脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物的制作方法

脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
1.1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年8月20日提交的中国专利申请第202010846100.1号和2020年8月28日提交的美国临时申请第63/071,850号的优先权，各案的全部内容以引用的方式并入本文中。
3.2.序列表
4.本说明书与序列表的计算机可读格式(crf)副本一起提交。该crf的标题为14639-004-228_seqlisting_st25.txt，创建于2021年8月5日，大小为717字节，并且其全部内容以引用的方式并入本文中。
3.技术领域
5.本公开总体上涉及脂质化合物，其可与其他脂质组分，例如中性脂质、胆固醇和聚合物结合的脂质组合使用，以形成脂质纳米颗粒用于在活体外和活体内递送治疗剂(例如核酸分子，包括核酸模拟物，例如锁核酸（lna)、肽核酸(pna)和吗啉核酸(morpholino))以实现治疗或预防目的，包括疫苗接种。
4.

背景技术：

6.治疗性核酸具有彻底改变疫苗接种、基因疗法、蛋白质替代疗法和其他遗传性疾病治疗方法的潜力。自2000年代开始对治疗性核酸进行首次临床研究以来，核酸分子和其递送方法的设计已取得重大进展。然而，核酸治疗剂仍面临若干挑战，包括低细胞渗透性和对包括rna在内的某些核酸分子降解的高敏感性。因此，仍需要开发新的核酸分子，以及促进核酸分子的活体外或活体内递送以实现治疗和/或预防目的的相关方法和组合物。
5.

技术实现要素：

7.在一个实施方案中，本文提供脂质化合物，包括其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其可单独使用或与其他脂质组分，例如中性脂质、带电脂质、类固醇(包括例如所有固醇)和/或其类似物和/或聚合物结合的脂质和/或聚合物组合使用，以形成用于递送治疗剂(例如核酸分子，包括核酸模拟物，例如锁核酸(lna)、肽核酸(pna)和吗啉核酸)的脂质纳米颗粒。在一些情况下，使用所述脂质纳米颗粒递送核酸，例如反义和/或信使rna。还提供使用此类脂质纳米颗粒治疗各种疾病或疾患，例如由感染物和/或蛋白质不足引起的疾病或疾患的方法。
8.在一个实施方案中，本文提供的脂质化合物是经取代的基于哌啶的脂质化合物。
9.在一个实施方案中，本文提供一种式(i)的化合物：
10.11.或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中g1、g2、g3、g4、g5、l1、l2、l3、l4、r3、n和m如本文或别处所定义。
12.在一个实施方案中，本文提供一种纳米颗粒组合物，其包含本文所提供的化合物以及治疗剂或预防剂。在一个实施方案中，所述治疗剂或预防剂包含至少一种编码抗原或其片段或表位的mrna。
13.所属领域的技术人员在考虑以下对特定实施方案的详细描述之后将对本公开的额外特征显而易知。
6.具体实施方式
14.6.1一般技术
15.本文所描述或引用的技术和程序包括所属领域的技术人员使用常规方法一般很好理解和/或通常采用的技术和程序，如例如sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual(第3版，2001)；current protocols in molecular biology(ausubel等人编，2003)中所描述的广泛使用的方法。
16.6.2术语
17.除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。所有专利、申请、公布的申请和其他出版物均以全文引用的方式并入。如果所阐述的关于术语的任何描述与以引用的方式并入本文中的任何文件相冲突，则以下文阐述的术语描述为准。
18.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸酯，并且一般以难溶于水但可溶于许多非极性有机溶剂中为特征。尽管脂质一般具有弱水溶性，但是某些类别的脂质(例如经极性基团改性的脂质，例如dmg-peg2000)具有有限的水溶性且在某些条件下可溶于水。已知的脂质类型包括生物分子，如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和磷脂。脂质可分为至少三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油，以及蜡；(2)“化合物脂质”，包括磷脂和糖脂(例如dmpe-peg2000)；和(3)“衍生脂质”，如类固醇。此外，如本文所使用，脂质还包括类脂质化合物。术语“类脂质化合物”又简称为“类脂质’；是指脂质样化合物(例如具有脂质样物理性质的两亲性化合物)。
19.术语“脂质纳米颗粒”或“lnp”是指具有至少一个纳米(nm)级尺寸(例如1至1,000nm)的颗粒，其含有一种或多种类型的脂质分子。本文所提供的lnp可进一步含有至少一种非脂质有效负载分子(例如一种或多种核酸分子)。在一些实施方案中，lnp包含部分或完全包封在脂质壳内的非脂质有效负载分子。具体地说，在一些实施方案中，其中有效负载是带负电分子(例如编码病毒蛋白的mrna)，并且lnp的脂质组分包含至少一种阳离子脂质。不受理论束缚，预期阳离子脂质可与带负电的有效负载分子相互作用，并在lnp形成期间促进有效负载并入和/或包封至lnp中。可形成如本文所提供的lnp的一部分的其他脂质包括但不限于中性脂质和带电脂质，如类固醇、聚合物结合的脂质和各种两性离子性脂质。在某些实施方案中，根据本公开的lnp包含如本文所描述的一种或多种式(i)(和其子式)的脂质。
20.术语“阳离子脂质”是指在其环境的任何ph值或氢离子活性下带正电，或能够响应
于其环境(例如其预定用途的环境)的ph值或氢离子活性而带正电的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷源自季氮原子的存在。在某些实施方案中，阳离子脂质包含两性离子性脂质，所述两性离子性脂质在其预定用途的环境中(例如在生理ph值下)带正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质是如本文所描述的一种或多种式(i)(和其子式)的脂质。
21.术语“聚合物结合的脂质”是指既包含脂质部分又包含聚合物部分的分子。聚合物结合的脂质的实例是聚乙二醇化脂质(peg-脂质)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。
22.术语“中性脂质”涵盖在所选ph值下或在所选ph值范围内以不带电形式或以中性两性离子形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选的有用ph值或范围对应于预定脂质用途的环境中的ph条件，如生理ph值。作为非限制性实例，可结合本公开使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)；磷脂酰乙醇胺，如1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、2-((2，3-双(油酰氧基)丙基))二甲基铵基)乙基磷酸氢盐(docp)；鞘磷脂(sm)；神经酰胺；类固醇，如固醇和其衍生物。本文所提供的中性脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(自其分离或改性)。
23.术语“带电脂质”涵盖在所选ph值下或在所选ph值范围内以带正电或带负电形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选ph值或范围对应于预定脂质用途的环境中的ph条件，如生理ph值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基铵-丙烷(例如dotap、dotma)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基固醇(例如dc-chol)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸钠盐(dops-na)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1
′‑
外消旋-甘油)钠盐(dopg-na)和1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐(dopa-na)。本文所提供的带电脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(自其分离或改性)。
24.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的饱和直链或支链烃链基团。在一个实施方案中，烷基具有例如一至二十四个碳原子(c
1-c
24
烷基)、四至二十个碳原子(c
4-c
20
烷基)、六至十六个碳原子(c
6-c
16
烷基)、六至九个碳原子(c
6-c9烷基)、一至十五个碳原子(c
1-c
15
烷基)、一至十二个碳原子(c
1-c
12
烷基)、一至八个碳原子(c
1-c8烷基)或一至六个碳原子(c
1-c6烷基)且其通过单键连接至分子其余部分。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非另有说明，否则烷基任选地经取代。
25.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳双键。所属领域的技术人员应了解，术语“烯基”还包含具有“顺式”和“反式”构型，或者具有“e”和“z”构型的基团。在一个实施方案中，烯基具有例如二至二十四个碳原子(c
2-c
24
烯基)、四至二十个碳原子(c
4-c
20
烯基)、六至十六个碳原子(c
6-c
16
烯基)、六至九个碳原子(c
6-c9烯基)、二至十五个碳原子(c
2-c
15
烯基)、二至十二个碳原子(c
2-c
12
烯基)、二至八个碳原子(c
2-c8烯基)或二至六个碳原子(c
2-c6烯基)且其
通过单键连接至分子其余部分。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1，4-二烯基等。除非另有说明，否则烯基任选地经取代。
26.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有例如二至二十四个碳原子(c
2-c
24
炔基)、四至二十个碳原子(c
4-c
20
炔基)、六至十六个碳原子(c
6-c
16
炔基)、六至九个碳原子(c
6-c9炔基)、二至十五个碳原子(c
2-c
15
炔基)、二至十二个碳原子(c
2-c
12
炔基)、二至八个碳原子(c
2-c8炔基)或二至六个碳原子(c
2-c6炔基)且其通过单键连接至分子其余部分。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非另有说明，否则炔基任选地经取代。
27.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成且为饱和的。在一个实施方案中，亚烷基具有例如一至二十四个碳原子(c
1-c
24
亚烷基)、一至十五个碳原子(c
1-c
15
亚烷基)、一至十二个碳原子(c
1-c
12
亚烷基)、一至八个碳原子(c
1-c8亚烷基)、一至六个碳原子(c
1-c6亚烷基)、二至四个碳原子(c
2-c4亚烷基)、一至二个碳原子(c
1-c2亚烷基)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链经由单键连接至分子其余部分，并且经由单键连接至基团。亚烷基链与分子其余部分和与基团的连接点可经由链内的一个碳或任何两个碳进行。除非另有说明，否则亚烷基链任选地经取代。
28.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚烯基”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成且含有一个或多个碳-碳双键。在一个实施方案中，亚烯基具有例如二至二十四个碳原子(c
