atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用及应用方法

1.本技术属于生物检测技术领域，尤其涉及atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用及应用方法。


背景技术：

2.花鲈(lateolabrax maculatus)，隶属鲈形目(perciformes)、鮨科(serranida e)、花鲈属(lateolabrax)，俗称鲈鱼，海鲈，是我国重要的海产经济鱼类，也是典型的广盐性鱼类，可以适应0～45
‰
的盐度范围。然而，研究表明，淡水养殖的花鲈相对于海水腥味更浓，且香味更淡。并且在epa，dha以及不饱和脂肪酸等营养成分的含量上，海水养殖花鲈也显著高于淡水养殖花鲈。
3.故而，对花鲈的海淡水养殖品种进行区分具有重要意义，可以挑选出营养成分更高，更可口的花鲈。但水产品在脱离了生长环境后难以判断来源，故迫切需要开发一种有效且通用的方法来鉴别花鲈的养殖环境。


技术实现要素：

4.本技术实施例的目的在于提供atp1b1b基因作为分子标记物在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用，旨在提供一种有效且通用的方法来鉴别花鲈的养殖环境。
5.本技术实施例是这样实现的，atp1b1b基因作为分子标记物在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用。
6.本技术实施例的另一目的在于用于鉴定海淡水养殖花鲈的pcr引物，所述pcr引物包括atp1b1b引物与内参引物；其中，
7.所述atp1b1b引物包括如seq id no：1所示的正向引物和seq id no：2所示的反向引物；
8.所述内参引物为以18s为内参的引物，核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和seq id no：4所示的反向引物。
9.本技术实施例的另一目的在于用于鉴定海淡水养殖花鲈的原位杂交探针合成特异性引物，所述原位杂交探针合成特异性引物包括如seq id no：5所示的正向引物和seq id no：6所示的反向引物。
10.本技术实施例的另一目的在于atp1b1b基因作为分子标记物在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用方法，包括：
11.以花鲈鳃组织cdna为模板，分别用所述的atp1b1b引物与内参引物进行实时荧光pcr扩增，得到每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的atp1b1b循环数与内参循环数；
12.计算所述atp1b1b循环数与内参循环数的差值，以通过所述差值的范围判断花鲈的养殖环境；
13.利用所述的原位杂交探针合成特异性引物检测atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鳃
组织中的阳性信号位置，以通过所述阳性信号位置判断花鲈的养殖环境。
14.本技术实施例提供的atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用，将atp1b1b作为一种有效的海淡水养殖花鲈鉴定的分子标志物，其鳃组织表达水平与离子转运密切相关；本技术通过检测花鲈鳃组织中atplb1b基因的表达水平和表达位置，可以快速及准确地区分海淡水养殖的花鲈个体。
附图说明
15.图1为本技术实施例中荧光实时定量pcr atp1b1b检测引物的扩增曲线；
16.图2为本技术实施例中海淡水养殖花鲈个体中atp1b1b的
δ
ct值；
17.图3为本技术实施例中淡水养殖花鲈个体中atp1b1b的阳性信号和阴性对照参考图；
18.图4为本技术实施例中海水养殖花鲈个体中atp1b1b的阳性信号和阴性对照参考图。
具体实施方式
19.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
20.本技术实施例提供了atp1b1b基因作为分子标记物在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用。
21.具体地，通过atp1b1b分子标记物的检测进行海淡水养殖花鲈的鉴定。
22.atp1b1b基因的表达水平在海水养殖花鲈的鳃组织中远低于淡水花鲈，故通过atp1b1b基因在鳃组织中的表达水平判断花鲈的养殖环境简单快速。除此之外，花鲈atp1b1b基因在淡水鳃组织中阳性信号主要位于鳃小片中部和底部上皮，相邻鳃小片之间的鳃丝上皮也可检测到少量表达。而在海水鳃组织中该基因的阳性信号主要位于相邻鳃小片之间的鳃丝上皮中。故通过atp1b1b金银在鳃组织中的表达位置判断海淡水养殖花鲈准确直观。
