携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用

重组新城疫弱毒疫苗a-ndv-lx/i4，其构建方法为：将中国主要流行的ndv基因vii型分离株js-5-05-go的囊膜糖蛋白基因f基因的强毒裂解位点突变为弱毒位点，再将js-5-05-go 的致弱的囊膜糖蛋白基因f基因和hn基因片段与ndv/lx株基因组的对应部分进行替换，拯救构建出致弱的表达基因vii型f和hn重组新城疫弱毒疫苗a-ndv-lx/i4。不过其在拯救病毒的过程中，是将pci-np、pci-p和pci-l3个真核表达质粒与含有ndv基因组 cdna全长的转录载体(pa-ndv-lx/i4)共转染bsr-t7/5细胞，即其需要用4个质粒共转染细胞，只有当4个质粒同时进入一个细胞时才能拯救出病毒，拯救病毒的效率低。而且在基因替换过程中采用的是传统的基因酶切和连接方法，不但效率低，而且还在病毒基因组中引入额外的非病毒序列，由此导致未知的重组病毒生物学性状的改变和潜在危害。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种含有基因vii型的表达融合蛋白(fusion，f)和血凝素-神经氨酸酶 (hemagglutinin-neuraminidase,hn)的基因的嵌合型lasota弱毒株—rlasota-7f/hn。本发明以lasota疫苗株为骨架，在宿主菌大肠杆菌中利用同源重组技术和高效的反向筛选标记系统，将lasota疫苗株的f和hn基因分别替换为基因vii型ndv流行株的hn基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸突变为ndv弱毒株序列的基因vii型f基因，构建了带有基因vii型f和hn基因的嵌合型lasota弱毒株——rlasota-7f/hn，为研制防控基因 vii型ndv感染的新型、高效单联或多联的弱毒活苗和灭活疫苗提供制苗毒株和合适载体。
7.本发明嵌合型lasota弱毒株—rlasota-7f/hn的构建采用以下技术方案：
8.(1)lasota的感染性克隆质粒的构建。
9.具体的，利用重叠pcr将涵盖整个基因组的7个cdna片段克隆到转录载体poltv5 中，获得重组质粒plasota。
10.(2)分别构建含有vii型ndv流行毒株的f和hn基因的重组载体。
11.具体的，分别合成基因vii型ndv流行毒株全长的f和hn基因，并分别克隆在puc57 载体中，得到载体puc-7f和puc-7hn；在合成f基因过程中，将基因vii型ndv流行株的f基因中的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112rrqkr
↓
f117突变为 112grqgr
↓
l117。ndv的f基因与毒力相关，而且碱性蛋白酶裂解位点附近的氨基酸序列发挥决定作用，突变这些氨基酸是防止重组病毒的毒力增强。
12.(3)利用带有lasota株的f和hn基因两侧同源序列的引物，以步骤(2)中制备的重组载体puc-7f和puc-7hn为模板，分别扩增优化突变后的基因vii型ndv的f基因和hn基因，以含有抗性筛选标记amp以及大肠杆菌自杀基因ccdb的重组质粒 p15a-ccdb-amp为模板，扩增得到氨苄青霉素抗性筛选标记(amp)和大肠杆菌自杀基因 (ccdb)表达盒amp-ccdb。
13.(4)将带有lasota株f基因两侧同源臂的amp-ccdb表达盒与lasota的感染性克隆质粒plasota共电转化进宿主菌，利用氨苄青霉素抗性筛选f基因被amp-ccdb替换的阳性克隆，得到重组质粒plasota-δf-amp-ccdb。
14.(5)利用redαβ重组酶介导的同源重组技术，将plasota-δf-amp-ccdb中的amp-ccdb 替换为优化突变后的基因vii型ndv的f基因，得到重组质粒plasota-7f。