2-c
24
亚烯基)、二至十五个碳原子(c
2-c
15
亚烯基)、二至十二个碳原子(c
2-c
12
亚烯基)、二至八个碳原子(c
2-c8亚烯基)、二至六个碳原子(c
2-c6亚烯基)或二至四个碳原子(c
2-c4亚烯基)。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基经由单键或双键连接至分子其余部分，并且经由单键或双键连接至基团。亚烯基与分子其余部分和与基团的连接点可经由链内的一个碳或任何两个碳进行。除非另有说明，否则亚烯基任选地经取代。
29.如本文所使用且除非另有说明，否则术语“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的非芳族饱和单环或多环烃基。环烷基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烷基具有例如3至15个环碳原子(c
3-c
15
环烷基)、3至10个环碳原子(c
3-c
10
环烷基)或3至8个环碳原子(c
3-c8环烷基)。环烷基通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基的实例包括但不限于金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7，7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非另有说明，否则环烷基任选地经取代。
[0030]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚环烷基”是二价环烷基。除非另有说明，否则亚环烷基任选地经取代。
[0031]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“环烯基”是指仅由碳和氢原子组成且包括一个或多个碳-碳双键的非芳族单环或多环烃基。环烯基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烯基具有例如3至15个环碳原子(c
3-c
15
环烯基)、3至10个环碳原子(c
3-c
10
环烯基)或3至8个环碳原子(c
3-c8环烯基)。环烯基通过单键连接至分子其余部分。单环环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。
除非另有说明，否则环烯基任选地经取代。
[0032]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚环烯基”是二价环烯基。除非另有说明，否则亚环烯基任选地经取代。
[0033]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“杂环基”是指含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自氮、氧、磷和硫的杂原子的非芳族基团单环或多环部分。杂环基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基可为单环、双环、三环、四环或其他多环系统，其中多环系统可为稠合、桥连或螺环系统。杂环基多环系统可在一个或多个环中包含一个或多个杂原子。杂环基可为饱和或部分不饱和的。饱和杂环烷基可称为“杂环烷基”。部分不饱和的杂环烷基在杂环基含有至少一个双键时可称为“杂环烯基”，或在杂环基含有至少一个三键时可称为“杂环炔基”。在一个实施方案中，杂环基具有例如3至18个环原子(3至18元杂环基)、4至18个环原子(4至18元杂环基)、5至18个环原子(3至18元杂环基)、4至8个环原子(4至8元杂环基)或5至8个环原子(5至8元杂环基)。当在本文中出现时，数字范围，如“3至18”是指给定范围中的每个整数；例如，“3至18个环原子”意指杂环基可由3个环原子、4个环原子、5个环原子、6个环原子、7个环原子、8个环原子、9个环原子、10个环原子等(至多且包括18个环原子)组成。杂环基的实例包括但不限于咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。除非另有说明，否则杂环基任选地经取代。
[0034]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚杂环基”是二价杂环基。除非另有说明，否则亚杂环基任选地经取代。
[0035]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“芳基”是指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团和/或多环单价芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6至18个环碳原子(c
6-c
18
芳基)、6至14个环碳原子(c
6-c
14
芳基)或6至10个环碳原子(c
6-c
10
芳基)。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯基和联三苯基。术语“芳基”还指双环、三环或其他多环烃环，其中至少一个环是芳族环，并且其他环可为饱和、部分不饱和或芳族环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基或四氢萘基（tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除非另有说明，否则芳基任选地经取代。
[0036]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚芳基”是二价芳基。除非另有说明，否则亚芳基任选地经取代。
[0037]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“杂芳基”是指含有至少一个芳族环的单环芳族基团和/或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自o、s和n的杂原子。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。术语“杂芳基”还指双环、三环或其他多环，其中至少一个环是芳族环，并且其他环可为饱和、部分不饱和或芳族环，其中至少一个芳族环含有一个或多个独立地选自o、s和n的杂原子。单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲哚嗪基、苯并呋喃基、异
苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹噁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括但不限于咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。除非另有说明，否则杂芳基任选地经取代。
[0038]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“亚杂芳基”是二价杂芳基。除非另有说明，否则亚杂芳基任选地经取代。
[0039]
当本文所描述的基团被称为“经取代”时，其可经一个或多个任何适当的取代基取代。取代基的说明性实例包括但不限于在本文所提供的示例性化合物和实施方案中发现的取代基，以及：卤素原子，如f、cl、br或i；氰基；氧代(＝o)；羟基(-oh)；烷基；烯基；炔基；环烷基；芳基；-(c＝o)or’；-o(c＝o)r’；-c(＝o)r’；-or’；-s(o)
x
r’；-s-sr’；-c(＝o)sr’；-sc(＝o)r’；-nr’r’；-nr’c(＝o)r’；-c(＝o)nr’r’；-nr’c(＝o)nr’r’；-oc(＝o)nr’r’；-nr’c(＝o)or’；-nr’s(o)
x
nr’r’；-nr’s(o)
xr′
；和-s(o)
x
nr’r’，其中：r’在每次出现时独立地为h、c
1-c
15
烷基或环烷基，并且x是0、1或2。在一些实施方案中，取代基是c
1-c
12
烷基。在其他实施方案中，取代基是环烷基。在其他实施方案中，取代基是卤基，如氟基。在其他实施方案中，取代基是氧代。在其他实施方案中，取代基是羟基。在其他实施方案中，取代基是烷氧基(-or’)。在其他实施方案中，取代基是羧基。在其他实施方案中，取代基是氨基(-nr’r’)。
[0040]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“任选地选用的”或“任选地”(例如任选地经取代)意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。举例来说，“任选地经取代的烷基”意指烷基可经取代或可不经取代，并且该描述包括经取代的烷基和不具有取代的烷基两者。
[0041]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语生物活性化合物的“前药”是指可在生理条件下或通过溶剂分解而转化为生物活性化合物的化合物。在一个实施方案中，术语“前药”是指生物活性化合物的药学上可接受的代谢前体。当将前药施用于有需要的受试者时，前药可能为无活性的，但在活体内转化为生物活性化合物。前药典型地在活体内迅速转型以产生母体生物活性化合物，例如通过在血液中水解而转型。前药化合物在哺乳动物生物体中通常提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见bundgard，h.，design of prodrugs(1985)，第7-9页，第21-24页(elsevier，amsterdam))。关于前药的论述提供于higuchi，t.等人，a.c.s.symposium series，第14卷；以及bioreversible carriers in drug design，edward b.roche编辑，american pharmaceutical association and pergamon press，1987中。
[0042]
在一个实施方案中，术语“前药”还意图包括任何共价键合的载体，当将此类前药施用于哺乳动物受试者时，其在活体内释放活性化合物。化合物的前药可通过修饰化合物中存在的官能基来制备，其方式是使得修饰可在常规操作中或在活体内裂解而得到母体化合物。前药包括羟基、氨基或巯基键合至任何基团的化合物，当将化合物的前药施用于哺乳动物受试者时，所述基团裂解而分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。
[0043]
前药的实例包括但不限于本文所提供化合物中的醇官能基的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能基的酰胺衍生物。
[0044]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。
[0045]
药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，例如但不限于乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘液酸、萘-1，5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟碱酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
[0046]
药学上可接受的碱加成盐的实例包括但不限于通过将无机碱或有机碱添加至游离酸化合物而制备的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。在一个实施方案中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺；经取代胺，包括天然存在的经取代胺；环胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺树脂等。在一个实施方案中，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