23.在本技术实施例中，通过荧光实时定量pcr和原位杂交检测花鲈鳃组织中atp 1b1b的表达水平和表达位置。
24.本技术实施例提供了用于鉴定海淡水养殖花鲈的pcr引物，所述pcr引物包括atp1b1b引物与内参引物；其中，
25.所述atp1b1b引物包括如seq id no：1所示的正向引物和seq id no：2所示的反向引物；
26.所述内参引物为以18s为内参的引物，核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和seq id no：4所示的反向引物。
27.本技术实施例提供了用于鉴定海淡水养殖花鲈的原位杂交探针合成特异性引物，所述原位杂交探针合成特异性引物包括如seq id no：5所示的正向引物和seq id no：6所示的反向引物。
28.本技术实施例提供了atp1b1b基因作为分子标记物在海淡水养殖花鲈鉴定中的应
用方法，包括：
29.以花鲈鳃组织cdna为模板，分别用上述的atp1b1b引物与内参引物进行实时荧光pcr扩增，得到每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的atp1b1b循环数与内参循环数；
30.计算所述atp1b1b循环数与内参循环数的差值，以通过所述差值的范围判断花鲈的养殖环境；
31.利用上述的原位杂交探针合成特异性引物检测atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鳃组织中的阳性信号位置，以通过所述阳性信号位置判断花鲈的养殖环境。
32.其中，所述差值的范围涉及海水花鲈参数范围(海水养殖花鲈鳃组织的差值范围)以及淡水花鲈参数范围(淡水养殖花鲈鳃组织的差值范围)；所述海水花鲈参数范围为经实时荧光pcr验证过的atp1b1b分子标记物在海水养殖花鲈中的δct值范围，所述淡水花鲈参数范围为经实时荧光pcr验证过的atp1b1b分子标记物在淡水养殖花鲈中的δct值范围。
33.其中，所述δc
t
为atp1b1b的c
t
值减去18s的c
t
值。以花鲈鳃组织cdna为模板，用atp1b1b和18s的特异性引物进行实时荧光pcr扩增，得到每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即c
t
值。
34.在一些实施例中，本技术提供了海水花鲈参数范围和淡水花鲈参数范围，所述海水和淡水花鲈参数范围如表4所示。淡水养殖花鲈鳃组织的差值范围在15.39～16.77之间；海水养殖花鲈鳃组织的差值范围在17.85～20.26之间。
35.在一些实施例中，本技术提供了atp1b1b分子标记物在海淡水养殖花鲈鳃组织中的阳性信号参考位置。所述参考如图3和图4所示，花鲈atp1blb基因在淡水养殖花鲈鳃组织中阳性信号主要位于鳃小片中部和底部上皮，相邻鳃小片之间的鳃丝上皮也可检测到少量表达。而在海水养殖花鲈鳃组织中该基因的阳性信号主要位于相邻鳃小片之间的鳃丝上皮中。
36.以下给出本技术某些实施方式的实施例，其目的不在于对本技术的范围进行限定。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
37.实施例1海淡水养殖花鲈鳃组织atp1b1b的δct值在表4参考范围内。
38.(一)实验对象：
39.收集了山东省东营市利津县双瀛水产苗种有限责任公司海淡水养殖的上市规格花鲈6尾，平均体重812
±
25.71g。用ms-222(200mg/l)麻醉处理后，收集鳃组织样本于液氮中快速冷冻(或放于rna保护液4℃过夜)后置于-80℃保存。
40.所有实验设计和实验对象处理均遵循中国海洋大学研究与伦理委员会的指导和批准(20141201)。
41.(二)实验方法：
42.1、rna提取及检测(组织总rna提取试剂-trizol)
43.(1)取花鲈性腺10～30mg，加到盛有1ml trizol的管中。用研磨机充分匀浆(1400rpm，运行15s，间歇15s，4～8个循环)后，室温静置5min。
44.(2)分相：每1ml trizol加入200μl氯仿，混匀(剧烈振荡-振荡器震荡)，呈奶昔状，室温放置3～5min，使其自然分相。
45.(3)离心分层：4℃，12000rpm，10～15min，吸取上清(400μl即可)于新的rnase-ffee管中。
46.(4)沉淀：在上清中，加入等体积的异丙醇(振荡器震荡)，室温放置10～20min。
47.(5)离心沉淀：4℃，12000rpm，10min，弃上清，得沉淀于管底的rna(白色片状，当样品过小时肉眼不可见)。
48.(6)乙醇清洗 离心：rna沉淀中，沿管壁缓慢加入1ml 75％乙醇(用rnase-ffee水配制，3∶1，现配现用)，轻轻上下颠倒洗涤离心管，悬浮沉淀，轻弹洗涤。随后4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。