15.(6)利用带有lasota株hn基因两侧同源臂的引物扩增的amp-ccdb表达盒片段与重组质粒plasota-7f共电转化进宿主菌，利用氨苄青霉素抗性筛选hn基因被amp-ccdb替换的
筛选阳性克隆，得到重组质粒plasota-7f-δhn-amp-ccdb。
16.(7)用redαβ重组酶介导的同源重组技术，将重组质粒plasota-7f-δhn-amp-ccdb 中的amp-ccdb替换为基因vii型ndv的hn基因，得到重组质粒plasota-7f-hn。
17.(8)将重组质粒plasota-7f-hn与辅助质粒pci-np-p-l共转染bhk-21细胞，收集转染后的细胞裂解液，接种10日龄spf鸡胚，接种72小时后收获血凝活性阳性的鸡胚尿囊液即为重组病毒rlasota-7f-hn。
18.本发明的有益效果为：
19.本发明采用同源重组的方法构建含有基因vii型f和hn基因的嵌合型lasota弱毒株，该方法快捷高效，而且不引入任何非病毒基因序列。
20.本发明在病毒拯救时，重组质粒plasota-7f-hn与辅助质粒pci-np-p-l共转染bhk-21 细胞，相比现有技术中需要将3个辅助质粒和1个重组质粒共同转染细胞相比，2个质粒被共同转染进一个细胞的几率远远高于4个质粒被共同转染进一个细胞的几率，本发明拯救病毒的效率更高。
附图说明
21.图1为重组质粒plasota的结构示意图。
22.图2为重组质粒plasota-7f的apali酶切鉴定结果图。
23.图3为重组质粒plasota-7f-7hn的图谱。
24.图4为重组质粒plasota-7f-7hn的apal i酶切鉴定结果图。
25.图5为重组质粒pci-np-p-l的图谱。
26.图6为重组病毒rlasota-7f/hn在spf鸡胚中的复制动态图。
27.图7为血凝抑制试验(hi)检测rlasota-7f/hn疫苗免疫后的抗体水平图。
28.图8为rlasota-7f/hn活疫苗对基因vii型ndv攻毒的保护情况。
29.图9为rlasota-7f/hn活疫苗免疫后基因vii型ndv攻毒的组织显微病变情况。
30.图10为rlasota-7f/hn活疫苗免疫后基因vii型ndv攻毒的病毒载量图。保藏信息：鸡新城疫病毒基因vii型中国分离株fjsw2021：保藏时间：2021年12月13日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：cgmcc no.45060；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：基因vii型新城疫病毒。重组病毒rlasota-7f/hn：保藏时间：2021年12月13日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：cgmcc no.45059；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：携带基因vii型f和hn基因重组lasota毒株。
具体实施方式
31.下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
32.实施例中所用poltv5、puc57、gbred-gyra462感受态细胞、gb05-dir感受态细胞、 top10感受态细胞、bhk-21细胞均为市售产品。
33.实施例1带有基因vii型ndv流行株hn基因和碱性蛋白酶裂解位点氨基酸突变的f 基因的lasota株感染性克隆的构建
34.1.1ndv lasota疫苗株感染性克隆质粒的构建
35.根据genbank中公布的ndv lasota株序列(genbank登录号af077761)，利用重叠 pcr将涵盖整个基因组的7个cdna片段克隆到转录载体poltv5中，获得重组质粒 plasota，重组质粒plasota如图1所示；需要说明的是：完整的lasota基因组cdna上游为t7rna聚合酶启动子，下游带有δ肝炎病毒(hdv)的核酶序列(ribozyme)和t7转录终止序列。
