新多肽及其在制备治疗皮肤创面或黏膜损伤药物中的应用的制作方法

1.本发明属于药物及日化领域，具体涉及一组新多肽及其在制备治疗和/或预防皮肤创面或黏膜损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒(avian erythroblastic leukemia viral,v-erb-b)致癌基因同源体，为her/erbb家族的四个成员之一，故又名her1或erbb-1。egfr及其配体是细胞信号传导系统的一部分。研究表明，egfr基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。egfr的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占了重要的地位。从1984年egfr基因被首次克隆，研究显示，egfr是治疗肿瘤的一个很有前景的靶分子。
3.皮肤和或黏膜损伤是很多疾病的共同病理特征，皮肤损伤是指正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。也称为伤口或者创伤。目前有包括碱性成纤维生长因子、表皮因子、血小板生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子及生长激素等蛋白质/多肽药物具有明显的修复创伤、护肤、抗皱和防衰老作用，但这些蛋白质/多肽药物的氨基酸序列较长导致制备成本高、稳定性较差等缺点，因而其应用受到了一定的限制。
4.慢性胃炎是一种胃黏膜慢性炎症，是消化内科的常见病和多发病，临床上将不同原因引起的胃黏膜慢性炎症(即在病理上表现为单核细胞和淋巴细胞浸润)和(或)腺体萎缩性病变称为慢性胃炎。慢性胃炎好发于中老年人群，发病和年龄有一定的关联但与性别没有关系，发病缓慢且病势缠绵，迁延难愈，治疗棘手。
5.目前在皮肤黏膜疾病以及肿瘤的治疗领域仍然有很多难题需要科学技术人员研究解决，发现更好更多的有治疗前景的药物。


技术实现要素：

6.现有治疗手段尚不能满足临床治疗需求，为了更好的治疗皮肤和黏膜疾病以及肿瘤，如：急慢性胃肠道疾病，皮肤或黏膜损伤疾病，发明人通过大量的实验研究，在多肽领域的药学和药理学研究，经过实验发现多条多肽与表皮生长因子受体egfr相结合发挥生物学效应，具有减轻急慢性胃肠道疾病的病理发展、促进皮肤损伤修复、抗肿瘤抗纤维化等作用。
7.本发明的目的在于提供一组新多肽。
8.进一步地，所述新多肽具有表1中seq id no:1～seq id no:10所示的任一条氨基酸序列：
9.表1新多肽的氨基酸序列
10.多肽名称氨基酸序列序列编号pa1vpphlfseq id no.1pa2lrgfeppseq id no.2pa3kwapseq id no.3pa4tastlseq id no.4pa5laavdseq id no.5pa6lagldseq id no.6pa7lagnkseq id no.7pa8kclkkqqgpseq id no.8pa9tatkpmptvetseq id no.9pa10kastkfkveseq id no.10
11.进一步地，本发明所述的新多肽具有与egfr受体结合的作用。
12.进一步地，本发明所述的新多肽的制备方法可采用现有技术中公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪按常规固相合成方法进行化学合成，也可以通过将短肽氨基酸序列推导出核苷酸序列，然后通过基因工程技术手段进行生物合成。
13.进一步地，本发明提供的多肽可作为药物或者日化用品的组成部分。
14.进一步地，本发明还提供了所述新多肽的组合物，含seq id no.1～seq id no.10所示的至少一条氨基酸序列的肽，或药学上可接受的盐和可药用载体或赋形剂。组合物可以以药物制剂形式存在，可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物活性成分，本发明的多肽与药物载体混合，按照制剂学常规技术制成所需要的剂型。
15.进一步地，本发明提供了所述新多肽在制备治疗和/或预防与egfr靶点有关疾病的产品中的应用。
16.进一步地，本发明提供了所述新多肽在制备治疗和/或预防皮肤创面疾病、黏膜创面疾病、肿瘤相关疾病的药物中的应用。
17.进一步地，所述皮肤创面疾病包括光老化、银屑病、牛皮癣、湿疹、神经性皮炎、皮肤干燥症、机械及手术创面、烫伤、烧伤、溃疡、瘘管、褥疮、放化疗引起的皮肤损伤等疾病。