49.(7)乙醇清洗 离心 晾干：与步骤6相同，改换成100％的乙醇。室温放置10min左右，晾干沉淀(打开管盖，倒扣在卫生纸上晾干5min，随后放平离心管再晾干5min，确保管内没有可见的液体)。
50.(8)溶解rna：沉淀中加入10～20μl rnase-ffee水(若rna沉淀不可见则加入10μl)，轻弹管壁，以充分溶解rna，可放于-80℃保存。
51.(9)测浓度：原液1μl，使用核酸测定仪(biodropsis bd-1000，北京ostc)检测rna浓度，数值在100ng/μl以上最好。
52.(10)跑电泳：当rna浓度大于100ng/μl时，可用于质量验证。制做1
‰
的琼脂糖凝胶；加rna(300～500ng)，6x buffer(1μl)，体系用rnase-ffee水补全至6μl，额外留孔跑mark(5μl)验证琼脂糖凝胶可用；150v电压电泳15min。良好的rna三条带清晰可见。
53.(11)提取的rna可直接进行逆转录或置于-80℃保存。
54.2、rna逆转录为cdna(monscript
tm rtiii super mix with dsdnase试剂盒-monad)
55.以下操作过程均于冰上进行。
56.(1)去除基因组dna：为避免基因组dna影响后续的定量结果，在进行逆转录前，先去除基因组dna。吸取最多8μl的rna模板加入200μl pcr管，加入dsdnase和buffer各1μl，轻弹混匀，离心后放入pcr仪，37℃温育2min，去除基因组dna污染；55℃温育5min，使dsdnase失活。
57.(2)rna逆转录为cdna：吸取5x rtiii super mix 4μl和nuclease-free水6μl加入上述反应液中，轻弹混匀，离心后放入pcr仪，50℃温育15min，进行逆转录反应；85℃温育5min，终止反应。获得的cdna可立即使用或置于-20℃保存。
58.3、qpcr反应
59.(1)引物合成
60.引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列具体如下表1所示：
61.表1
62.引物名称碱基序列(5
′‑3′
)序列表编号atp1b1b_fggctggcatcttcatcggaaccseq id no.1atp1b1b_rgtgtaaggcaggtaagtctccatgtcseq id no.218s_fgggtccgaagcgtttactseq id no.318s_rtcacctctagcggcacaaseq id no.4
63.(2)反应体系及过程
64.使用莫纳生物科技有限公司monamp
tm
fastgreen qpcr mix试剂进行qpcr反应，反应体系如下表2所示：
65.表2
66.2x sybr green i mix10.0μl正向引物0.4μl反向引物0.4μlcdna2.0μlddh2o7.2μl总体积20.0μl
67.轻弹混匀，瞬时离心将反应液收集管底，确认无气泡残留后，通过stepone实时荧光定量pcr系统完成pcr扩增，每个反应设置三个重复，反应参数如下表3所示：
68.表3
69.基因预变性变性退火&延伸循环数atp1b1b95℃，30s95℃，10s55℃，15s4018s95℃，30s95℃，10s60℃，15s40
70.(3)数据分析
71.计算atp1b1b与18s的ct差值，即
δ
ct，通过
δ
ct的范围判断花鲈的养殖环境，
δ
ct值越高，其代表的表达值就越低。具体应用如下表4所示：
72.表4
73.海水花鲈参数范围淡水花鲈参数范围17.85～20.2615.39～16.77
74.(三)实验结果：
75.如图1所示，atp1b1b引物在4n倍稀释的条件下，r2在99.9％以上，相关性良好，斜率为2.122，根据公式：
76.扩增效率＝稀释梯度
斜率-1
77.可知，atp1b1b的扩增效率为92.2％，在90～105％范围内，扩增效果良好。
78.如图2所示，淡水养殖花鲈鳃组织的atp1b1b
δ
ct范围在15.39～16.77之间，海水养殖花鲈鳃组织的atp1b1b
δ
ct范围在17.85～20.26之间，差异显著，且没有交集。
79.实施例2海淡水养殖花鲈鳃组织atp1b1b的
δ
ct值不在表4参考范围内
80.(一)实验对象
81.收集了山东省东营市利津县双瀛水产苗种有限责任公司海淡水养殖的上市规格花鲈2尾，平均体重857
±
23.10g。用ms-222(200mg/l)麻醉处理后，收集鳃组织样本用pbs清洗，用4％多聚甲醛固定(固定时间看组织大小6h～12h过夜，时间不宜太长)，后可脱水浸蜡处理或更换为depc水配制70％酒精并置于-20℃保存。
