NADH保护剂及其制备方法与流程

nadh保护剂及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物制剂领域，具体涉及一种nadh保护剂及其制备方法。


背景技术：

2.目前常用的nadh保护体系是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系，该体系主要成分为葡萄糖、磷酸盐、g-6-pdh，hk(己糖激酶)，其主要原理是：nad 是nadh的氧化形式，葡萄糖在己糖激酶的催化下形成葡萄糖-6-磷酸，而后在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下将葡萄糖-6-磷酸形成磷酸葡萄糖酸内脂，同时将nad 还原成nadh，从而维持nadh相对浓度的稳定。但该体系由于使用到两种酶，因此在实际应用中有以下缺点：1、成本高：该体系中需要用到的两种酶市场价均较高，在实际使用中提高了成本；2、稳定性差：由于酶本身为不稳定的物质，在长期保存中，酶本身也会发生分解变性，最终失活，从而使保护体系保护能力减弱或无效。3、干扰反应。因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系本质是通过还原nad 为nadh达到保护目的。在nadh参与的反应中，如果保护体系中酶的量不恰当，就会干扰nadh反应为nad 的反应，对最终的结果产生干扰。


技术实现要素：

3.鉴于此，本发明提供一种nadh保护剂及其制备方法，旨在提供一种制备成本低，保护效果好nadh保护剂，避免实际使用中酶干扰的问题。
4.为达到上述目的，本发明提供一种nadh保护剂，所述nadh保护剂包括：缓冲液、还原剂、乙二醇以及bsa；
5.其中，所述nadh保护剂的ph值为9.0-10.0。
6.可选地，所述还原剂包括葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨酸钾中的至少一种。
7.可选地，所述还原剂的浓度为30g/l～50g/l。
8.可选地，所述nadh保护剂中，所述乙二醇的浓度为200ml/l～400ml/l。
9.可选地，所述nadh保护剂中，所述bsa的浓度为0.5g/l～2g/l。
10.可选地，所述缓冲液包括tris缓冲液、pbs缓冲液和good’s缓冲液中的任意一种。
11.可选地，所述缓冲液的浓度为50mmol/l～100mmol/l。
12.此外，本发明提供一种上述nadh保护剂的制备方法，所述nadh保护剂的制备方法包括以下步骤：
13.向去离子水中加入缓冲液，得第一溶液；
14.向所述第一溶液中依次加入还原剂、乙二醇和bsa，得第二溶液；
15.将所述第二溶液得ph值调整为9.0-10，得nadh保护剂。
16.本发明中，利用其他还原性物质来保护nadh，发生氧化还原反应时，其他还原性物质参与反应，而nadh保持稳定，不参与反应，通过这个办法来达到保护nadh的目的。挑选还原型强，稳定性好，价格低廉的保护剂成分，从而解决保护体系成本高，稳定性差的问题。通过完全摈弃酶保护剂的思路，避免了实际使用中酶的干扰问题。同时，高ph用于稳定nadh。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为本发明提供的nadh保护剂的制备方法流程图。
19.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
21.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.目前常用的保护体系是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系，但该体系由于使用到两种酶，因此在实际应用中因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶体系本质是通过还原nad 为nadh达到保护目的。在nadh参与的反应中，如果保护体系中酶的量不恰当，就会干扰nadh反应为nad 的反应，对最终的结果产生干扰。
23.鉴于此，本发明提供一种nadh保护剂，以下为本发明提供的nadh保护剂的一实施例。
24.所述nadh保护剂包括以下组分：
25.缓冲液、还原剂、乙二醇以及bsa；其中，所述nadh保护剂的ph值为9.0-10.0。
26.本发明中，利用其他还原性物质来保护nadh，发生氧化还原反应时，所述还原剂中的还原性物质参与反应，而nadh保持稳定，不参与反应，通过这个办法来达到保护nadh的目的。挑选还原型强，稳定性好，价格低廉的所述还原剂成分，从而解决nadh保护体系成本高，稳定性差的问题。通过完全摈弃酶保护剂的思路，避免了实际使用中酶的干扰问题。同时，高ph用于稳定nadh。