36.1.2构建含有vii型ndv流行毒株的f和hn基因的重组载体
37.根据genbank数据库中公布的基因vii型ndv流行毒株的基因组序列，分别优化合成全长的f和hn基因，并分别克隆在puc57载体中，得到载体puc-7f和puc-7hn；在合成f基因过程中，将基因vii型ndv流行株的f基因编码的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112rrqkr
↓
f117突变为112grqgr
↓
l117；优化突变后的f基因的序列如seq idno:3所示，优化合成的hn基因的序列如seq id no:4所示。优化突变后的f基因编码的蛋白序列见seq id no:1，优化合成的hn基因编码的蛋白质序列见seq id no:2。
38.1.3基因vii型ndv的f基因和hn基因、抗性筛选标记的扩增
39.利用带有lasota株的f和hn基因两侧同源序列的引物(见表1)，以puc-7f和 puc-7hn为模板，分别扩增优化突变后的基因vii型ndv的f基因和优化后的hn基因，以p15a-ccdb-amp质粒(ccdb-amp是插在p15a的ndei和ecori位点之间)为模板，扩增氨苄青霉素抗性筛选标记(amp)和大肠杆菌自杀基因(ccdb)表达盒amp-ccdb。
40.表1扩增基因vii型ndv毒株f和hn基因以及相应amp-ccdb表达盒的引物
41.42.1.4转化筛选重组质粒plasota-δf-ampccdb
43.将带有lasota株的f基因两侧同源臂的amp-ccdb表达盒与lasota的感染性克隆质粒 plasota共电转化进宿主菌gbred-gyra462感受态细胞，在含有氨苄青霉素的lb琼脂平板上筛选阳性克隆，得到lasota株的f基因被amp-ccdb替换的重组质粒plasota-δ f-amp-ccdb。
44.1.5重组质粒plasota-7f的构建
45.使用paci限制性内切酶37℃过夜酶切plasota-δf-amp-ccdb质粒，通过t4 dna聚合酶将线性化的plasota-δf-amp-ccdb载体与优化突变后的基因vii型ndv的f基因片段进行聚合反应。聚合体系为200ng的优化突变后的基因vii型ndv的f基因片段、2μg 的线性化plasota-δf-amp-ccdb载体、2μl的10
×
neb buffer 2.1、0.2μl的t4 dna聚合酶、加入双蒸水补足体系至20μl，反应程序为25℃1h、75℃20min、50℃30min；将反应体系电转化至10％l-阿拉伯糖诱导的gb05-dir感受态细胞中，复苏1h后涂布至带有氯霉素抗性的lb平板，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落扩大培养，提取质粒经apali 限制性内切酶酶切和测序得到重组质粒plasota-7f，重组质粒的apali酶切鉴定结果见图 2。
46.1.6重组质粒plasota-7f-δhn-amp-ccdb的构建
47.将利用带有hn基因两侧同源臂的引物扩增的amp-ccdb表达盒片段与重组质粒 plasota-7f共电转化进宿主菌gbred-gyra462感受态细胞，在含有氨苄青霉素的lb琼脂平板上筛选阳性克隆，得到lasota株的hn基因被amp-ccdb替换的重组质粒plasota-7f
‑ꢀ
δhn-amp-ccdb。
48.1.7重组质粒plasota-7f-7hn的构建
49.使用paci限制性内切酶37℃过夜酶切plasota-7f-δhn-amp-ccdb质粒，通过t4 dna 聚合酶将线性化的plasota-7f-δhn-amp-ccdb载体与优化合成的基因vii型ndv的hn 基因片段进行聚合反应。聚合体系为200ng的优化合成的基因vii型ndv的hn基因片段、2μg的线性化plasota-7f-δhn-amp-ccdb载体、2μl的10
×
