非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白及其构建方法、应用和抗体ELISA试剂盒与流程

技术特征：
1.一种非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白，其特征在于，由非洲猪瘟病毒cd2v蛋白与mgf360-505r蛋白的b细胞表位以柔性肽串联后形成。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：1所示。3.一种如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的编码基因进行xhoi及xbai酶切位点酶切后，利用t4 dna连接酶将酶切后的基因片段亚克隆至pet28a载体，构建重组质粒，然后使用大肠杆菌bl21进行表达，得到非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的编码基因通过以下方法设计筛选得到：用python运行程序对非洲猪瘟病毒p30蛋白、p72蛋白、cd2v蛋白、mgf360-505r蛋白的b细胞表位以柔性肽串联并进行自动化排列组合，然后利用蛋白可溶性预测工具对自动化排列组合形成的序列逐一进行蛋白可溶性预测，根据需求筛选蛋白可溶性预测值合格的蛋白序列，通过分析得到其编码基因。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。6.一种如权利要求1或2所述或由权利要求3-5中任一项所述构建方法得到的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白在抗体elisa检测中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白进行抗体elisa检测，其方法包括如下步骤：(1)将所述的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白稀释后加入至elisa板进行包被；(2)在所述所述elisa板中加入bsa封闭液进行封闭孵育；(3)将待测血清样品稀释后加入至所述elisa板进行一抗孵育；(4)将hrp-抗猪lgg稀释后加入至所述elisa板进行酶标二抗孵育；(5)用tmb底物进行显色反应，用浓硫酸终止反应，采用分光光度计测量od
450
数值，进行结果判定。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白稀释后的浓度为1-6ng/μl；在步骤(2)中，所述待测血清样品按体积比1∶25-200进行稀释，所述一抗孵育的时间为30-90min；在步骤(3)中，所述酶标二抗按体积比1∶5000-8000进行稀释；在步骤(5)中，所述显色反应的时间为5-15min，按照以下标准进行结果判定：若待测血清样品的od
450
值大于0.551，则判断为阳性，若待测血清样品的od
450
值低于0.551，则判定为阴性。9.一种基于权利要求1或2所述或由权利要求3-5中任一项所述构建方法得到的非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的抗体elisa检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗原的96孔可拆卸酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗、pbst洗涤液、tmb显色液和终止液。10.根据权利要求9所述的抗体elisa检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为所述非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的免疫血清，所述阴性对照血清为无特定病原体的猪血清，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗由其原液按1:7000倍体积稀释得到，所述pbst洗涤液为含有0.05％吐温20的0.01mol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为
2mol/l的硫酸溶液。

技术总结
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白，由非洲猪瘟病毒CD2v蛋白与MGF360-505R蛋白的B细胞表位以柔性肽串联后形成，该串联表位蛋白的表达量与包涵体含量更高，且具有一定的可溶性，与血清抗体具有反应性，能够用于抗体ELISA的检测。还公开了该非洲猪瘟病毒抗原重组串联表位蛋白的构建方法、在抗体ELISA检测中的应用及抗体ELISA检测试剂盒。本发明的应用和抗体ELISA检测试剂盒，特异性良好，重复性与稳定性好，灵敏度高，能准确识别ASFV野生型和CD2v基因缺失型毒株免疫后产生的血清样本，对ASF检测具有一定的参考价值，基于保守表位的血清学检测方法有望提供更广泛的诊断范围。泛的诊断范围。泛的诊断范围。


技术研发人员：王乃东 杨文兵 邹亚文 张丽杰 邬静 杨青 王昌建 金业
受保护的技术使用者：湖南普简生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2022/7/21