18.所述黏膜创面疾病包括急性胃炎、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃十二指肠溃疡、功能性胃肠道疾病、消化不良、癌前病变、消化系统肿瘤、胃肠道出血、胃食管返流疾病、口腔溃疡、口腔炎、牙龈炎、牙周炎、食管炎、食管溃疡、急慢性肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病和放化疗引起的黏膜损伤等疾病。
19.进一步地，所述的药物是以seq id no.1～seq id no.10所示的至少一条氨基酸序列的肽为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
20.进一步地，所述的制剂为口服制剂或外用制剂。
21.本发明中的多肽，分子量小、人工化学合成方便、纯度很高，生产方面，适合大规模生产；在应用方面，这些多肽对表皮生长因子受体egfr相结合发挥生物学效应，对各种原因引起的皮肤及黏膜损伤具有显著的治疗效果；多肽可用于治疗各类皮肤疾病、急慢性胃肠道疾病、肿瘤等相关疾病。
22.实验结果证明，本发明所述的一组新多肽对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型具有显著的抗溃疡活性；对大鼠皮肤机械损伤后具有显著的伤口愈合作用；对细胞具有增殖作用。证
实了本发明所述的新多肽能够有效促进消化系统黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展；可以治疗各类皮肤疾病，为皮肤疾病、急慢性胃肠道疾病、肿瘤等相关疾病提供了一种新的思路和策略。
附图说明
23.图1为新多肽pa1的质谱图。
24.图2为新多肽pa2的质谱图。
25.图3为新多肽pa3的质谱图。
26.图4为新多肽pa4的质谱图。
27.图5为新多肽pa5的质谱图。
28.图6为新多肽pa6的质谱图。
29.图7为新多肽pa7的质谱图。
30.图8为新多肽pa8的质谱图。
31.图9为新多肽pa9的质谱图。
32.图10为新多肽pa10的质谱图。
33.图11为新多肽pa2对hacat细胞的增殖影响分析图。
34.图12为新多肽pa2对hmec-1细胞的增殖影响分析图。
35.图13为新多肽pa3对hmec-1细胞的增殖影响分析图。
36.图14为新多肽pa4对hmec-1细胞的增殖影响分析图。
37.图15为新多肽pa5对hmec-1细胞的增殖影响分析图。
38.图16为新多肽pa10对rsc96细胞的增殖影响分析图。
具体实施方式
39.实施例1新多肽分子的筛选
40.(1)新多肽来自四川好医生攀西药业有限责任公司
41.(2)egfr蛋白靶点亲和力筛选
42.egfr亲和力筛选：分别取冷冻干燥成粉的本发明多肽用蛋白缓冲液溶解后，制得多肽化合物样品溶液，取适当浓度的egfr溶液与多肽化合物样品溶液在室温下孵育50min，后进行亲和力筛选，离心速度为90000rpm，时间为70min，离心分离后按体积取出分为上、中、下三层，每层加入适当体积乙腈和水沉淀蛋白后离心取上清液进行质谱分析。
43.采用egf多肽作为阳性化合物对照。
44.亲和力筛选条件：一维液相条件为色谱柱polylc色谱柱，流动相a为kh2po4，nacl，ph7.5，b为乙腈，柱温8℃，流速为1ml/min，取适当体积进样量；二维液相条件色谱柱为bonus rrhd，流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为0.1％甲酸乙腈，柱温60℃，流速为0.3ml/min，进样量为40ul。采用梯度洗脱：98％a(0-1min)，98％-10％a(1-6min)，10％a(6-7.5min)，10％-98％a(7.5-8min)，98％a(8-9.5min)。质谱条件：agilent 6530q-tof，esi离子源，电压3.5kv，质荷比扫描范围m/z＝200-3000，采集模式为正离子扫描，离子源温度为350℃，去溶剂温度为300℃，氮气流速8l/min。
45.经过亲和力筛选结果得到系列多肽与egfr具有亲和力，采用cb/ct比值表示，cb/
ct比值是指在超速离心亲和力筛选过程中下层化合物的量(质谱信号强度)比上层化合物的量质谱信号强度，cb/ct比值越大，说明亲和力越强。结果见表2所示。
46.表2与egfr有亲和力结合的新多肽筛选结果
47.多肽名称氨基酸序列序列编号masscb/ct范围阳性
‑ꢀ‑
4～5pa1vpphlfseq id no.1708.801.5～3pa2lrgfeppseq id no.2815.201.5～3pa3kwapseq id no.3500.31.5～3pa4tastlseq id no.4491.21.5～3pa5laavdseq id no.5487.21.5～3pa6lagldseq id no.6487.11.5～3pa7lagnkseq id no.7501.81.5～3pa8kclkkqqgpseq id no.81029.31.5～3pa9tatkpmptvetseq id no.91175.21.5～4pa10kastkfkveseq id no.101037.211.5～3
