.本发明还提供了一种树枝状人工抗原，是树枝状多重半抗原与载体蛋白以酰胺键连接获得的偶联物，分子式如图4所示。
21.优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
22.本发明还提供了一种树枝状人工抗原的制备方法，是由树枝状多重半抗原与载体蛋白上的氨基反应，获得树枝状人工抗原。
23.优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
24.具体的，制备方法步骤如下：
25.将树枝状多重半抗原先在二环己基碳化二亚胺的作用下，与n-羟基琥珀酰亚胺发生活化酯反应，生成活化酯衍生物，活化酯衍生物与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接获得的偶合物，即为树枝状人工抗原。
26.优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
27.本发明所制备的树枝状多重人工抗原由以牛血清白蛋白和卵清蛋白作为载体蛋白和树枝状多重半抗原偶联得到，具有良好的免疫活性。
28.本发明所制备的树枝状多重人工抗原不仅提高了目的小分子的密度，还将目的小分子部分暴露在载体蛋白的表面，有利于增加抗原免疫原性并制备出高质量抗体。
29.本发明所制备的树枝状多重人工抗原可用于动物免疫实验、相应抗体制备等，该树枝状多重人工抗原为含氨基的小分子免疫方向的研究提供了新手段。
30.本发明的有益效果：本发明提供的制备方法具有易于获得、对环境友好、人工抗原制备成本低和操作简便等优点。
附图说明
31.图1为聚酰胺胺(npamam4)与半抗原产物(h)偶联而成树枝状多重半抗原(h-npamam4)方法过程图；其中，a为npamam4与半抗原产物h1偶联而成h1-npamam4的过程；b为npamam4与半抗原产物h2偶联而成h2-npamam4的过程；c为npamam4与半抗原产物h3偶联而成h3-npamam4的过程。
32.图2为小分子化合物和乙醛酸反应得到半抗原产物(h1)、小分子化合物和马来酸酐反应得到半抗原产物(h2)及小分子化合物和琥珀酸酐反应得到半抗原产物(h3)的方法过程图。
33.图3为树枝状多重半抗原的分子式图；其中，a为npamam4与半抗原产物h1偶联而成h1-npamam4；b为npamam4与半抗原产物h2偶联而成h2-npamam4；c为npamam4与半抗原产物h3偶联而成h3-npamam4。
34.图4为树枝状人工抗原分子式图；其中，a为人工抗原h1-npamam
4-protein分子式；b为人工抗原h2-npamam
4-protein分子式；c为人工抗原h3-npamam
4-protein分子式。
具体实施方式
35.实施例1
36.半抗原(1)的合成路线：
37.半抗原的合成反应路线参见图2。
38.称取3.0g尸胺溶于100ml的二甲基亚砜中，然后逐滴加入20ml乙醛酸，滴加完毕后，搅拌加热，缓慢升温至65℃，继续搅拌反应12h。反应结束后，待冷却至室温后进行抽滤，得半抗原h1产物。将半抗原h1产物烘干后称重为3.01g，平均产率为74.8％。
39.树突状多重半抗原(h1-npamam4)合成路线：
40.树突状多重半抗原合成路线参见图1，分子式参见图3。
41.a.酰胺类离子液体的合成：在圆底烧瓶中加入10ml n，n-二甲基甲酰胺，冰浴下加入16.8ml浓度为12m的浓硫酸，于80℃搅拌孵育24h，然后用甲苯洗涤，旋转蒸发，真空干燥后即得淡黄色透明粘稠离子液体；
42.b.聚酰胺胺的合成(npamam)：在圆底烧瓶中加入10ml乙二胺和14.5ml丙烯酸甲酯以及上述离子液体，室温下搅拌反应24h，即制得聚酰胺胺，完成反应后萃取、旋干；
43.c.树突状多重半抗原(h1-npamam4)的合成：取3.8g半抗原h1产物和1.0g聚酰胺胺溶于100ml二甲基亚砜，加入1g edci、1g hobt为缩合剂，室温下搅拌反应2h，完成反应后萃取，旋干。
44.人工抗原h1-npamam
4-protein合成路线：
45.人工抗原分子式参见图4。
46.含有羧基的树突状多重半抗原(h1-npamam4)在二环己基碳化二亚胺(dcc)的作用
下，与n-羟基琥珀酰亚胺反应，生成活化酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶合物。
47.称取合成的树突状多重半抗原(h1-npamam4)1mm，溶于1ml n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入0.42mm n-羟基琥珀酰亚胺(nhs溶于1ml dmf)和72mg n，n-二环己基碳二亚胺(dcc，溶于1ml dmf)，室温搅拌1h，4℃过夜后产生沉淀。
48.次日12000
×
g，30min，4℃离心，离心后将上清液加入到15ml浓度为4mg/ml的载体蛋白(bsa或ova)的pbs溶液中，4℃反应5h。反应结束后将反应液装入透析袋，用pbs透析2天去除未偶联的小分子，经紫外分光光度法检测树突状多重半抗原(h1-npamam4)与bsa的偶联比为81:1，与ova的偶联比为53:1。