[0047]
本文所提供的化合物可含有一个或多个不对称中心，且因此可产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，所述形式可根据绝对立体化学定义为(r)-或(s)-或对于氨基酸可定义为(d)-或(l)-。除非另有说明，否则本文所提供的化合物意图包括所有此类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性( )与(-)、(r)-与(s)-或(d)-与(l)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如色谱法和分步结晶法拆分。用于制备/分离个别对映异构体的常规技术包括自适合的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱法（hplc)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。当本文所述化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，否则所述化合物意欲包括e和z几何异构体。同样，还意欲包括所有互变异构形式。
[0048]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间中的排列方式不同的异构体。“阻转异构体”是由绕单键的受阻旋转得到的立体异构体。“对映异构体”是一对互为不可重叠的镜像的立体异构体。一对对映异构体的任何比例的混合物可称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。
[0049]“立体异构体”还可包括e和z异构体或其混合物，以及顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物分离为e或z异构体。在其他实施方案中，本文所述的化合物是e和z异构体的混合物。
[0050]“互变异构体”是指化合物的彼此平衡的异构形式。异构形式的浓度将取决于发现化合物的环境，并且可取决于例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而有所不同。
[0051]
还应注意，本文所述的化合物可在一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位
素。举例来说，化合物可用放射性同位素进行放射性标记，如氚(3h)、碘-125(
125
i)、硫-35(
35
s)或碳-14(
14
c)，或者可为同位素富集的，如氘(2h)、碳-13(
13
c)或氮-15(
15
n)。如本文所使用，“同位素体”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集”是指原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。“同位素富集”还可指化合物含有的至少一个原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的量。经放射性标记和同位素富集的化合物可用作治疗剂，例如癌症治疗剂；研究试剂，例如结合分析试剂；和诊断剂，例如活体内成像剂。本文所述化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，皆意欲涵盖在本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供本文所述化合物的同位素体，例如同位素体是氘、碳-13和/或氮-15富集的。如本文所使用，“氘代”是指化合物中的至少一个氢(h)已经氘(以d或2h表示)置换，也就是说，化合物在至少一个位置处富含氘。
[0052]
应注意，如果所描绘的结构与该结构的名称之间存在差异，则应以所描绘的结构为准。
[0053]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于被美国食品与药物管理局批准可接受用于人类或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
[0054]
术语“组合物”意欲涵盖含有任选指定量的指定成分(例如本文所提供的mrna分子)的产品。
[0055]
如本文可互换使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括例如dna和rna。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过dna或rna聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和其类似物。核酸可为单股或双股形式。如本文所使用且除非另有说明，否则“核酸”还包括核酸模拟物，如锁核酸(lna)、肽核酸(pna)和吗啉核酸。如本文所使用，“寡核苷酸”是指短的合成聚核苷酸，其长度一般但未必少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“聚核苷酸”并非互相排斥的。以上关于聚核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文所公开的任何单股聚核苷酸序列的左手端为5
′
端；双股聚核苷酸序列的左手方向称为5
′
方向。新生rna转录物的5
′
至3
′
添加方向称为转录方向；dna股上具有与rna转录物相同的序列且相对于rna转录物的5
′
端而位于5
′
端的序列区域称为“上游序列”；dna股上具有与rna转录物相同的序列且相对于rna转录物的3
′
端而位于3
′
端的序列区域称为“下游序列”。
[0056]“分离的核酸”是指与天然地伴随天然序列的其他基因组dna序列以及蛋白质或复合物(如核糖体和聚合酶)基本上分离的核酸，例如rna、dna或混合核酸。“分离”的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，当通过重组技术制造时，“分离”的核酸分子，如mrna分子，可基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当化学合成时，其可基本上不含化学前体或其他化学品。在特定实施方案中，本文所述的编码抗原的一种或多种核酸分子是分离或纯化的。该术语包括已自其天然存在的环境移除的核酸序列，并且包括重组或克隆的dna或rna分离物以及化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括分子的分离形式。
9594)。已知一些tee在多个物种中是保守的(p
á
nek等人，nucleic acids research，第41卷，第16期，2013年9月1日，第7625-7634页)。
[0063]
如本文所使用，术语“茎-环序列”是指具有至少两个区域的单股聚核苷酸序列，当以相反方向阅读时，所述两个区域彼此互补或基本上互补，并且因此能够彼此碱基配对形成至少一个双螺旋和未配对的环。所得到的结构称为茎-环结构、发夹或发夹环，它是在许多rna分子中发现的二级结构。
[0064]
如本文所使用，术语“肽”是指含有二至五十(2-50)个经一个或多个共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。
[0065]
术语“多肽”与“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有超过五十(50)个由共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于针对蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如抗原)。
[0066]
术语“抗原”是指能够被受试者的免疫系统(包括适应性免疫系统)识别的物质，并且在受试者与抗原接触之后能够触发免疫反应(包括抗原特异性免疫反应)。在某些实施方案中，抗原是与患病细胞，如感染病原体的细胞或赘生性细胞相关的蛋白质(例如肿瘤相关抗原(taa))。
[0067]
在肽或多肽的情况下，如本文所使用，术语“片段”是指包含少于全长的氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可例如来自于氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列中残基的内部缺失。片段可例如由选择性rna剪接或由活体内蛋白酶活性产生。在某些实施方案中，片段是指包括含多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在特定实施方案中，多肽的片段保留所述多肽的至少1种、至少2种、至少3种或更多种功能。
[0068]“表位”是抗原分子表面上与单个抗体分子结合的位点，如抗原表面上能够结合至抗体的一个或多个抗原结合区的局部区域，并且其在动物体内，如在哺乳动物体内(例如人体内)具有抗原或免疫原性活性，能够引起免疫反应。具有免疫原性活性的表位是多肽的在动物体内引起抗体反应的部分。具有抗原活性的表位是多肽的通过此项技术中熟知的任何方法，包括例如通过免疫分析确定的抗体所结合的部分。抗原性表位未必具有免疫原性。表位通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。抗体表位可为线性表位或构象表位。线性表位是由蛋白质中的连续氨基酸序列形成的。构象表位是由在蛋白质序列中不连续但在蛋白质折叠成其三维结构
时结合在一起的氨基酸形成的。当蛋白质的三维结构呈改变的构象时，如在另一种蛋白质或配体活化或结合之后，形成诱导性表位。在某些实施方案中，表位是多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，表位是多肽的线性特征。一般来说，抗原具有若干或许多不同的表位，并且可与许多不同的抗体反应。
[0069]
如本文所使用，术语“基因疫苗”是指包含至少一种核酸分子的治疗性或预防性组合物，所述至少一种核酸分子编码与目标疾病(例如感染性疾病或赘生性疾病)相关的抗原。向受试者施用疫苗(“疫苗接种”)允许产生编码的肽或蛋白质，由此在受试者体内引起针对目标疾病的免疫反应。在某些实施方案中，免疫反应包括适应性免疫反应，如产生针对编码的抗原的抗体，和/或能够特异性消除表达所述抗原的患病细胞的免疫细胞的活化和增殖。在某些实施方案中，免疫反应进一步包括先天免疫反应。根据本公开，疫苗可在目标疾病的临床症状发作之前或之后施用于受试者。在一些实施方案中，对健康或无症状受试者进行疫苗接种使经疫苗接种的受试者对目标疾病的发展具有免疫性或不太敏感。在一些实施方案中，对显示疾病症状的受试者进行疫苗接种改善经疫苗接种的受试者的疾病状况或治疗所述疾病。
[0070]
术语“先天免疫反应”和“先天免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出病原体相关分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活动，包括经由各种路径的细胞因子产生和细胞死亡。如本文所使用，先天免疫反应包括但不限于炎症细胞因子的产生(例如i型干扰素或il-10产生)增加；nfκb路径的活化；免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活增加，以及在一些情况下细胞凋亡的诱导。先天免疫的活化可使用此项技术中已知的方法检测，如测量(nf)-κb活化情况。
[0071]
术语“适应性免疫反应”和“适应性免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出特定抗原时启动的抗原特异性防御机制，包括体液反应和细胞介导的反应。如本文所使用，适应性免疫反应包括由疫苗组合物，如本文所述的遗传组合物触发和/或增强的细胞反应。在一些实施方案中，疫苗组合物包含作为抗原特异性适应性免疫反应的靶标的抗原。在其他实施方案中，疫苗组合物在施用后允许在经免疫的受试者中产生抗原，所述抗原是抗原特异性适应性免疫反应的靶标。适应性免疫反应的活化可使用此项技术中已知的方法检测，如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性水平。