48.实施例2新多肽的化学合成方法
49.采用全自动多肽合成仪常规固相合成方法，经过树脂溶胀、脱保护、洗涤、氨基酸溶解、氨基酸活化、缩合过程，进行新多肽的化学合成，得到10个多肽，经过质谱分析，确认结构，图1～10为新多肽的质谱图。
50.实施例3新多肽pa2对hacat细胞增殖的影响
51.将人永生化角质形成细胞(hacat细胞)浓度调整为1.0
×
105～5.0
×
105/ml进行传代培养，于37℃，5％co2条件下培养24～36小时用于生物学活性检测。用0.25％胰酶消化细胞5min，加入胰酶体积1倍以上的1640全血培养基终止消化，收集细胞悬液，1000rpm离心3min，弃掉上清，加入2ml的1640全血培养基重悬细胞，取20ul细胞悬液，用aopi染色，再用细胞计数仪检测悬液中细胞的浓度，用10％血清浓度的1640培养基配成浓度5
×
104/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，即5000个细胞/孔，于37℃，5％co2条件下培养过夜。24h后弃掉原培养基，加入100μl 1％血清浓度的1640培养基配制的不同浓度多肽化合物溶液(pa2)，使待测多肽化合物终浓度分别为0.05、0.2、0.8ug/ml；同时设置egf对照组，即加入100μl用1％血清浓度的1640培养基配制的重组人表皮生长因子(egf)溶液，终浓度为100ng/ml；模型对照组，即加入等体积的1％血清浓度的1640培养基。于37℃，5％co2条件下培养72小时，采用cck8试剂盒检测hacat细胞株增殖情况。结果见图11。
52.实施例4新多肽对hmec-1细胞增殖的影响
53.将人微血管内皮细胞(hmec-1细胞)用10％血清培养基于37℃，5％co2条件下培养，每1～2d换液，控制细胞浓度为4
×
106细胞/ml进行传代。收集细胞，用完全培养基配成5
×
104细胞/ml；接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul，即5000个细胞/孔，于37℃，5％co2条件下培养至细胞贴壁。将多肽药物(pa2、pa3、pa4和pa5)用0％血清培养基配制成受试浓度(0.05ug/ml，0.2ug/ml，0.8ug/ml)作为实验组，同样的方法配置阳性药(300ng/ml)加入作为阳性对照，对照组加入等量0％血清不含药物培养基，5复孔加入，于37℃，5％co2条件下孵育48小时。使用cck-8检测细胞的增殖情况：除去旧培养基，每孔加入含10％cck-8的无血
清培养基，在培养箱内孵育2h后用酶标仪在450nm处测量吸光度。结果见图12～图15。
54.实施例5新多肽pa10对rsc96细胞增殖的影响
55.将神经胶质细胞(rsc96细胞)浓度调整为1.0
×
105～5.0
×
105/ml进行传代培养，于37℃，5％co2条件下培养24～36小时用于生物学活性检测。用胰酶消化并收集细胞，用无血清培养基配成浓度5
×
104/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，即5000个细胞/孔，于37℃，5％co2条件下培养过夜。
56.将多肽药物(pa10)用0％血清培养基配制成受试浓度(0.2ug/ml,0.4ug/ml,0.8ug/ml)作为实验组，对照组加入等量0％血清不含药物培养基，4复孔加入，于37℃，5％co2条件下孵育48小时。
57.使用cck-8检测细胞的增殖情况：除去旧培养基，每孔加入含10％cck-8的无血清培养基，在培养箱内孵育2h后用酶标仪在450nm处测量吸光度。结果见图16。
58.实施例6新多肽对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的抗溃疡作用
59.实验动物：spf级c57bl/6小鼠，成都药康生物科技有限公司，动物许可证号：scxk(川)2020-034
60.实验药物：阳性药物组为替普瑞酮，样品为pa1-pa10新多肽。
61.实验方法：实验动物适应性喂养后，实验前1天给药后所有动物开始禁食不禁水24h。造模前实验小鼠随机分组：空白组5只、模型组10只、各给药组每组10只，除空白组及模型组灌胃给予纯化水以外，给药组均按照0.2mg/kg的给药剂量灌胃给予不同受试样品，替普瑞酮组按照160mg/kg灌胃，给药1小时后，各组小鼠经口灌胃给予0.9ml/kg的无水乙醇造模，1h后利用脱颈法处死动物，结扎胃贲门和夹闭幽门，摘取全胃。向胃体内注入1％甲醛溶液1ml，结扎贲门，取出胃后即放入1％甲醛溶液中。浸泡30min后取出胃组织，沿胃大弯剪开，使用生理盐水冲洗干净胃内容物，平铺后观察并测定小鼠胃黏膜的损伤，计算溃疡指数和溃疡抑制率。结果见表3。