neb buffer 2.1、0.2μl 的t4 dna聚合酶、加入双蒸水补足体系至20μl，反应程序为25℃1h、75℃20min、 50℃30min；将反应体系电转化至10％l-阿拉伯糖诱导的gb05-dir感受态细胞中，复苏1 h后涂布至带有氯霉素抗性的lb平板，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落扩大培养，提取质粒经apali限制性内切酶酶切和测序得到重组质粒plasota-7f-7hn，质粒图谱见图 3，重组质粒的apali酶切鉴定结果见图4。
50.实施例2带有基因vii型ndv流行株hn基因和碱性蛋白酶裂解位点氨基酸突变的f 基因的重组lasota株的拯救
51.2.1表达ndv lasota疫苗株核蛋白(np)、磷酸蛋白(p)和大聚合酶蛋白(l)的转录辅助质粒的构建
52.将编码ndv lasota疫苗株的大聚合酶蛋白(l)的cdna序列克隆到pci-neo真核表达载体的cmv启动子下游；将编码核蛋白(np)和磷酸蛋白(p)的cdna通过2a肽序列串联后克隆到pci-neo真核表达载体的sv40启动子下游，获得同时表达np、p和l蛋白的转录质粒pci-np-p-l。具体采用以下方案：
53.a、np-2a-p的制备
54.以plasota质粒为模板，采用针对np的引物：
55.np-f:5
’‑
atgtcttccgtatttgatgag-3’；
56.np-r:5
’‑
acgtcaccgcatgttagaagacttcctctgccctcatacccccagtcgg-3’；
57.针对p基因的引物：
58.p-f:5
’‑
taacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggccacctttac-3’；
59.p-r:5
’‑
ttagccatttagagcaaggcgc-3’；分别进行pcr扩增np和p基因，分别以回收后的np基因及p基因为模板，以np-f/p-r引物进行融合pcr的扩增，并回收片段 np-2a-p。
60.b、重组质粒pci-np-2a-p的构建
61.以pci-neo载体为模板，以带有np基因和p基因同源臂序列的上下游引物ty-pcineo-f: 5
’‑
catcaaatacggaagacatggtggctctagccttaagttcg-3’和ty-pcineo-r: 5
’‑
gccttgctctaaatggctaagcgggactctggggttcgaaatg-3’进行扩增，将回收的扩增片段pci-neo载体与片段np-2a-p使用nebuilder重组试剂盒进行聚合重组，产物转化top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选阳性克隆，最终获得重组质粒 pci-np-2a-p。
62.c、重组质粒pci-np-p-l的构建
63.以l-xbai-f:5
’‑
acgcgttctagaaaggcaaaacagctc-3’和l-noti-r:5
’‑
gaattc gcggccgcccgggtcgacaattggccagaaaag-3’为引物扩增l基因，将纯化的l基因和质粒pci-np-2a-p分别进行xbai noti酶切，纯化后使用t4连接酶进行连接，转化top10 感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选阳性克隆，最终得到重组质粒pci-np-p-l。重组质粒pci-np-p-l的质粒图谱见图5。
64.2.2重组病毒的拯救
65.a、转录质粒和辅助质粒转染bhk-21细胞
66.将bhk-21细胞培养于6孔细胞培养板内生长至80％单层时，用表达t7 rna聚合酶的重组痘苗病毒vtf7-3以moi＝1感染细胞1h，吸弃重组痘苗病毒vtf7-3感染物，然后将2μg转录质粒plasota-7f-7hn与2μg辅助质粒pci-np-p-l按照lipofectamine 3000转染试剂盒操作说明共转染bhk-21细胞。转染后24h，弃去转染混合物，用pbs洗涤细胞 2次，加入含有2％胎牛血清的mem培养基继续孵育至96h。