[0072]
术语“抗体”意欲包括在免疫球蛋白类多肽范围内的b细胞的多肽产物，其能够与特定分子抗原结合并由两对相同的多肽链构成，其中每一对具有一条重链(约50-70kda)和一条轻链(约25kda)，每条链的每个氨基末端部分包括含约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如antibody engineering(borrebaeck编，第2版，1995)；和kuby，immunology(第3版，1997)。在特定实施方案中，特定分子抗原可由本文所提供的抗体结合，包括多肽、其片段或表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体、内抗体、抗独特型(抗id)抗体和以上任一种的功能片段，功能片段是指抗体重链或轻链多肽的保留作为所述片段来源的抗体的部分或全部结合活性的一部分。功能片段的非限制性实例包括单链fv(scfv)(例如包括单特异性、双特异性等)、fab片段、f(ab
′
)片段、f(ab)2片段、f(ab
′
)2片段、二硫键连接的fv(dsfv)、fd片段、fv片段、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和微型抗体。具体地说，本文所提供的抗体包括免
疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有抗原结合位点的分子(例如抗体的一个或多个cdr)。此类抗体片段可见于例如harlow和lane，antibodies：a laboratory manual(1989)；mol.biology and biotechnology：a comprehensive desk reference(myers编，1995)；huston等人，1993，cell biophysics 22：189-224；pl
ü
ickthun和skerra，1989，meth.enzymol.178：497-515；和day，advanced immunochemistry(第2版，1990)。本文所提供的抗体可为免疫球蛋白分子的任何类别(例如igg、ige、igm、igd和iga)或任何亚类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。
[0073]
术语“施用(administer/administration)”是指将存在于体外的物质(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)注射或以其他方式物理递送至患者体肉的操作，如经粘膜、真皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所描述或此项技术中已知的任何其他物理递送方法递送。当治疗疾病、病症、疾患或其症状时，典型地在所述疾病、病症、疾患或其症状发作之后进行物质的施用。当预防疾病、病症、疾患或其症状时，典型地在所述疾病、病症、疾患或其症状发作之前进行物质的施用。
[0074]“长期”施用与急性模式相对，是指以连续模式施用一或多种剂(例如持续一段时间，如数天、数周、数月或数年)，由此在较长一段时间内维持初始治疗效果(活性)。“间歇性”施用是指治疗不是不间断地连续进行，而是本质上周期性的。
[0075]
如本文所使用，术语“靶向递送”或动词形式“靶向”是指相较于递送至任何其他器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非目标位置)，促进所递送的剂(如本文所述的脂质纳米颗粒组合物中的治疗有效负载分子)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为目标位置)的过程。靶向递送可使用此项技术中已知的方法检测，例如通过在全身施用后将所递送的剂在目标细胞群体中的浓度与所递送的剂在非目标细胞群体处的浓度相比较来检测。在某些实施方案中，靶向递送使得目标位置处的浓度为非目标位置处的浓度的至少2倍高。
[0076]“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率；消除症状和/或潜在原因；防止症状和/或其潜在原因的发生；和/或改善或补救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染和赘瘤形成引起或与之相关的损害的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。
[0077]
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指足以减少和/或改善给定疾病、病症或疾患，和/或其相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，如癌症)的严重程度和/或持续时间的剂(例如疫苗组合物)的量。本公开的物质/分子/剂(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)的“治疗有效量”可根据诸多因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子/剂在个体体内引起所希望反应的能力。治疗有效量包含物质/分子/剂的治疗有益作用胜过其任何有毒或有害作用的量。在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病、病症或疾患的如本文所述的脂质纳米颗粒组合物或其中所含治疗剂或预防剂(例如治疗性mrna)的量。
[0078]“预防有效量”是当施用于受试者时将具有预期预防作用，例如预防疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，如癌症)、延迟其发作(或复发)或降低其发作(或复发)可能性的药物组合物的量。典型地但非必须地，由于预防剂量是在疾病、病症或疾患之前或其早期阶段用于受试者，因此预防有效量可能小于治疗有效量。完全的治疗或预防作用未必通过施用一次剂量而发生，而可能仅在
施用一系列剂量后才发生。因此，治疗或预防有效量可分一或多次施用来施用。
[0079]
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，如癌症)发作(或复发)的可能性。
[0080]
术语“管理(manage/managing/management)”是指受试者自疗法(例如预防剂或治疗剂)获得的有益作用，其不会引起疾病的治愈。在某些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如预防剂或治疗剂，如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)以“管理”感染性或赘生性疾病、其一种或多种症状，由此预防疾病的进展或恶化。
[0081]
术语“预防剂”是指可以完全或部分地抑制受试者的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的任何剂。
[0082]
术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或减轻疾病、病症或疾患，包括用于治疗、预防或减轻疾病、病症或疾患和/或其相关症状的一种或多种症状的任何剂。
[0083]
术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或剂。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies/therapy)”是指所属领域的技术人员，如医务人员已知可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。
[0084]
如本文所使用，“预防有效血清效价”是受试者(例如人类)体内完全或部分地抑制受试者的疾病、病症或疾患，和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的抗体的血清效价。
[0085]
在某些实施方案中，“治疗有效血清效价”是受试者(例如人类)体内降低受试者的与疾病、病症或疾患相关的严重程度、持续时间和/或症状的抗体的血清效价。
[0086]
术语“血清效价”是指一名受试者中来自多个样品(例如在多个时间点)或在至少10名、至少20名、至少40名至多达约100名、1000名或更多受试者的群体中的平均血清效价。
[0087]
术语“副作用”涵盖疗法(例如预防剂或治疗剂)的不想要和/或不良作用。不想要的作用未必为不良的。疗法(例如预防剂或治疗剂)的不良作用可能为有害的、令人不适的或有风险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘鸣、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉影响、疲劳、口干、食欲不振、施用部位出现皮疹或肿胀、如发烧、发冷和疲劳之类的类似流感的症状、消化道问题和过敏反应。患者经历的其他不期望的作用众多且为此项技术中所知的。有许多作用描述于physician’s desk reference(第68版，2014)中。
[0088]
术语“受试者”与“患者”可互换使用。如本文所使用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人类)。在特定实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是患有感染性疾病或赘生性疾病的哺乳动物(例如人类)。在另一个实施方案中，受试者是有发展感染性疾病或赘生性疾病的风险的哺乳动物(例如人类)。
[0089]
术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语包括但不限于经由活性提供可检测信号的任何荧光团、发色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等。
[0090]
术语“可检测剂”是指可用于确定样品或受试者中所希望分子，如由本文所述的mrna分子编码的抗原的存在(existence/presence)的物质。可检测剂可为能够被目测的物
质或者能够以其他方式测定和/或测量(例如通过定量)的物质。
[0091]“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
[0092]
如本文所使用且除非另有说明，否则术语“约”或“大约”意指所属领域的普通技术人员所测定的特定值的可接受的误差，其部分取决于测量或测定所述值的方式。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差以内。在某些实施方案中，术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.05％以内或更低。
[0093]
除非上下文另外明确指出，否则本文所使用的单数形式术语“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数个（种)参考物。
[0094]
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、寄存编号和其他参考文献皆以全文引用的方式并入本文中，其引用程度就如同特定且单独地指示每一个别出版物或专利申请以引用的方式并入一般。本文所论述的出版物仅仅提供在本技术的申请日之前的公开内容。本文中任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。
[0095]
已经描述本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，实验部分和实施例中的描述旨在说明而非限制权利要求书中所描述的发明范围。
[0096]
