一株耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株能耐受酱油环境胁迫及具有高效转化脂肪醛能力的植物乳杆菌，特别涉及酱油发酵菌种开发领域。


背景技术：

2.酱油是我国的传统调味品，呈红褐色，味道鲜美，酱香浓郁，主要是以大豆、小麦等为原料，经过微生物的发酵作用，生成含有多种氨基酸、肽、有机酸及糖类的调味品。以大豆为主要原料的传统酱油酿造工艺中，高盐稀态酱油发酵时间长达180天，尤其是发酵后期，多不饱和脂肪酸氧化加剧，脂肪醛类物质积累，对风味产生不利影响。大豆油脂富含多不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸等，在长时间的酱油酿造过程中极易发生自动氧化，原料中的脂肪氧合酶也会加速其氧化变质，油脂氧化后期常会形成小分子的二级氧化产物，如丙醛、戊醛、正己醛和庚醛等，亚油酸经氧化可以形成正己醛、庚烯醛、壬稀醛和2，4-壬二烯醛等脂肪醛；亚麻酸经氧化可以形成己烯醛。脂肪醛类物质是多不饱和脂肪酸氧化降解的标志物，c6-c9的正烷基醛和c7-c11单不饱和醛等脂肪醛的不断积累会影响酱油的风味，例如正己醛具有强烈的、酸败味、不愉快的气味；庚醛具有青草、令人作呕的气味；2-己烯醛和2-壬稀醛具有青草味，豆腥味，不愉快气味，也会带来一定程度的安全问题。
3.乳酸菌是酱油发酵微生物体系中的主要细菌，乳酸菌的代谢活动对酱油香气和风味形成有重要作用。目前应用于酱油生产的乳酸菌主要是嗜盐四联球菌，而植物乳杆菌也是酱油酿造过程中的重要乳酸菌，能耐受高盐、氧化压力和发酵后期的酸性环境，在酱油风味物质形成方面起了至关重要的作用，是用于人工接种发酵改善酱油风味的理想菌株。有研究表明，利用植物乳杆菌发酵豆浆能改善豆浆风味显著减少豆腥味和青草的气味，脂肪醛是豆浆腥味物质的主要成分，可以通过植物乳杆菌的发酵得以有效转化。
4.酱油发酵过程中常用高浓度的盐来抑制有害微生物的生长，这也是乳酸菌在发酵中遇到的主要环境应力，除此之外酱油在发酵过程中，有机酸不断积累，会形成ph较低的酸性环境造成酸胁迫，以及不饱和脂肪酸氧化带来的氧化压力。因此从酱油中筛选优良植物乳杆菌并评估其转化脂肪醛能力，对于抑制酱油中油脂的氧化酸败，消除酱油潜在安全隐患，提升产品风味品质，促进高品质酱油的生产具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有酱油制备方法中存在的问题，提出了本发明。
7.本发明的一个目的是提供一株能耐受酱油环境胁迫及具有高效转化脂肪醛能力的植物乳杆菌及其应用。
8.为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案，具体步骤如下：
9.一株耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌，名称为：植物乳杆菌cs3，分类命名为：lactobacillus plantarum，保藏日期为：2021年5月17日，保藏机构为：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021532，保藏地点：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
10.耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌在酱油发酵中的应用。
11.耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌在酱油发酵调节剂中的应用。
12.一种发酵酱油用发酵剂，含有上述植物乳杆菌。
13.一种发酵酱油脂肪醛调节剂，含上述的植物乳杆菌。
14.而且，发酵液中含小于等于18％nacl。
15.而且，对3％nacl、2mmol/l h2o2和ph4.5有耐受性。
16.耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌在转化酱油发酵中脂肪醛的应用。
17.耐环境胁迫及脂肪醛能力高的植物乳杆菌在增加酱油发酵中的酯含量的应用。
18.本发明的优点效果如下：
19.本发明提供的植物乳杆菌cs3，筛选自江苏如皋古法酿造酱油发酵3年酱醪，其特征在于能耐受高盐环境，能在18％nacl的环境中生长。
20.本发明提供的植物乳杆菌cs3能耐受酱油环境造成的多胁迫条件，对复合条件3％nacl、2mmol/l h2o2和ph4.5有较强耐受性。
21.本发明提供的植物乳杆菌cs3转化酱油发酵中脂肪醛，己醛为主要目标物，对于外源添加的己醛转化率在99％以上。植物乳杆菌cs3转化己醛，增加发酵液中己酸和己醇含量，以及相应的酯类含量。