82.所有实验设计和实验对象处理均遵循中国海洋大学研究与伦理委员会的指导和批准(20141201)。
83.(二)实验方法
84.1、探针合成
t7 rna聚合酶-2.0μldepc水to 20μlto 20μl
103.将上述试剂加入200μl离心管中，混匀后于37℃孵育2h，加入2μl dnase i后混匀，于37℃孵育15min。加入2μl edta(0.2m，ph＝8.0)终止反应，加入3μl licl(4m)。
104.b)75μl预冷的无水乙醇，充分混匀后转移到1.5ml离心管中。
105.c)于-20℃静置3h，于4℃，12000rpm离心30min。
106.d)弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀。弃去75％乙醇，干燥沉淀，加入20μl depc灭菌水溶解沉淀。确保干燥完全。
107.e)1.2％琼脂糖凝胶电泳检测合成探针的特异性及完整性，紫外分光光度计测定rna探针的浓度，保存于-80℃备用。
108.2、组织切片
109.(1)石蜡包埋组织
110.将固定好的鳃组织切取适宜大小的组织放入包埋盒，建议组织大小小于5
×5×
2mm。脱水浸蜡步骤如下表9所示：
111.表9
112.序号试剂时长170％酒精50min280％酒精50min390％酒精40min495％酒精40min5100％酒精30min6100％酒精30min750％酒精50％二甲苯20min8二甲苯20min9二甲苯10min10软蜡(熔点45-50℃)50min(55℃)11硬蜡(熔点56-58℃)50min(63℃)12硬蜡(熔点56-58℃)50min(63℃)
113.所述过程中的乙醇溶液均用depc水配制。包埋好的组织放在4℃的冰箱保存。
114.(2)切片处理
115.a)将组织切成7um的切片，37℃用depc水展于载玻片(提前用多聚赖氨酸处理)上，37℃烘箱过夜。
116.注：将多聚赖氨酸(solarbio，北京)用干净的棉签涂抹载玻片，室温晾干后，75℃烘箱过夜备用。
117.b)脱蜡：二甲苯透明-无水乙醇-95％乙醇-80％乙醇(depc水配制)，快速，几秒即换。
118.c)用1x pbs(depc水配制，4℃冰箱里有pbs粉末，加500ml的depc水即可)摇床冲洗5min。
119.d)浓盐酸(670ul)加到1x pbs(40ml)中摇床冲洗10min。
120.e)用1x pbs摇床冲洗10min。
121.f)蛋白酶k(10ug/ml)37℃消化10～30min。
122.g)1x pbs摇床冲洗10min。
123.h)三乙醇胺(532ul)、醋酸酐(100ul)和浓盐酸(160ul)加到1*pbs(40ml)中，摇床冲洗10min。
124.i)用depc水配制2x ssc摇床冲洗10min。
125.3、杂交
126.(1)预杂交
127.滴加200ul的hybridization buffer于载玻片上，55℃预杂交1h。
128.(2)杂交
129.a)用hybridization buffer稀释探针(0.2ul探针加120～200ul稀释液)，95℃变性5min，迅速置于冰上冷却。
130.b)将探针稀释液滴加到载玻片上，55℃杂交16～20h。
131.(3)抗体孵育与显色
132.a)杂交后的切片依次在2x ssc(55℃预热)、1x ssc和0.1x ssc中洗15～30min。
133.b)用washing buffer洗2x5min，blocking buffer封闭半个小时。
134.c)用blocking buffer按1∶5000比例稀释的抗地高辛抗体，常温孵育1～2h。
135.d)用washing buffer洗4x20min。
136.e)detection buffer中平衡5min，在20ul nbt-bicp/1ml detection buffer中避光显色。
137.f)杂交信号至合适强度后(随时在显微镜下观察)，拍照。
138.g)1％中性红复染数秒，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微观察拍照。
139.(三)实验结果
140.用t7 rna聚合酶合成的反义rna链作为杂交探针，sp6 rna聚合酶合成的正义rna链作为杂交的阴性对照。结果表明，如图3所示，花鲈atp1b1b基因在淡水鳃组织中阳性信号主要位于鳃小片中部和底部上皮，相邻鳃小片之间的鳃丝上皮也检测到少量表达。如图4所示，在海水鳃组织中该基因的阳性信号主要位于相邻鳃小片之间的鳃丝上皮中。
141.以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。
142.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。