6.3脂质化合物
[0097]
在一个实施方案中，本文提供一种式(i)的化合物：
[0098][0099]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
[0100]
g1和g2各自独立地为键、c
2-c
12
亚烷基或c
2-c
12
亚烯基；
[0101]
l1是-oc(＝o)r1、-c(＝o)or1、-oc(＝o)or1、-c(＝o)r1、-or1、-s(o)
x
r1、-s-sr1、-c(＝o)sr1、-sc(＝o)r1、-nrac(＝o)r1、-c(＝o)nrbrc、-nrac(＝o)nrbrc、-oc(＝o)nrbrc、-nrac(＝o)or1、-sc(＝s)r1、-c(＝s)sr1、-c(＝s)r1、-ch(oh)r1、-p(＝o)(orb)(orc)、-(c
6-c
10
亚芳基)-r1、-(6至10元亚杂芳基)-r1或r1；
[0102]
l2是-oc(＝o)r2、-c(＝o)or2、-oc(＝o)or2、-c(＝o)r2、-or2、-s(o)
x
r2、-s-sr2、-c(＝o)sr2、-sc(＝o)r2、-nrdc(＝o)r2、-c(＝o)nrerf、-nrdc(＝o)nrerf、-oc(＝o)nrerf、-nrdc(＝o)or2、-sc(＝s)r2、-c(＝s)sr2、-c(＝s)r2、-ch(oh)r2、-p(＝o)(ore)(orf)、-(c
6-c
10
亚芳基)-r2、-(6至10元亚杂芳基)-r2或r2；
[0103]
r1和r2各自独立地为c
6-c
24
烷基或c
6-c
24
烯基；
[0104]
ra、rb、rd和re各自独立地为h、c
1-c
12
烷基或c
2-c
12
烯基；
[0105]
rc和rf各自独立地为c
1-c
12
烷基或c
2-c
12
烯基；
[0106]
g3和g4各自独立地为c
1-c
12
亚烷基；
[0107]
l3和l4各自独立地为-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)
x-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nr
b-、-nrac(＝o)nr
b-、-oc(＝o)nr
b-、-nrac(＝o)o-、-sc(＝s)-、-c(＝s)s-、-c(＝s)-、-ch(oh)-、-p(＝o)(orb)o-、-(c
6-c
10
亚芳基)-或-(6至10元亚杂芳基)-；
[0108]
g5是c
2-c
24
亚烷基、c
2-c
24
亚烯基、c
3-c8亚环烷基或c
3-c8亚环烯基；
[0109]
r3是-n(r4)r5或-or6；
[0110]
r4是氢、c
1-c
12
烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烯基或c
6-c
10
芳基；
[0111]
r5是c
1-c12烷基；
[0112]
或r4和r5连同其所连接的氮一起形成环状部分；
[0113]
r6是氢、c
1-c
12
烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烯基或c
6-c
10
芳基；
[0114]
x是0、1或2；
[0115]
n是1、2或3；
[0116]
m是1、2或3；并且
[0117]
其中每个烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
[0118]
在一个实施方案中，n是1。在一个实施方案中，n是2。在一个实施方案中，n是3。在一个实施方案中，m是1。在一个实施方案中，m是2。在一个实施方案中，m是3。在一个实施方案中，n是1，并且m是1。在一个实施方案中，n是1，并且m是2。在一个实施方案中，n是1，并且m是3。在一个实施方案中，n是2，并且m是2。在一个实施方案中，n是2，并且m是3。在一个实施方案中，n是3，并且m是3。
[0119]
在一个实施方案中，所述化合物为式(ii)的化合物：
[0120][0121]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0122]
在一个实施方案中，g5是c
2-c
24
亚烷基。在一个实施方案中，g5是c
2-c
12
亚烷基。在一个实施方案中，g5是c
2-c8亚烷基。在一个实施方案中，g5是c
2-c6亚烷基。在一个实施方案中，g5是c
2-c4亚烷基。在一个实施方案中，g5是c2亚烷基。在一个实施方案中，g5是c3亚烷基。在一个实施方案中，g5是c4亚烷基。在一个实施方案中，g5是c5亚烷基。在一个实施方案中，g5是c6亚烷基。
[0123]
在一个实施方案中，g5是c
2-c
24
亚烯基。在一个实施方案中，g5是c
2-c
12
亚烯基。在一个实施方案中，g5是c
2-c8亚烯基。在一个实施方案中，g5是c
2-c6亚烯基。在一个实施方案中，g5是c
2-c4亚烯基。
[0124]
在一个实施方案中，g5是c
3-c8亚环烷基。在一个实施方案中，g5是c
5-c6亚环烷基。
[0125]
在一个实施方案中，g5是c
3-c8亚环烯基。在一个实施方案中，g5是c
5-c6亚环烯基。
[0126]
在一个实施方案中，g5未经取代。在一个实施方案中，g5经一个或多个氧代或c
1-c6烷基取代。在一个实施方案中，g5经氧代取代。在一个实施方案中，g5经c
1-c6烷基取代。在一个实施方案中，g5经甲基取代。
[0127]
在一个实施方案中，所述化合物为式(iii)的化合物：
[0128][0129]
其中s是2至24的整数，
[0130]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0131]
在一个实施方案中，s是2至12的整数。在一个实施方案中，s是2至8的整数。在一个实施方案中，s是2至6的整数。在一个实施方案中，s是2至4的整数。在一个实施方案中，s是2。在一个实施方案中，s是3。在一个实施方案中，s是4。在一个实施方案中，s是5。在一个实施方案中，s是6。
[0132]
在一个实施方案中，所述化合物为式(iv)的化合物：
[0133][0134]
其中t是1至23的整数，
[0135]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0136]
在一个实施方案中，t是2至12的整数。在一个实施方案中，t是2至8的整数。在一个实施方案中，t是2至6的整数。在一个实施方案中，t是2至4的整数。在一个实施方案中，t是2。在一个实施方案中，t是3。在一个实施方案中，t是4。在一个实施方案中，t是5。在一个实施方案中，t是6。
[0137]
在一个实施方案中，g3和g4各自独立地为c
1-c6亚烷基。在一个实施方案中，g3和g4各自独立地为c
1-c3亚烷基。在一个实施方案中，g3和g4各自独立地为c1或c2亚烷基。在一个实施方案中，g3和g4各自独立地为-ch
2-或-ch
2-ch
2-。在一个实施方案中，g3和g4均为-ch
2-。在一个实施方案中，g3和g4均为-ch
2-ch
2-。
[0138]
在一个实施方案中，l3和l4各自独立地为-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-o-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-或-c(＝o)nr
b-。在一个实施方案中，l3和l4各自独立地为-o-、-oc(＝o)-或-c(＝o)o-。
[0139]
在一个实施方案中，l3是-o-。在一个实施方案中，l3是-oc(＝o)-。在一个实施方案中，l3是-c(＝o)o-。
[0140]
在一个实施方案中，l4是-o-。在一个实施方案中，l4是-oc(＝o)-。在一个实施方案中，l4是-c(＝o)o-。
[0141]
在一个实施方案中，l3和l4均为-oc(＝o)-。在一个实施方案中，l3和l4均为-c(＝o)o-。在一个实施方案中，l3和l4均为-o-。在一个实施方案中，l3和l4中的一个为-o-，并且l3和l4中的另一个为-oc(＝o)-。在一个实施方案中，l3和l4中的一个为-o-，并且l3和l4中的另一个为-c(＝o)o-。
[0142]
如本文所描述且除非另有说明，否则l3左侧上的连接点是连至g3，并且l3右侧上的
连接点是连至g1。举例来说，当l3是-oc(＝o)-时，其是指g
3-oc(＝o)-g1。类似地，如本文所描述且除非另有说明，否则l4左侧上的连接点是连至g4，并且l4右侧上的连接点是连至g2。
[0143]
在一个实施方案中，所述化合物为式(v)的化合物：
[0144][0145]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0146]
在一个实施方案中，所述化合物为式(vi)的化合物：
[0147][0148]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0149]
在一个实施方案中，所述化合物为式(vii)的化合物：
[0150][0151]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0152]
在一个实施方案中，r3是-n(r4)r5。
[0153]
在一个实施方案中，r4是氢。在一个实施方案中，r4是c
1-c
12
烷基。在一个实施方案中，r4是c
1-c8烷基。在一个实施方案中，r4是c
1-c6烷基。在一个实施方案中，r4是c
1-c4烷基。在一个实施方案中，r4是甲基。在一个实施方案中，r4是乙基。在一个实施方案中，r4是正丙基。在一个实施方案中，r4是异丙基。在一个实施方案中，r4是正丁基。在一个实施方案中，r4是正戊基。在一个实施方案中，r4是正己基。在一个实施方案中，r4是正辛基。在一个实施方案中，r4是正壬基。
[0154]
在一个实施方案中，r4是c
3-c8环烷基。在一个实施方案中，r4是环丙基。在一个实
施方案中，r4是环丁基。在一个实施方案中，r4是环戊基。在一个实施方案中，r4是环己基。在一个实施方案中，r4是环庚基。在一个实施方案中，r4是环辛基。
[0155]
在一个实施方案中，r4是c
3-c8环烯基。在一个实施方案中，r4是环丙烯基。在一个实施方案中，r4是环丁烯基。在一个实施方案中，r4是环戊烯基。在一个实施方案中，r4是环己烯基。在一个实施方案中，r4是环庚烯基。在一个实施方案中，r4是环辛烯基。
[0156]
在一个实施方案中，r4是c
6-c
10
芳基。在一个实施方案中，r4是苯基。
[0157]
在一个实施方案中，r4未经取代。
[0158]
在一个实施方案中，r4经一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：氧代、-org、-nrgc(＝o)rh、-c(＝o)nrgrh、-c(＝o)rh、-oc(＝o)rh、-c(＝o)orh和-o-r
i-oh，其中：
[0159]
rg在每次出现时独立地为h或c
1-c6烷基；
[0160]
rh在每次出现时独立地为c
1-c6烷基；并且
[0161]ri
在每次出现时独立地为c
1-c6亚烷基。
[0162]
在一个实施方案中，r4经一个或多个羟基取代。在一个实施方案中，r4经一个羟基取代。
[0163]
在一个实施方案中，r5是c
1-c
12
烷基。在一个实施方案中，r5是c
1-c8烷基。在一个实施方案中，r5是c
1-c6烷基。在一个实施方案中，r5是c
1-c4烷基。在一个实施方案中，r5是甲基。在一个实施方案中，r5是乙基。在一个实施方案中，r5是正丙基。在一个实施方案中，r5是异丙基。在一个实施方案中，r5是正丁基。在一个实施方案中，r5是正戊基。在一个实施方案中，r5是正己基。在一个实施方案中，r5是正辛基。在一个实施方案中，r5是正壬基。
[0164]
在一个实施方案中，r5未经取代。
[0165]
在一个实施方案中，r5经一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：氧代、-org、-nrgc(＝o)rh、-c(＝o)nrgrh、-c(＝o)rh、-oc(＝o)rh、-c(＝o)orh、-o-r
i-oh和-n(r
10
)r
11
，其中：