67.b、重组病毒rlasota-7f/hn的获得
68.收获培养物上清，接种10日龄的spf鸡胚并培养120h，收获ha阳性尿囊液即为拯救的重组病毒rlasota-7f/hn。
69.实施例3重组病毒rlasota-7f/hn的生物学特性鉴定
70.3.1rlasota-7f/hn的rt-pcr鉴定
71.利用病毒基因组rna提取试剂盒分别提取lasota株感染尿囊液和rlasota-7f/hn感染鸡胚尿囊液的总rna。采用针对f基因两侧基因序列设计鉴定引物7f-f： 5
′‑
gctgcgtctc tgagattgcg-3
′
和7f-r：5
′‑
ggcctctcttaccgttctac-3
′
；以及 hn基因两侧的引物7hn-f：5
′‑
gtagaacggtaagagaggcc-3
′
；和7hn-r： 5
′‑
agcactggctgattgtggtc-3
′
进行rt-pcr；对pcr产物进行序列测定，鉴定显示f 和hn基因的正确插入。
72.3.2rlasota-7f/hn的生物学特性分析
73.按照oie标准测定第30代rlasota-7f/-hn的鸡胚平均致死时间(mdt)、鸡胚半数感染量(eid
50
)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(icpi)及6周龄鸡静脉接种致病指数(ivpi) 致病性指标。结果显示rlasota-7f/hn的mdt为130小时，icpi和ivpi指数均为0，符合弱毒株的
标准。接种spf鸡胚后96小时所收获尿囊液中重组病毒的eid
50
为10
8.5
/0.1ml。
74.3.3rlasota-7f/hn在鸡胚中的生长特性分析
75.将ndv lasota疫苗株和第30代rlasota-7f/hn按每胚102eid
50
的剂量分别接种10 日龄spf鸡胚，在接种后24h、48h、72h、96h和120h分别收获鸡胚尿囊液，测定eid
50
，分析lasota株与rlasota-7f/hn在鸡胚中的生长特性差异。结果显示，重组病毒 rlasota-7f/hn与ndvlasota疫苗株具有相似的在鸡胚中高复制特性，如图6所示。
76.实施例4重组病毒rlasota-7f/hn的免疫效力评价
77.4.1重组rlasota-7f/hn活疫苗接种
78.将购自北京梅里亚的60只1周龄白来航spf鸡随机平均分成3组，各组鸡均分别饲养于负压隔离器中。组1通过点眼滴鼻途径接种100微升含107eid
50
(半数鸡胚感染剂量) 的重组rlasota-7f/hn；组2通过点眼滴鼻途径接种100微升的正常鸡胚尿囊液；组3作为不接种的空白对照。疫苗免疫后每周采取各组鸡的血清样品，利用血凝抑制试验 (hemagglutinin inhibition,hi)测定疫苗免疫产生的抗鸡新城疫病毒抗体水平。在免疫后4 周，将组1和组2的鸡分别用105eld
50
(半数鸡胚致死剂量)的鸡新城疫病毒基因vii型中国分离株fjsw2021通过点眼滴鼻途径进行攻毒，组3不攻毒作为对照。攻毒后每天观察各组鸡的临床表现并记录鸡的发病率和死亡率，连续观察7天。
79.在攻毒后每天采集鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子，利用pcr测定攻毒鸡的排毒情况。同时，采集攻毒后发病死亡鸡的肺、气管、腺胃、十二指肠、盲肠扁桃体和法氏囊。将每个器官样品平均分成两份，一份利用荧光定量pcr测定组织中的ndv病毒载量，另一份用于制备组织病理切片，观察组织显微病变情况。
80.4.2血凝抑制试验(hi)检测疫苗免疫后的抗体水平
81.疫苗免疫后每周采取静脉血，分离血清后利用hi试验测定疫苗免疫后的抗ndv抗体水平。血凝抑制试验按照常规方法操作：将25微升血清样品进行2倍倍比稀释后转移到v 型底的96孔血凝板中，每孔加入25微升的4个血凝单位的基因vii型ndv抗原，震荡混匀后室温静置30分钟，然后每孔加入50微升0.5％鸡红血球，轻微振荡混匀后，室温静置 30分钟观察血凝抑制效果。以能够完全抑制血球凝集的最大血清稀释度的倒数作为抗体的 hi抗体滴度。