附图说明
22.图1为本发明实施中植物乳杆菌在mrs琼脂培养基上的菌落形态图。
23.图2为本发明实施中耐盐菌株鉴定的系统发育树图。
24.图3为本发明实施中耐盐菌株的生长曲线(a)普通培养基，(b)高盐培养基图。
25.图4为本发明实施中多胁迫条件下植物乳杆菌cs3的生长曲线(a)己醛胁迫(b)盐和己醛胁迫(c)盐、氧和己醛胁迫(d)盐、酸、氧和己醛胁迫。
26.图5为本发明实施中不同己醛添加量的发酵液中总酸含量变化。
27.图6为本发明实施中cs3代谢己醛挥发性产物的gc-ms质谱图。
具体实施方式
28.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
29.本发明提供一株植物乳杆菌cs3，是从江苏如皋古法酿造酱油发酵3年酱醪中分离获得。所述植物乳杆菌cs3，在mrs琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，革兰氏染色呈紫色，杆状，触媒阴性，硝酸盐还原实验、明胶液化实验、硫化氢实验、吲哚实验及运动性实验均呈阴性菌株。
30.所述植物乳杆菌cs3，通过采用细菌通用引物27f/1492r对其基因组总dna为模板进行pcr扩增，得到由碱基对1188(bp)组成的目的基因序列。将测序得到的基因序列输入
ncbi数据库进行比对，其与genebank中的标准菌株lactobacillus plantarum相似率达100％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)
31.所述植物乳杆菌cs3，通过平板和液体耐盐试验表明其具有较强的耐盐能力，能在含18％nacl的环境中生长。并且对酸和氧化压力也有一定耐受性。
32.所述植物乳杆菌cs3具有转化脂肪醛能力，以己醛为主要目标，本发明菌株能转化99％以上己醛。
33.将本发明的植物乳杆菌cs3进行发酵，有机酸含量增加，脂肪醛转化成酸类和醇类，并且相关的酯类种类增加。
34.实施例1
35.植物乳杆菌的分离
36.所用酱油样品采用古法酿造，来自江苏如皋老酱油，分别从发酵一年、两年和三年的发酵池取样，采用五点法取样，充分混匀后置于无菌ep管中并存放于-80℃冰箱。无菌条件下称取酱油样品5.0g，与45ml无菌生理盐水混合，与摇床中振荡2h，使微生物细胞分散，制成10-1
稀释度的稀释液，并进行系列梯度稀释。分别取0.1ml稀释度为10-5
、10-6
和10-7
的稀释液接种到caco3-mrs固体培养基和高盐培养基中，涂布后将平板分别置于37℃厌氧培养箱和普通培养箱中培养48h，观察并挑取周围产生透明圈的菌落，并进行反复划线纯化得到纯种菌株。进行甘油管保存，在无菌环境下将菌液与50％的甘油按照1：1混合均匀，保存于-80℃冰箱中。保存的菌株活化三次后进行生理生化实验。
37.观察并记录菌落形态，菌落的大小、颜色、形状，菌落边缘、凸起和透明情况，如图1。挑取的菌落周围产生透明圈，菌落颜色以白色、乳白色、淡黄色为主；外形以圆形为主，表面光滑、湿润，质地均匀，容易挑取。选取革兰氏染色阳性菌及过氧化氢酶反应、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、硫化氢实验、吲哚实验及运动性实验均呈阴性菌株。
38.实施例2
39.植物乳杆菌的分子生物学鉴定
40.将活化的菌株培养至对数期，取1ml菌液，8000r/min离心收集菌体，加入100μl无菌水混匀，使细胞浓度约为105个/μl。取10μl加入到90μl无菌水中稀释10倍，制备105、104、103、102和10个/μl浓度的菌液，每个稀释度取3μl接种在含有5％和10％nacl的平板上，观察菌落生长情况。选取能在含10％nacl的平板上生长的菌株进行鉴定。
41.dna提取试剂盒步骤提取供试菌株的基因组，以细菌16s rrna序列通用引物(27f和1492r)进行pcr扩增，将pcr扩增产物送金唯智生物科技公司进行测序，将拼接好的序列结果在genbank数据库中进行blast同源性检索，再利用mega构建系统发育树。用mega中的邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树。如图2，分离得到as4、bn7、cn6、cs3和cs4都能与lactobacillusplantarum在同一分枝。因此结合菌株形态，生理生化实验结果，最终确定耐盐性较好的as4、bn7、cn6、cs3和cs4为植物乳杆菌。
42.实施例3
43.耐盐植物乳杆菌的筛选
44.选取耐盐性较好的植物乳杆菌as4、bn7、cn6、cs3和cs4进一步其研究在高盐渗透环境中的生长情况。将活化的菌株以3％接种量接种到含12％、15％和18％nacl(w/v)的液体培养基，测定菌液吸光度，观察生长能力。