[0166]
rg在每次出现时独立地为h或c
1-c6烷基；
[0167]
rh在每次出现时独立地为c
1-c6烷基；并且
[0168]ri
在每次出现时独立地为c
1-c6亚烷基；
[0169]r10
是氢或c
1-c6烷基；
[0170]r11
是c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基或c
3-c8环烯基；
[0171]
或r
10
和r
11
连同其所连接的氮一起形成环状部分；
[0172]
并且r
11
或环状部分任选地经羟基、氧代、-nh2、-nh(c
1-c6烷基)或-n(c
1-c6烷基)2中的一个或多个取代。
[0173]
在一个实施方案中，r5经一个或多个羟基或-n(r
10
)r
11
取代。
[0174]
在一个实施方案中，r5经一个或多个羟基取代。在一个实施方案中，r5经一个羟基取代。
[0175]
在一个实施方案中，r5经一个或多个-n(r
10
)r
11
取代。在一个实施方案中，r5经一个-n(r
10
)r
11
取代。
[0176]
在一个实施方案中，r
10
是氢。
[0177]
在一个实施方案中，r
11
是c
3-c8环烯基。在一个实施方案中，r
11
是环丁烯基。在一个实施方案中，r
11
经氧代、-nh2、-nh(c
1-c6烷基)或-n(c
1-c6烷基)2中的一个或多个取代。
[0178]
在一个实施方案中，r
10
和r
11
连同其所连接的氮一起形成环状部分。在一个实施方案中，环状部分是5至10元杂芳基。在一个实施方案中，环状部分是嘧啶-1-基。在一个实施方案中，环状部分是嘌呤-9-基。在一个实施方案中，环状部分经氧代、-nh2、-nh(c
1-c6烷基)或-n(c
1-c6烷基)2中的一个或多个取代。
[0179]
在一个实施方案中，r5经取代。
[0180]
在一个实施方案中，r4和r5连同其所连接的氮一起形成环状部分。
[0181]
在一个实施方案中，环状部分(由r4和r5连同其所连接的氮一起形成)是杂环基。在一个实施方案中，环状部分是杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是4至8元杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是4元杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是5元杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是6元杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是7元杂环烷基。在一个实施方案中，环状部分是8元杂环烷基。
[0182]
在一个实施方案中，环状部分(由r4和r5连同其所连接的氮一起形成)是氮杂环丁烷-1-基。在一个实施方案中，环状部分是吡咯烷-1-基。在一个实施方案中，环状部分是哌啶-1-基。在一个实施方案中，环状部分是氮杂环庚烷-1-基。在一个实施方案中，环状部分是氮杂环辛烷-1-基。在一个实施方案中，环状部分是吗啉基。在一个实施方案中，环状部分是哌嗪-1-基。
[0183]
在一个实施方案中，环状部分(由r4和r5连同其所连接的氮一起形成)未经取代。
[0184]
在一个实施方案中，环状部分(由r4和r5连同其所连接的氮一起形成)经一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：氧代、-org、-nrgc(＝o)rh、-c(＝o)nrgrh、-c(＝o)rh、-oc(＝o)rh、-c(＝o)orh和-o-r
i-oh，其中：
[0185]
rg在每次出现时独立地为h或c
1-c6烷基；
[0186]
rh在每次出现时独立地为c
1-c6烷基；并且
[0187]ri
在每次出现时独立地为c
1-c6亚烷基。
[0188]
在一个实施方案中，环状部分(由r4和r5连同其所连接的氮一起形成)是4-乙酰基哌嗪-1-基。
[0189]
在一个实施方案中，r3是-or6。
[0190]
在一个实施方案中，r6是氢。在一个实施方案中，r6是c
1-c
12
烷基。在一个实施方案中，r6是c
1-c8烷基。在一个实施方案中，r6是c
1-c6烷基。在一个实施方案中，r6是c
1-c4烷基。在一个实施方案中，r6是甲基。在一个实施方案中，r6是乙基。在一个实施方案中，r6是c
3-c8环烷基。在一个实施方案中，r6是c
3-c8环烯基。在一个实施方案中，r6是c
6-c
10
芳基。在一个实施方案中，r6是苯基。
[0191]
在一个实施方案中，g1是键。在一个实施方案中，g1是c
2-c
12
亚烷基。在一个实施方案中，g1是c
4-c8亚烷基。在一个实施方案中，g1是c
5-c7亚烷基。在一个实施方案中，g1是c5亚烷基。在一个实施方案中，g1是c7亚烷基。在一个实施方案中，g1是c
2-c
12
亚烯基。在一个实施方案中，g1是c
4-c8亚烯基。在一个实施方案中，g1是c
5-c7亚烯基。在一个实施方案中，g1是c5亚烯基。在一个实施方案中，g1是c7亚烯基。
[0192]
在一个实施方案中，g2是键。在一个实施方案中，g2是c
2-c
12
亚烷基。在一个实施方案中，g2是c
4-c8亚烷基。在一个实施方案中，g2是c
5-c7亚烷基。在一个实施方案中，g2是c5亚烷基。在一个实施方案中，g2是c7亚烷基。在一个实施方案中，g2是c
2-c
12
亚烯基。在一个实施方案中，g2是c
4-c8亚烯基。在一个实施方案中，g2是c
5-c7亚烯基。在一个实施方案中，g2是c5亚烯基。在一个实施方案中，g2是c7亚烯基。
[0193]
在一个实施方案中，g1和g2各自独立地为键或c
2-c
12
亚烷基(例如c
4-c8亚烷基，例如c
5-c7亚烷基，例如c5亚烷基或c7亚烷基)。在一个实施方案中，g1和g2均为键。在一个实施方案中，g1和g2中的一个为键，并且另一个为c
2-c
12
亚烷基(例如c
4-c8亚烷基，例如c
5-c7亚烷基，例如c5亚烷基或c7亚烷基)。在一个实施方案中，g1和g2各自独立地为c
2-c
12
亚烷基(例如c
4-c8亚烷基，例如c
5-c7亚烷基，例如c5亚烷基或c7亚烷基)。在一个实施方案中，g1和g2各自独立地为键、c5亚烷基或c7亚烷基。
[0194]
在一个实施方案中，l1是r1。
[0195]
在一个实施方案中，l1是-oc(＝o)r1、-c(＝o)or1、-oc(＝o)or1、-c(＝o)r1、-or1、-s(o)
x
r1、-s-sr1、-c(＝o)sr1、-sc(＝o)r1、-nrac(＝o)r1、-c(＝o)nrbrc、-nrac(＝o)nrbrc、-oc(＝o)nrbrc、-nrac(＝o)or1、-sc(＝s)r1、-c(＝s)sr1、-c(＝s)r1、-ch(oh)r1或-p(＝o)(orb)(orc)。在一个实施方案中，l1是-oc(＝o)r1、-c(＝o)or1、-c(＝o)sr1、-sc(＝o)r1、-nrac(＝o)r1或-c(＝o)nrbrc。在一个实施方案中，l1是-oc(＝o)r1、-c(＝o)or1、-nrac(＝o)r1或-c(＝o)nrbrc。在一个实施方案中，l1是-oc(＝o)r1。在一个实施方案中，l1是-c(＝o)or1。在一个实施方案中，l1是-nrac(＝o)r1。在一个实施方案中，l1是-c(＝o)nrbrc。
[0196]
在一个实施方案中，l2是r2。
[0197]
在一个实施方案中，l2是-oc(＝o)r2、-c(＝o)or2、-oc(＝o)or2、-c(＝o)r2、-or2、-s(o)
x
r2、-s-sr2、-c(＝o)sr2、-sc(＝o)r2、-nrdc(＝o)r2、-c(＝o)nrerf、-nrdc(＝o)nrerf、-oc(＝o)nrerf、-nrdc(＝o)or2、-sc(＝s)r2、-c(＝s)sr2、-c(＝s)r2、-ch(oh)r2或-p(＝o)(ore)(orf)。在一个实施方案中，l2是-oc(＝o)r2、-c(＝o)or2、-c(＝o)sr2、-sc(＝o)r2、-nrdc(＝o)r2或-c(＝o)nrerf。在一个实施方案中，l2是-oc(＝o)r2、-c(＝o)or2、-nrdc(＝o)r2或-c(＝o)nrerf。在一个实施方案中，l2是-oc(＝o)r2。在一个实施方案中，l2是-c(＝o)or2。在一个实施方案中，l2是-nrdc(＝o)r2。在一个实施方案中，l2是-c(＝o)nrerf。
[0198]
在一个实施方案中，g1是键，并且l1是r1。在一个实施方案中，g1是c
2-c
12
亚烷基，并且l1是-c(＝o)or1。
[0199]
在一个实施方案中，g2是键，并且l2是r2。在一个实施方案中，g2是c
2-c
12
亚烷基，并且l2是-c(＝o)or2。
[0200]
在一个实施方案中，所述化合物为式(viii)的化合物：
[0201][0202]
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
[0203]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
6-c
24
烷基、支链c
6-c
24
烷基或直链c
6-c
24
烯基。
[0204]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
6-c
18
烷基、-r
7-ch(r8)(r9)或c
6-c
18
烯基，其中r7是c
0-c5亚烷基，并且r8和r9独立地为c
2-c
10
烷基。
[0205]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
7-c
15
烷基或-r
7-ch(r8)(r9)，其中r7是c
0-c1亚烷基，并且r8和r9独立地为c
4-c8烷基。
[0206]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
6-c
24
烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
7-c
15
烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c7烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c9烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
11
烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
13
烷基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
15
烷基。
[0207]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为支链c
6-c
24
烷基或支链c
6-c
24
烯基。
[0208]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为-r
7-ch(r8)(r9)，其中r7是c
1-c5亚烷基，并且r8和r9独立地为c
2-c
10
烷基或c
2-c
10
烯基。
[0209]
在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
6-c
24
烯基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
6-c
18
烯基。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为直链c
17
烯基。
[0210]
在一个实施方案中，r1或r2或两者独立地具有以下结构之一：
[0211][0212]
在一个实施方案中，ra和rd各自独立地为h。
[0213]
在一个实施方案中，rb、rc、re和rf各自独立地为正己基或正辛基。
[0214]
在一个实施方案中，-n(r4)r5具有以下结构之一：
[0215][0216]
在一个实施方案中，所述化合物是表1中的化合物或其药学上可接受的盐、前药或
立体异构体。
[0217]
表1.
