与油菜镁含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnMg-1A1及其应用

与油菜镁含量性状qtl紧密连锁的分子标记bnmg-1a1及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及与油菜镁含量性状qtl紧密连锁的分子标记bnmg-1a1及其应用。


背景技术：

2.甘蓝型油菜是由甘蓝和白菜经自然种间杂交和加倍进化而来，其菜用属性在起源和进化上具备科学基础。随着双低油菜品种的广泛推广，油菜的菜苗及菜薹作为可口蔬菜正逐渐被广大消费者认可。研究表明，油菜是镁元素的良好植物转化载体，培育镁元素高效利用的油菜新品种是改善人体矿质营养素缺乏和推动油菜全价值链开发利用的一种重要技术手段。
3.应用传统育种技术进行镁等矿质营养素的作物育种改良难度较大，存在选择效率低、育种周期长等缺陷。随着分子生物学和测序技术的快速发展，通过基因型选择辅助的育种手段经实践证明是解决传统育种困境的有效途径，而性状紧密连锁的分子标记开发是该技术应用的重要前提。利用分子标记辅助选择检测油菜中与镁含量积累紧密关联的分子标记，可降低繁琐的表型鉴定工作规模，指导性状的精准导入或聚合，将极大提高育种效率。
4.本发明以油菜核心种质资源群体为材料，利用全基因组关联分析鉴定油菜中具有育种应用潜力的镁含量相关qtl位点，并基于qtl位点信息开发分子标记，对加速富镁油菜新品种选育和提升油菜生产效益有积极作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是在于提供了检测甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组第a01染色体上第28505729位碱基的试剂在甘蓝型油菜镁含量筛选育种中的应用。通过对甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组第a01染色体上第28505729位碱基进行基因型的检测，即可实现对油菜镁元素富集能力的筛选育种。
6.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
7.与油菜镁含量性状qtl位点qbnmg-1a1的获得：
8.(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用ctab法提取总dna，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50k illumina snp芯片对每个样本进行基因型分析。
9.(2)利用illumina beadstudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率》0.05以及snp标记在甘蓝型油菜darmor基因组(chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行snp标记的过滤，最终获得21,243个高质量snp标记用于全基因组关联分析。
10.(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入structure v.2.3.4进行群体结构
reveals the ge netic basis of ecotype divergence。
27.实施例1：
28.油菜镁含量性状主效qtl位点qbnmg-1a1的获得：
29.(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用ctab法提取总dna，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50k illumina snp芯片对每个样本进行基因型分析。
30.(2)利用illumina beadstudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率》0.05以及snp标记在甘蓝型油菜darmor基因组(chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行snp标记的过滤，最终获得21,243个高质量snp标记用于全基因组关联分析。
31.(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入structure v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用spagedi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(hardy and vekemans,2002)。
32.(4)利用油菜水培培养体系(含2mm镁元素)，将327份材料种植于水培温室；培养至五叶期后，采集菜苗样品进行镁含量测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过火焰原子吸收法测定样品中镁元素含量。
33.(5)结合基因型数据、群体结构和油菜苗期镁含量数据，利用tassel 5.0软件(bradbur y et al.,2007)进行关联分析，在a01染色体上检测到与油菜镁含量显著关联的snp标记bn-a01_28505729，最高可解释12.2％的表型变异，显著水平为9.61e-06，该snp变异位点(由g到c的变异)位于甘蓝型油菜darmor-bzh v10(rousseau-gueutin et al.,2020)基因组a01染色体的第28505729位碱基处，该snp位点紧密连锁的镁含量主效qtl位点被命名为qbnmg-1a1。
34.实施例2：
35.一种与油菜镁含量性状qtl位点qbnmg-1a1紧密连锁的分子标记引物的获得：
36.(1)提取甘蓝型油菜a01染色体第28505729位碱基上下游各100bp的序列，按照kasp(kompetitive allele-specific pcr，即竞争性等位基因特异性pcr)分子标记引物设计原则，针对其反义链，开发kasp分子标记bnmg-1a1，该标记包括两条竞争性正向引物bn mg-1a1-f1和bnmg-1a1-f2，分别对应上述snp变异位点的互补序列碱基c和g，以及一条反向通用引物bnmg-1a1-r，引物序列如下：
37.bnmg-1a1-f1：aaacgtttctcatatcacctctctg
38.bnmg-1a1-f2：aaacgtttctcatatcacctctctc
39.bnmg-1a1-r：aggaatgttctcgctgtactgatta
40.上述引物，需根据kasp标记开发的原则，在使用前需加上kasp标记的通用接头。
41.其中bnmg-1a1-f1前所加接头序列为gaaggtgaccaagttcatgct，bnmg-1a1-f2前所加接头序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
42.在甘蓝型油菜wase chousen中扩增的序列为a基因型(即cc基因型)，序列如下所示：aggaatgttctcgctgtactgattaagtgaaaggtcgagagaggtgatatgagaaacgttt(seq id no.1所示)。
43.在甘蓝型油菜ww 1286中扩增的序列为b基因型(即gg基因型)，序列如下所示：aggaatgttctcgctgtactgattaagtgaaaggtccagagaggtgatatgagaaacgttt(seq id no.2所示)。
44.(2)对标记采用竞争性等位基因特异性pcr技术在油菜关联群体中进行基因型分型，扩增使用试剂盒为五引物扩增受阻突变体系(pams)，按照pams pro snp gentyping pcr mix试剂盒说明，设计10ul反应体系：2
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parms master mix 5μl，allele x primer(10μm)0.15μl，allele y primer(10μm)0.15μl，common r primer(10μm)0.4μl，油菜基因组dna 10-100ng。扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65-57℃(touch-down)1min，循环10次；94℃20s，57℃1min，循环30次；采集1次荧光信号并输出基因型结果。再利用tassel软件进行关联分析，明确bnmg-1a1与油菜镁含量性状qtl位点qbnmg-1a1显著关联。
45.利用上述方法，明确bnmg-1a1标记与油菜镁含量性状主效qtl位点qbnmg-1a1显著关联。
46.实施例3：
47.基于油菜a01染色体第28505729位碱基设计的引物在油菜镁含量性状筛选育种中的应用，其步骤如下：
48.(1)挑选出327份材料中经过多代自交已纯合的镁含量较高和较低的材料各26份，应用含2mm镁的油菜水培营养体系培养至五叶期，利用火焰原子吸收法测定样品中镁元素含量。
49.(2)检查分子标记bnmg-1a1的两种基因型在上述镁含量较高和镁含量较低的材料中分布情况。结果表明，分子标记bnmg-1a1的基因型在26份镁含量较高的材料中8份为a，16份为b，而在26份镁含量较低的材料中20份为a，6份为b(表1)。
50.(3)t测验结果表明分子标记bnmg-1a1检测出的a和b两类基因型在油菜苗镁含量上存在极显著差异(p《0.01)。
51.以上的结果足以说明我们制备的分子标记bnmg-1a1与油菜苗中镁含量是高度关联的，因而可用于油菜镁高效性状的分子标记辅助选择。
52.表1：分子标记bnmg-1a1在油菜菜苗镁含量极端材料中的基因型
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