49.尸胺多克隆抗体的制备：
50.人工抗原组用以上合成的免疫抗原h1-npamam
4-bsa溶液与等量弗氏完全佐剂充分乳化后用于免疫小鼠，制备尸胺多克隆抗体；对照组为尸胺与等量弗氏完全佐剂充分乳化后用于免疫小鼠。方法如下：取200g左右8周龄的balb/c小鼠，每只背部多点皮下注射h1-npamam
4-bsa溶液与佐剂混合抗原0.1ml，对照组每只背部多点皮下注射尸胺与佐剂混合物0.1ml。2周后对小鼠进行第2次免疫，3周后进行第3次免疫，再3周后进行第4次免疫。
51.第4次免疫后第10天，眼眦取血0.2ml，室温静置2h后离心，取血清进行倍比稀释，采用间接酶联免疫(elisa)方法检查抗血清效价。测得人工抗原组血清效价大于或等于50000:1，对照组血清中未产生尸胺抗体。通过小鼠断头采血制备大批量抗血清，这些抗血清即为尸胺多克隆抗体，经分装后冻存。
52.结果表明，免疫原h1-npamam
4-bsa中点效价(od
492nm
＝1)为13200:1，终点效价(p/n≥2)为70000:1。
53.人工抗体特异性测定：
54.分别以精胺、亚精胺、组胺和β-苯乙胺等相关化合物作为小分子竞争物，采用所建立的elisa方法进行试验。根据抑制曲线进行回归计算，计算产生50％抑制(或结合)的竞争物浓度ic50和各竞争物相对于半抗原(h1-npamam4)的交叉反应性，测定结果见表1。
55.表1抗体特异性和交叉反应性
[0056][0057]
结果表明，该实施例所选的相关化合物对抗体均不显示交叉反应性，四种竞争物的ic50均大于105ng/ml，表明制备的尸胺多克隆抗体具有较高的特异性识别能力。
[0058]
实施例2
[0059]
半抗原(2)的合成路线：
[0060]
称取3.0g尸胺以及3.6g马来酸酐溶于100ml的二氯甲烷中，加入10ml三乙胺作为缚酸剂，室温下搅拌反应5h。反应结束后抽滤得半抗原h2产物。
[0061]
树突状多重半抗原(h2-npamam4)合成路线：
[0062]
树突状多重半抗原(h2-npamam4)的合成步骤同实施例1中树突状多重半抗原(h1-npamam4)的合成步骤。
[0063]
人工抗原h2-npamam
4-protein合成路线：
[0064]
人工抗原h2-npamam
4-protein的合成步骤同实施例1中人工抗原h1-npamam
4-protein的合成步骤。
[0065]
实施例3
[0066]
半抗原(3)的合成路线：
[0067]
半抗原(3)的合成中，除反应物为3.0g尸胺和3.6g琥珀酸酐，其余反应物和合成步骤同实施例2中半抗原(2)的合成，反应结束获得半抗原h3产物。
[0068]
树突状多重半抗原(h3-npama m4)合成路线：
[0069]
树突状多重半抗原(h3-npamam4)的合成步骤同实施例1中抗原树突状多重半抗原(h1-npama m4)的合成步骤。
[0070]
人工抗原h3-npamam
4-protein合成路线：
[0071]
人工抗原h3-npamam
4-protein的合成步骤同实施例1中人工抗原h1-npama m
4-protein的合成步骤。
[0072]
实施例4
[0073]
半抗原(4)的合成路线：
[0074]
称取3.0g磺胺溶于100ml的二甲基亚砜中，然后逐滴加入20ml乙醛酸，滴加完毕后，搅拌加热，缓慢升温至65℃，继续搅拌反应12h。反应结束后，待冷却至室温后进行抽滤，得半抗原h4产物。
[0075]
树突状多重半抗原h4-npama m4合成路线：
[0076]
树突状多重半抗原(h4-npama m4)的合成步骤同实施例1。
[0077]
人工抗原h4-npamam
4-protein合成路线：
[0078]
人工抗原h4-npamam
4-protein的合成步骤同实施例1中人工抗原h1-npama m
4-protein的合成步骤。
[0079]
实施例5
[0080]
半抗原(5)的合成路线：
[0081]
称取3.0g磺胺以及3.6g马来酸酐溶于100ml的二氯甲烷中，加入10ml三乙胺作为缚酸剂，室温下搅拌反应5h。反应结束后抽滤得半抗原h5产物
[0082]
树突状多重半抗原合成路线：
[0083]
树突状多重半抗原(h5-npama m4)的合成步骤同实施例1。
[0084]
抗原h5-npamam
4-protein合成路线：
[0085]
人工抗原h5-npamam
4-protein的合成步骤同实施例1中人工抗原h1-npama m
4-protein的合成步骤。
[0086]
实施例6
[0087]
半抗原(6)的合成：
[0088]
除反应物为3.0g磺胺和3.6g琥珀酸酐，其余反应物和合成步骤同实施例2中半抗原(2)的合成，反应结束后获得h6产物。
[0089]
树突状多重半抗原合成路线：
[0090]
树突状多重半抗原(h6-npama m4)的合成步骤同实施例1。
[0091]
抗原h6-npamam
4-protein合成路线：
[0092]
人工抗原h6-npamam
4-protein的合成步骤同实施例1中人工抗原h1-npama m
4-protein的合成步骤。