27.在一些实施例中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷(tris缓冲液)，磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)以及两性离子缓冲液(good’s缓冲液)中的任意一种，采用上述缓冲剂可进一步提高溶剂的ph环境的稳定性。具体地，上述任一缓冲液的浓度均在50mmol/l～100mmol/l。
28.在一些实施例中，所述还原剂包括葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨酸钾中的至少一种。采取上述还原性物质，避免了对nadh的氧化伤害，提高了nadh保存的稳定性。
29.在一些实施例中，所述乙二醇的浓度为200ml/l～400ml/l；所述bsa的浓度为0.5g/l～2g/l，采用乙二醇和bsa用于保护nadh的稳定性，同时维持nadh的相对浓度的稳定性。
30.此外，本发明还提供一种上述nadh保护剂的制备方法，所述nadh保护剂的制备方法包括：
31.s10、向去离子水中加入缓冲液，得第一溶液；
32.s20、向所述第一溶液中依次加入还原剂、乙二醇和bsa，得第二溶液；
33.s30、将所述第二溶液得ph值调整为9.0-10，得nadh保护剂。
34.以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.实施例1～实施例4
36.实施例1～4提供分别一种nadh保护剂，具体成分如表1所示：
37.表1实施例1～4nadh保护剂的成分和终浓度
[0038][0039]
实施例1～4还提供上述nadh保护剂的制备方法，具体操作方法：
[0040]
s10、向去离子水中加入缓冲液，得第一溶液；
[0041]
s20、向所述第一溶液中依次加入还原剂、乙二醇和bsa，得第二溶液；
[0042]
s30、将所述第二溶液得ph值调整为9.0～10.0，得nadh保护剂。
[0043]
其中，制备方法中按照上表所述的物质进行制备。
[0044]
实施例5～实施例8
[0045]
实施例5～8提供分别一种nadh保护剂，具体成分如表2所示：
[0046]
表2实施例5～8nadh保护剂的成分和终浓度
[0047][0048]
实施例5～8还提供上述nadh保护剂的制备方法，具体操作方法：
[0049]
s10、向去离子水中加入缓冲液，得第一溶液；
[0050]
s20、向所述第一溶液中依次加入还原剂、乙二醇和bsa，得第二溶液；
[0051]
s30、将所述第二溶液得ph值调整为9.0～10.0，得nadh保护剂。
[0052]
其中，制备方法中按照上表所述的物质进行制备。
[0053]
对比例1
[0054]
本对比例提供一种与实施例1成分大体一致的抗体保存液，唯一不同的是，不含还原剂。
[0055]
对比例2
[0056]
本对比例提供一种与实施例1成分大体一致的抗体保存液，唯一不同的是，不含乙二醇。
[0057]
对比例3
[0058]
本对比例提供一种与实施例1成分大体一致的抗体保存液，唯一不同的是，不含bsa。
[0059]
试验例1
[0060]
1.用刻度吸管吸取血型lewis a抗体加入分别加入到实施例1～8及对比例1nadh保护液中，并使血型lewis a抗体的浓度为500μg/ml，一部分4℃条件下保存，另一部分测试效价，经测试不同的抗体保护液，其初始效价均为1：512。
[0061]
2.一月后，拿出在4℃保藏的部分按上述步骤再次检测效价，计算后一次效价与前一次效价的比值，即为活性保持率，同时，将未进行实验的部分再次在4℃再次保藏，期间反复冻融，两月后再次取出，进行效价检测的实验测试，检测的效价与初始效价的比值即为活性保持率，测试的结果如表3所示。
[0062]
表3效价实验检测结果
[0063] 一月后的活性保持率(％)两月后的活性保持率(％)
实施例110090实施例210090实施例3100100实施例410090实施例510080实施例610080实施例7100100实施例810080对比例15010对比例25025对比例35025
[0064]
从表3看出，实施例1～8相较于对比例1而言，采用了还原剂作为保护剂，相较于对比例2而言，加入了抗氧化剂，使抗体在4℃的条件下保存一个月后，活性保持率在100％，经过反复冻融后的活性保持率在50％以上。同时，当dadh的ph值为9，且保护剂含酪蛋白钠时，经过反复冻融后，抗体的活性保持率在100％。
[0065]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。