45.5株菌株的生长曲线测定结果如图3，菌株的生长曲线反应了菌株的生长能力。在正常培养基中5株菌的长势基本相似，bn7和cn6生长速度略微缓慢，cs3在对数期且稳定期的高峰od
600
值最高，说明其生长能力较强于其它菌株。在添加12％nacl的培养基中，as4、bn7、cn6、cs4的耐盐性差，培养至30h后菌液依然澄清。cs3的耐盐性最强，生长速度比在正常培养基中有明显下降趋势，但在培养至20h后能达到稳定期，od
600
值达到1.1左右。在添加15％nacl的培养基中，cs3在15h之后有明显生长趋势，稳定期od
600
值能达到0.8左右。在添加18％nacl的培养基中，cs3仍有生长趋势。因此得到了能耐高盐的菌株cs3能在含盐量18％的环境中生长。
46.实施例4
47.耐盐植物乳杆菌的转化己醛能力比较
48.利用dnph衍生化法测定醛类化合物。醛的羰基与dnph的氨基在酸性条件下反应生成2，4-二硝基苯腙衍生物。所得到的dnph衍生物极大地提高了紫外灵敏度和疏水保留度，因此它们可以很容易地用液相色谱分离，并在340-380nm波长下使用紫外/可见分光光度法检测。
49.准确称取己醛标准品10.00mg于10ml棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容，得到浓度为1mg/ml的标准母液，密封，-20℃下保存。吸取不同体积的标准母液用异丙醇稀释制得0.2mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l和200mg/l的标准工作液，吸取不同浓度的己醛标准液1ml于ep管中，加入1ml dnph溶液，40℃水浴加热30min，在冷水中停止反应，用0.22μm的有机滤器过滤后在hplc中进行检测。使用高效液相色谱仪配有的紫外检测器，色谱柱为c18柱xselecttmhss ts(4.6250mm，5μm)。流动相为乙腈：水＝75：25(v/v)，柱温50℃，检测波长为365nm，流速为1.0ml/min，进样量20μl。以己醛的浓度(mg/l)为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。
50.将筛选得到的耐盐乳杆菌活化三次后，以3％的接种量接种到己醛代谢培养基(己醛添加量为200mg/l)中，密封，摇床培养，分别在24h和48h时取样用于己醛含量测定。同时设定不接菌的空白损耗组和接种到普通mrs培养基的内源性己醛测定组。外标法进行定量。
51.在外源添加己醛的培养基中，测定不同菌株代谢转化后发酵液中己醛含量的变化。己醛标准品测定标准曲线为：y＝228.34362x-20.99972和y＝445.13652 97.25427x。根据标准曲线，测定了植物乳杆菌as4、bn7、cn6、cs3和cs4发酵1d和2d后发酵液中己醛含量，其结果如表1所示。己醛为挥发性物质，在培养过程中会有损耗。在mrs培养基中添加200mg/l己醛，将不接菌的空白组与分别接入5株菌的实验组在同一条件下培养，观察菌株的代谢情况和损耗情况。空白组在发酵1d时己醛剩余量为155.5539mg/l，损耗率为22.22％，发酵2d己醛剩余量为110.8170mg/l，损耗率为44.59％。5株植物乳杆菌对己醛的转化率都在99％以上，as4和cn6的转化率略低其它菌株，cs3、bn7和cs4转化率相差不大。同时将cs3接种到普通培养基发酵液未能检测到己醛的产生。由此可见，发酵1d时植物乳杆菌几乎可将全部己醛代谢转化，并不产生己醛。
52.表1植物乳杆菌转化己醛能力测定
[0053][0054]
实施例5
[0055]
酱油环境条件胁迫下植物乳杆菌的耐受性的评价
[0056]
取活化好的菌株以3％的接种量接种于胁迫条件培养基中，37℃恒温培养，每隔2h取一次样品，以培养时间为横坐标，测得od
600
为纵坐标绘制菌株生长曲线。选取三个不同浓度的己醛添加量500、1000和2000mg/l绘制生长曲线观察菌株对己醛的耐受性。在添加己醛的基础上添加盐(添加3％、5％和7％nacl)、氧(添加2mmol/l、5mmol/l和8mmol/l h2o2)、酸(ph4.0、4.5和5.0)和复合胁迫，观察菌株对条件胁迫的耐受性。结果如图4，在酱油环境造成的盐、酸和氧化压力复合胁迫条件下(添加3％nacl、2mmol/l h2o2和ph4.5)，植物乳杆菌cs3有较好适应性，并能代谢转化己醛。
[0057]
实施例6
[0058]
植物乳杆菌的转化己醛产酸
[0059]