82.4.3实时荧光定量pcr
83.利用基因vii型新城疫病毒的hn基因作为检测标记物设计引物，进行实时荧光定量 pcr检测组织中的病毒载量。
84.上、下游引物分别为hn-qf：5
’‑
gcagagaccactcacactcaca-3’，hn-qr： 5
’‑
tgcaggacttccgattttgggtg-3’。实时荧光定量pcr的反应体系包括10μl of 2xchamq universal sybr qpcr master mix(诺唯赞，南京)，上下游引物(10μm)各1μl，1μl cdna模板，用无核酸酶的纯水补足体积20μl。反应条件为95℃预变性30秒，然后进行95℃10秒和60℃15秒扩增40个循环。将扩增的129-bp ndv hn基因片段克隆入 pmd18-t载体(宝生物工程(大连)有限公司)制备标准质粒。利用109～103拷贝/微升的 10倍倍比稀释的标准质粒借助cfx maestro软件建立标准曲线。病毒载量计算为每mg组织中的hn基因拷贝数结果报告为三次重复试验的平均值加上标准差。
85.4.4攻毒鸡的口咽和泄殖腔排毒检测
86.采用常规rt-pcr检测攻毒鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子中病毒核酸，以便确定排毒情况。rt-pcr引物采用针对基因vii型ndv的特异性引物ndv-f: 5
’‑
ggaagatcaaacgccttgc-3和ndv-r:5
’‑
gacaatcgggaatgctaacagg-3’，扩增产物的大小为325bp。
87.4.5重组病毒rlasota-7f/hn活疫苗免疫原性和免疫效力
88.利用重组病毒作为活疫苗通过点眼滴鼻途径免疫后，采集血清样品进行hi试验，检测疫苗产出的抗基因vii型ndv的抗体水平。检测结果显示，单剂量点眼滴鼻免疫即可诱导鸡体产生高水平的hi抗体，最高抗体滴度达到28(图7)。
89.在免疫后4周，利用基因vii型ndv强毒分离株fjsw2021进行攻毒，未接种疫苗的鸡表现精神沉郁，羽毛凌乱，在攻毒后第2天表现呼吸困难，张口喘气。病鸡排出绿色水样粪便，且在攻毒后84h开始出现死亡。图8结果显示，rlasota-7f/hn活疫苗接种组对基因vii型ndv强毒分离株fjsw2021的攻毒提供完全保护，而未免疫攻毒组在攻毒后第4天全部发病死亡。对病死鸡进行剖检发现，未免疫攻毒组所有病死鸡均有新城疫的典型剖检病变，包括腺胃坏死和出血，脾脏肿大。而rlasota-7f/hn活疫苗接种组和空白对照组的鸡仍然表现临床健康状况，没有出现明显的肉眼病变。死鸡的组织学病变包括肺间质慢性炎症浸润；脾、盲肠扁桃体和法氏囊淋巴细胞坏死；肠上皮和腺胃上皮细胞坏死，而 rlasota-7f/hn活疫苗免疫组和空白对照组的鸡没有出现上述组织学体征(图9)。
90.对攻毒后各组鸡的肺脏、气管、脾脏、十二指肠、腺胃、盲肠扁桃体和法氏囊等器官组织中的基因vii型病毒载量利用实时荧光定量pcr进行检测发现，rlasota-7f/hn活疫苗免疫组和空白对照组的病毒载量没有明显差异，但显著低于未免疫攻毒组(图10)。
91.为了确定rlasota-7f/hn活疫苗免疫能否阻止免疫鸡排毒，在攻毒后的第1至第7天分别采集鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子，利用实时荧光定量pcr检测排毒情况。表1结果显示，rlasota-7f/hn活疫苗免疫组鸡只在免疫后第3天即停止排毒，而未免疫攻毒组在攻毒后持续排毒直至死亡。
92.表1攻毒后不同天数的排毒情况
[0093][0094]
以上结果证明，利用本发明构建的重组病毒作为活疫苗免疫，可以为鸡提供针对基因 vii型新城疫病毒感染的良好保护。
[0095]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。