[0218][0219]
[0220]
[0221]
[0222][0223]
[0224]
应理解，如上所示的本文所提供的化合物的任何实施方案，以及如上所示的本文所提供的化合物的任何特定取代基和/或变量可独立地与化合物的其他实施方案和/或取代基和/或变量组合以形成以上未具体阐述的实施方案。另外，在列出任何特定基团或变量的取代基和/或变量的清单的情况下，应理解，可自特定实施方案和/或权利要求中删除每一个别取代基和/或变量，并且其余的取代基和/或变量清单将被认为在本文所提供的实施方案的范围内。
[0225]
应理解，在本说明书中，所描绘各式的取代基和/或变量的组合只有在此类贡献产生稳定化合物时才为容许的。
[0226]
6.4纳米颗粒组合物
[0227]
在一个方面中，本文描述包含本文所述的脂质化合物的纳米颗粒组合物。在特定实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含如本文所描述的根据式(i)(和其子式)的化合物。
[0228]
在一些实施方案中，当例如通过动态光散射(dls)、透射电子显微镜检查、扫描电子显微镜检查或另一种方法测量时，本文提供的纳米颗粒组合物的最大尺寸是1μm或更短(例如≤1μm、＜900nm、≤800nm、＜700nm、≤600nm、＜500nm、＜400nm、≤300nm、≤200nm、≤175nm、≤150nm、≤125nm、≤100nm、≤75nm、≤50nm或更短)。在一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒具有在约40nm至约200nm范围内的至少一个尺寸。在一个实施方案中，所述至少一个尺寸在约40nm至约100nm范围内。
[0229]
可结合本公开使用的纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒(lnp)、纳米脂蛋白颗粒、脂质体、脂质囊泡和脂质复合物(lipoplex)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是包括一个或多个脂质双层的囊泡。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括经水性隔室隔开的两个或更多个同心双层。脂质双层可经官能化和/或彼此交联。脂质双层可包括一种或多种配体、蛋白质或通道。
[0230]
纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。特征还可取决于纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。
[0231]
纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微镜检查(例如透射电子显微镜检查或扫描电子显微镜检查)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒度。还可使用仪器，例如zetasizer nano zs(malvem instruments ltd，malvem，worcestershire，uk)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度、多分散指数和ζ电位。
[0232]
dh(大小)：纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说，平均大小可为约40nm至约150nm，例如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在某些实施方案
中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大小可为约80nm。在其他实施方案中，平均大小可为约100nm。
[0233]
pdi：纳米颗粒组合物可为相对均质的。可使用多分散指数来指示纳米颗粒组合物的均质性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。较小(例如小于0.3)的多分散指数一般指示较窄的粒度分布。纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0至约0.25，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0.10至约0.20。
[0234]
包封效率：治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率合意地较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如rna)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少90％。
[0235]
表观pka：纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正电荷或负电荷的纳米颗粒组合物一般是合意的，因为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其他成分发生不合意的相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约-10mv至约 20mv、约-10mv至约 15mv、约-10mv至约 10mv、约-10mv至约 5mv、约-10mv至约0mv、约-10mv至约-5mv、约-5mv至约 20mv、约-5mv至约 15mv、约-5mv至约 10mv、约-5mv至约 5mv、约-5mv至约0mv、约0mv至约 20mv、约0mv至约 15mv、约0mv至约 10mv、约0mv至约 5mv、约 5mv至约 20mv、约 5mv至约 15mv或约 5mv至约 10mv。
[0236]
在另一个实施方案中，自复制型rna可配制于脂质体中。作为非限制性实例，自复制型rna可如以全文引用的方式并入本文中的国际公布第wo20120067378号中所述而配制于脂质体中。在一个方面中，脂质体可包含pka值有利于递送mrna的脂质。在另一个方面中，脂质体可在生理ph值下具有基本上呈中性的表面电荷且因此可有效用于免疫(参见例如以全文引用的方式并入本文中的国际公布第wo20120067378号中所述的脂质体)。
[0237]
在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含脂质组分，所述脂质组分包括至少一种脂质，例如本文所述的根据式(i)(和其子式)之一的化合物。举例来说，在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包括一种本文所提供的化合物。纳米颗粒组合物还可包含一种或多种如下所述的其他脂质或非脂质组分。
[0238]
6.4.1阳离子/可电离脂质
[0239]
如本文所述，在一些实施方案中，本文所提供的纳米颗粒组合物除包含根据式(i)(和其子式)的脂质以外，还包含一种或多种带电或可电离的脂质。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物的某些带电或两性离子脂质组分类似于细胞膜中的脂质组分，由此可改善纳米颗粒的细胞摄取。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性带电或可电离的脂质包
括但不限于3-(双十二烷基氨基)-n1，n1，4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(kl10)、n1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-n1，n4，n4-三(十二烷基)-1，4-哌嗪二乙胺(kl22)、14,25-双十三烷基-15，18,21,24-四氮杂-三十八烷(kl25)、1，2-二亚油基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧杂环戊烷(dlin-k-dma)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基酯(dlin-mc3-dma)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷(dlin-kc2-dma)、1，2-二油基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dodma)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-n，n-二甲基-3-[(9z，12z)-十八碳-9，12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-clindma)、(2r)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-n，n-二甲基-3-[(9z，12z)-十八碳-9，12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-clindma(2r))、(2s)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-n，n-二甲基-3-[(9z-，12z)-十八碳-9，12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-clindma(2s))、（12z，15z)-n，n-二甲基-2-壬基二十一碳-12，15-二烯-1-胺、n，n-二甲基-1-{(1s，2r)-2-辛基环丙基}十七烷-8-胺。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外示例性带电或可电离的脂质包括在sabnis等人，“a novel amino lipid series for mrna delivery：improved endosomal escape and sustained pharmacology and safety in non-human primates”，molecular therapy，第26卷，第6期，2018年中所述的脂质(例如脂质5)，所述文献全部以引用的方式并入本文中。
[0240]
在一些实施方案中，适合阳离子脂质包括氯化n-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-n，n，n-三甲基铵(dotma)；氯化n-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-n，n，n-三甲基铵(dotap)；1，2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(doepc)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dlepc)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)；1，2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1)；n1-[2-((1s)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3，4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(mvl5)；双十八烷基酰胺基-甘氨酰基精四胺(dogs)；3b-[n-(n
′
，n
′‑
二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(dc-chol)；溴化双十八烷基二甲基铵(ddab)；saint-2，n-甲基-4-(二油基)甲基吡啶鎓；溴化1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵(dmrie)；溴化1，2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基铵(dorie)；氯化1，2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵(dori)；二烷基化氨基酸(dila2)(例如c18：1-norarg-c16)；氯化二油基二甲基铵(dodac)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(poepc)；1，2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(moepc)；二油酸(r)-5-(二甲基氨基)戊烷-1，2-二基酯盐酸盐(dodapen-cl)；二油酸(r)-5-胍基戊烷-1，2-二基酯盐酸盐(dopen-g)；和氯化(r)-n，n，n-三甲基-4，5-双(油酰基氧基)戊-1-胺鎓盐(dotapen)。具有在生理ph值下带电荷的头基的阳离子脂质也是适合的，如伯胺(例如dodag n
′
，n
′‑
双十八烷基-n-4，8-二氮杂-10-氨基癸酰基甘氨酸酰胺)和胍鎓头基(例如双-胍鎓-精三胺-胆固醇(bgsc)、双-胍鎓-tren-胆固醇(bgtc)、pona和二油酸(r)-5-胍基戊烷-1，2-二基酯盐酸盐(dopen-g))。另一适合的阳离子脂质是二油酸(r)-5-(二甲基氨基)戊烷-1，2-二基酯盐酸盐(dodapen-cl)。在某些实施方案中，阳离子脂质是特定对映异构体或外消旋形式，并且包括上述阳离子脂质的各种盐形式(例如氯化物或硫酸盐)。举例来说，在一些实施方案中，阳离子脂质是氯化n-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-n，n，n-三甲基铵(dotap-cl)或硫酸n-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-n，n，n-三甲基铵(dotap-硫酸盐)。在一些实施
方案中，阳离子脂质是可电离阳离子脂质，例如溴化双十八烷基二甲基铵(ddab)；1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)；2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷(dlin-kc2-dma)；4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基酯(dlin-mc3-dma)；1，2-二油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dodap)；1，2-二油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dodma)；和n-吗啉基胆固醇(mo-chol)。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包括两种或更多种阳离子脂质(例如两种或更多种上述阳离子脂质)的组合。
[0241]
另外，在一些实施方案中，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的带电或可电离的脂质是包括环状胺基的脂质。适用于本文所公开的制剂和方法的额外阳离子脂质包括wo2015199952、wo2016176330和wo2015011633中所述的那些阳离子脂质，各案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。
[0242]
6.4.2聚合物结合的脂质
[0243]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种聚合物结合的脂质，例如聚乙二醇化脂质(peg脂质)。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物中的聚合物结合的脂质组分可改善胶体稳定性和/或减少纳米颗粒的蛋白质吸收。可结合本公开使用的示例性阳离子脂质包括但不限于peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的磷脂酸、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二酰基甘油、peg改性的二烷基甘油和其混合物。举例来说，peg脂质可为peg-c-domg、peg-dmg、peg-dlpe、peg-dmpe、peg-dppc、peg-dspe、神经酰胺-peg2000或chol-peg2000。
[0244]
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。举例来说，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(peg-dag)，例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰基甘油(peg-dmg)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)；peg琥珀酸酯二酰基甘油(peg-s-dag)，例如4-o-(2’，3
’‑
二(十四烷酰氧基)丙基-1-o-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(peg-s-dmg)；聚乙二醇化神经酰胺(peg-cer)；或peg二烷氧基丙基氨基甲酸酯，例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-n-(2，3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2，3-二(十四烷氧基)丙基-n-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
[0245]
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以在1.0摩尔％至2.5摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.7摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。
[0246]
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35∶1至约25∶1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100∶1至约20∶1范围内。
[0247]
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
[0248][0249]
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
[0250]r12
和r
13
各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地间杂有一个或多个酯键；并且
[0251]
w具有在30至60范围内的平均值。
[0252]
在一个实施方案中，r
12
和r
13
各自独立地为含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其他实施方案中，平均w在42至55范围内，例如平均w是42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些特定实施方案中，平均w是约49。
[0253]
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
[0254][0255]
其中平均w是约49。
[0256]
6.4.3结构脂质
[0257]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种结构脂质。不受理论束缚，预期结构脂质可使纳米颗粒的两亲结构，例如但不限于纳米颗粒的脂质双层结构稳定。可结合本公开使用的示例性结构脂质包括但不限于胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、西红柿苷、熊果酸、α-生育酚和其混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(例如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。
[0258]
在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在一个实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇是以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇是以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。