在添加己醛的发酵液中接入植物乳杆菌cs3，分别在12h、24h、36h和48h时取样用于总酸含量测定。吸取1.0ml发酵液，置于50ml容量瓶中，蒸馏水定容，混匀后取25.0ml，加25ml蒸馏水，并滴加2滴酚酞指示剂，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至微变红且30s不褪色，同时做试剂空白实验。总酸含量计算公式：褪色，同时做试剂空白实验。总酸含量计算公式：
[0060]
x－样品总酸含量(以乳酸计，g/l)；
[0061]v2
－样品消耗氢氧化钠溶液体积(ml)；
[0062]v1
－空白组消耗氢氧化钠溶液体积(ml)；
[0063]
c－氢氧化钠溶液浓度(mol/l)；
[0064]
90－乳酸的摩尔质量数值(g/mol)。
[0065]
在同一发酵时间下测定总酸变化，如图5，未添加己醛的发酵液总酸含量均高于添加己醛的含量，其中在12h时含量差距最大，随着发酵的进行差距逐渐减小。添加己醛浓度为500mg/l的总酸含量在12h时略高于己醛浓度为1000mg/l的情况，在24-48h期间，己醛浓度为500mg/l的总酸含量均低于己醛浓度为1000mg/l的发酵液。根据前述实验结果图4(a)可知，在添加己醛500mg/l和1000mg/l的情况下cs3的生长速度被抑制，细胞的代谢能力也
会减弱，而且己醛浓度越高对菌体生长抑制更明显。因此，未添加己醛时cs3生长和代谢能力强，所以产酸量高于其他组。cs3在500mg/l浓度中的生长能力强于在1000mg/l浓度，而其产酸量在24h之后都比后者低，所以高浓度的己醛转化为有机酸增加了其总酸含量。
[0066]
实施例7
[0067]
植物乳杆菌cs3发酵风味物质变化
[0068]
利用gc-ms检测发酵1d和2d的发酵液中代谢物的变化，分别在24h和48h时取样，发酵液离心取上清液3ml置与顶空瓶中，并加入79ppm苯己醇标准品10μl。hs-spme：密封顶空瓶后在加热磁力搅拌器上，60℃水浴平衡15min。平衡后，萃取头顶空萃取30min，温度为60℃，gc-ms进样250℃解吸15min。gc条件：起始温度为40℃保持3min，以4℃/min上升到150℃保持1min，再以8℃/min上升到250℃保持6min。以氦气为载气，进样口温度为250℃，进样时间1min。ms条件：离子源温度200℃，接口温度220℃，溶剂延迟时间1.5min，电离方式为ei，70ev扫描质量范围为33～500m/z，扫描速率为3.00scans/s。根据nist11数据库检索选取相似度≥80％的化合物，并结合离子碎片及保留指数进行定性。以苯己醇为内标物质，采用内标法进行定量。
[0069]
离子峰图如图6。与对照组相比，添加500mg/l和1000mg/l己醛的发酵液中明显增加的物质为己醛(5.7min)，正己醇(8.5min)，己酸(14.1min)由此可以看出己醇和己酸是己醛转化的主要产物。醇类和酸类含量显著增加，如表2，添加500mg/l己醛的发酵液中醇类含量是对照组的10倍以上，添加量为1000mg/l是500mg/l的2倍左右。添加己醛后酸类物质的含量在1d时是对照组的2倍以上，2d时是对照组的7倍以上，而吡嗪类物质减少，在添加量为1000mg/l的发酵液中未检测到，酯类和酮类变化不显著。
[0070]
表2植物乳杆菌发酵的风味物质变化
[0071]
[0072][0073]
注：0-1表示己醛添加量为0mg/l发酵1d，0-2表示己醛添加量为0mg/l发酵2d；500-1表示己醛添加量为500mg/l发酵1d，500-2表示己醛添加量为500mg/l发酵2d；1000-1表示己醛添加量为1000mg/l发酵1d，1000-2表示己醛添加量为1000mg/l发酵2d。
[0074]
含量变化明显的具体物质如表3，未添加己醛的对照组中为检测到己醇，添加己醛组中都有己醇产生，并且添加量为1000mg/l是500mg/l的2倍左右。己酸含量也显著增加，添加己醛组是对照组的40倍以上。此外还观察到有正己酸乙烯酯、乙酸己酯、丁酸己酯、甲氧基乙酸己酯、己酸己酯、正己酸乙酯、(e)-2-己酸丁酯、辛酸己酯和(e)-2-甲基丁-2-烯酸己酯等酯类产生，此外还有己酮等酮类的产生。说明利用植物乳杆菌cs3进行发酵，转化己醛生成己醇和己酸，并产生多种酯类、酮类等物质，改变风味组成。
[0075]
表3植物乳杆菌发酵的具体风味物质
[0076]
[0077]
[0078][0079]
植物乳杆菌cs3序列
[0080][0081]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0082]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳
实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。