62.溃疡指数计算方法：条索状损伤长度大于1mm者，测量其长度，每毫米计1分；若其宽度大于1mm，将计分按宽度的毫米数加倍；长度小于1mm计0.5分，将计分相加得出该动物的溃疡指数。
63.溃疡抑制率＝(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数
×
100％；
64.相对溃疡抑制率＝(测试化合物溃疡抑制率)/(替普瑞酮溃疡抑制率)。
65.相对溃疡抑制率》1.20，表示为“ ”；
66.相对溃疡抑制率为0.9-1.20，表示为“ ”；
67.相对溃疡抑制率为0.6-0.9，表示为“ ”；
68.相对溃疡抑制率为0.3-0.6，表示为“ ”；
69.0《相对溃疡抑制率《0.3，表示为“/”(极低活性)。
70.表3新多肽对乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型的抗溃疡活性
[0071][0072][0073]
由表3可知，本发明所述的新多肽对乙醇诱导的小鼠溃疡模型具有显著的抗溃疡活性，且大多优于阳性药物。
[0074]
实施例7新多肽对大鼠急性机械皮肤损伤愈合作用的药效研究
[0075]
spf级sd大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重180～230g。将分别饲养于干净消毒笼内，每天定时给予水、饲料和更换垫料，保持饲养温度22℃，湿度55％～65％，饲养一周使其适应环境。按照随机分组法将动物分组：模型对照组(生理盐水)、金因肽对照组(40iu/cm2，深圳市华生元基因工程发展有限公司)、待测多肽治疗组(8、40μg/cm2)，每组6只。大鼠用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉成功后，剪去创口边缘1厘米处毛发，先用碘伏消毒创口区，再用75％的酒精局部消毒创口区，于耳连线中间向背部下4cm近颈侧以脊柱为中线位制作1.5cm
×
1.5cm(即直径是1.5cm)圆形全层皮肤创口，深至肌层。用橡胶圈固定其周围皮肤，形成急性机械性损伤动物模型。造模后大鼠伤口暴露，单笼饲养。换药时均先用碘伏清创，再以无菌生理盐水冲洗创面并拭干。其余组别大鼠创面局部涂抹40μl相应药物溶液，一天1次。在给药第3、7、14天，摄取每组大鼠的创面图像，采用图像分析软件(image j)计算创面面积，根据公式计算得出创面愈合率。结果见表4。
[0076]
表4机械损伤创面愈合过程中各组大鼠的创面愈合率
[0077]
组别3天7天14天模型对照组5.98
±
2.4523.80
±
3.9172.00
±
5.85金因肽对照组18.05
±
7.1856.98
±
9.88*85.32
±
3.12*pa1给药组(40μg/cm2)22.25
±
5.1758.12
±
6.71*87.34
±
2.58*pa2给药组(40μg/cm2)22.14
±
4.9259.71
±
7.76*92.92
±
2.15**pa3给药组(8μg/cm2)20.95
±
4.1759.84
±
8.36*88.30
±
5.57*pa4给药组(8μg/cm2)19.98
±
3.6857.97
±
7.79*86.45
±
6.45*pa5给药组(40μg/cm2)22.82
±
9.3959.58
±
9.66*88.27
±
7.81*pa6给药组(40μg/cm2)23.08
±
2.4557.24
±
4.81*89.52
±
4.39*pa7给药组(40μg/cm2)21.45
±
3.2559.22
±
7.17*94.33
±
2.30**pa8给药组(40μg/cm2)22.31
±
5.6762.08
±
7.43*89.37
±
8.66*pa9给药组(8μg/cm2)23.01
±
4.0563.39
±
2.73*92.94
±
2.96**pa10给药组(40μg/cm2)22.27
±
5.4755.78
±
9.62*92.23
±
3.87**
[0078]
与模型组相比，*：p《0.05；**：p《0.01；
[0079]
由表4可知，本发明所述的新多肽能够明显促进大鼠皮肤损伤的愈合，于模型组相
比具有显著性差异，且效果优于阳性对照金因肽。
[0080]
综上结果表明，本发明所述的新多肽pa1～pa10均能够有效促进消化系统黏膜损伤的修复，减轻急慢性胃炎及消化道溃疡的胃肠疾病病理的发展；可以促进皮肤伤口愈合，治疗各类皮肤疾病，为皮肤疾病、急慢性胃肠道疾病、肿瘤等相关疾病提供了一种新的思路和策略。