[0259]
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5∶1至1∶1范围内。在一个实施方案中，类固醇以在32摩尔％至40摩尔％类固醇范围内的浓度存在。
[0260]
6.4.4磷脂
[0261]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种磷脂，例如一种或多种(多)不饱和脂质。不受理论束缚，预期磷脂可组装成一个或多个脂质双层结构。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的示例性磷脂包括但不限于1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油磷酸胆碱(dmpc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 diether pc)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16 lyso pc)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0 pe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷
酸乙醇胺、1，2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(dopg)和鞘磷脂。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含dspc。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含dope。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含dspc和dope两者。
[0262]
另外的示例性中性脂质包括例如二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(sope)和1，2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式dope)。在一个实施方案中，中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱(dspc)。在一个实施方案中，中性脂质选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm。
[0263]
在一个实施方案中，中性脂质是磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酸(pa)或磷脂酰甘油(pg)。
[0264]
可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外磷脂还包括wo2017/112865中所描述的那些磷脂，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。
[0265]
6.4.5治疗性有效负载
[0266]
根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可进一步包含一种或多种治疗剂和/或预防剂。这些治疗剂和/或预防剂在本公开中有时称为“治疗性有效负载”或“有效负载”。在一些实施方案中，治疗性有效负载可在活体内或活体外，使用纳米颗粒作为递送媒介物施用。
[0267]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含以下作为治疗性有效负载：小分子化合物(例如小分子药物)，例如抗癌剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博来霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨喋呤(methotrexate)和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素d(actinomycin d)、长春新碱、长春花碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracyclines)、烷基化剂、铂类化合物、抗代谢物和核苷类似物，例如甲氨喋呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局麻药(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素性阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼屈嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多塞平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺剂(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯非安明(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、萘替芬(naftifine)和两性霉素b（amphotericin b))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经传递质拮抗剂、抗青光眼剂、维生素、麻醉剂和成像剂。
[0268]
在一些实施方案中，治疗性有效负载包含细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫反应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括可能对细胞有害的任何剂。实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素b(cytochalasin b)、短杆菌肽d(gramicidin d)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素(puromycin)、美登素类化合物(maytansinoids)，例如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(cc-1065)以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。
[0269]
在其他实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于治疗剂和/或预防剂，例如抗代谢物(例如甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(dacarbazine))、烷基化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(cc-1065)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(bsnu)、洛莫司汀(lomustine)（ccnu)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环霉素(例如道诺霉素(先前称为柔红霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素d(dactinomycin)(先前称为放线菌素))、博来霉素、米拉霉素和安曲霉素(anthramycin)(amc))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春花碱、紫杉醇和美登素类化合物)。
[0270]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含诸如肽和多肽之类生物分子作为治疗性有效负载。形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的生物分子可为天然来源或合成的。举例来说，在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素（epo)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、因子vir、促黄体激素释放激素(lhrh)类似物、干扰素、肝素、b型肝炎表面抗原、伤寒疫苗、霍乱疫苗以及肽和多肽。
[0271]
6.4.5.1核酸
[0272]
在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子(例如dna或rna分子)作为治疗性有效负载。可包括在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的核酸分子的例示性形式包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)，包括信使mrna(mrna)、其杂交体、rnai诱导剂、rnai剂、sirna、shrna、mirna、反义rna、核糖酶、催化性dna、诱导形成三螺旋的rna、适体、载体等。在某些实施方案中，治疗性有效负载包含rna。可包括在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的rna分子包括但不限于短聚体(shortmer)、agomir、antagomir、反义体(antisense)、核糖酶、小干扰rna(sirna)、不对称干扰rna（airna)、微小rna(mirna)、dicer-底物rna(dsrna)、小发夹rna(shrna)、转移rna(trna)、信使rna(mrna)和此项技术中已知的rna分子的其他形式。在特定实施方案中，rna是mrna。
[0273]
在其他实施方案中，纳米颗粒组合物包含sirna分子作为治疗性有效负载。具体地
说，在一些实施方案中，sirna分子能够选择性干扰并下调感兴趣基因的表达。举例来说，在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用包含sirna的纳米颗粒组合物后，sirna有效负载使与特定疾病、病症或疾患相关的基因选择性沉默。在一些实施方案中，sirna分子包含与编码感兴趣蛋白质产物的mrna序列互补的序列。在一些实施方案中，sirna分子是免疫调节性sirna。
[0274]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含shrna分子或编码shrna分子的载体作为治疗性有效负载。具体地说，在一些实施方案中，治疗性有效负载在施用于目标细胞后，在目标细胞内产生shrna。与shrna相关的构建体和机制是相关技术中熟知的。
[0275]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含mrna分子作为治疗性有效负载。具体地说，在一些实施方案中，所述mrna分子编码感兴趣多肽，包括任何天然或非天然存在或以其他方式修饰的多肽。由mrna编码的多肽可具有任何大小且可具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mrna有效负载编码的多肽当在细胞中表达时可具有治疗作用。
[0276]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含mrna分子。在特定实施方案中，所述核酸分子包含至少一个编码感兴趣肽或多肽的编码区(例如开放阅读框(orf))。在一些实施方案中，核酸分子还包含至少一个非转译区(utr)。在特定实施方案中，非转译区(utr)位于编码区的上游(5
′
端)，并且在本文中称为5
′‑
utr。在特定实施方案中，非转译区(utr)位于编码区的下游(3
′
端)，并且在本文中称为3
′‑
utr。在特定实施方案中，核酸分子同时包含5
′‑
utr和3
′‑
utr。在一些实施方案中，5
′‑
utr包含5
′‑
帽结构。在一些实施方案中，核酸分子包含kozak序列(例如在5
′‑
utr中)。在一些实施方案中，核酸分子包含poly-a区(例如在3
′‑
utr中)。在一些实施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸化信号(例如在3
′‑
utr中)。在一些实施方案中，核酸分子包含稳定区(例如在3
′‑
utr中)。在一些实施方案中，核酸分子包含二级结构。在一些实施方案中，二级结构是茎-环。在一些实施方案中，核酸分子包含茎-环序列(例如在5
′‑
utr和/或3
′‑
utr中)。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个能够在剪接过程中切除的内含子区。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5
′‑
utr和编码区的区域。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自编码区和3
′‑
utr的区域。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5
′‑
utr、编码区和3
’‑
utr的区域。
[0277]
编码区
[0278]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个编码区。在一些实施方案中，编码区是编码单一肽或蛋白质的开放阅读框(orf)。在一些实施方案中，编码区包含至少两个orf，每个orf编码一种肽或蛋白质。在编码区包含多于一个orf的实施方案中，编码的肽和/或蛋白质可彼此相同或不同。在一些实施方案中，编码区中的多个orf经非编码序列隔开。在特定实施方案中，隔开两个orf的非编码序列包含内部核糖体进入位点(ires)。
[0279]
不受理论束缚，预期内部核糖体进入位点(ires)可用作唯一的核糖体结合位点，或充当mrna的多个核糖体结合位点之一。包含多于一个功能性核糖体结合位点的mrna分子可编码若干肽或多肽，所述肽或多肽独立地由核糖体转译(例如多顺反子mrna)。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含一个或多个内部核糖体进入位点(ires)。可以与本公开结合使用的ires序列的实例包括但不限于来自小rna病毒(例如fmdv)、害虫病毒(cffv)、脊髓灰质炎病毒(pv)、脑心肌炎病毒(ecmv)、口蹄疫病毒(fmdv)、c型肝炎病毒(hcv)、猪瘟病毒(csfv)、鼠白血病病毒(mlv)、猴免疫缺陷病毒(siv)或蟋蟀麻
痹病毒(crpv)的那些ires序列。
[0280]
在各个实施方案中，本公开的核酸分子编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种肽或蛋白质。核酸分子编码的肽和蛋白质可相同或不同。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码二肽(例如肌肽和鹅肌肽)。在一些实施方案中，核酸分子编码三肽。在一些实施方案中，核酸分子编码四肽。在一些实施方案中，核酸分子编码五肽。在一些实施方案中，核酸分子编码六肽。在一些实施方案中，核酸分子编码七肽。在一些实施方案中，核酸分子编码八肽。在一些实施方案中，核酸分子编码九肽。在一些实施方案中，核酸分子编码十肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约15个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约50个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约100个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约150个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约300个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约500个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约1000个氨基酸的肽或多肽。
[0281]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子的长度为至少约30个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约35nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约40nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约45nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约50nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约55nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约60nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约65nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约70nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约75nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约80nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约85nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约90nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约95nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约120nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约140nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约160nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约180nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约250nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1200nt在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4000nt。在一些实施方案中，核酸分
子的长度为至少约4500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约5000nt。
[0282]
在特定实施方案中，治疗性有效负载包含如本文所述的疫苗组合物(例如基因疫苗)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含能够引发针对一种或多种目标疾患或疾病的免疫的化合物。在一些实施方案中，目标疾患与病原体感染相关或由病原体感染引起，所述病原体例如为冠状病毒(例如2019-ncov)、流感病毒、麻疹病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、狂犬病病毒、脑膜炎病毒、百日咳病毒、破伤风病毒、鼠疫病毒、肝炎病毒和结核病病毒。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含编码病原体特有的致病性蛋白质或其抗原片段或表位的核酸序列(例如mrna)。疫苗在施用于经疫苗接种的受试者后，允许表达编码的致病性蛋白质(或其抗原片段或表位)，由此在受试者体内引发针对病原体的免疫。
[0283]
在一些实施方案中，目标疾患与细胞的赘生性生长相关或由细胞的赘生性生长引起(例如癌症)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含编码癌症特有的肿瘤相关抗原(taa)或其抗原片段或表位的核酸序列(例如mrna)。疫苗在施用于经疫苗接种的受试者后，允许表达所编码的taa(或其抗原片段或表位)，由此在受试者体内引发针对表达taa的赘生性细胞的免疫。
[0284]5’‑
帽结构
[0285]
不受理论束缚，预期聚核苷酸的5
′‑
帽结构参与核输出并增加聚核苷酸稳定性，并且结合mrna帽结合蛋白（cbp)，cbp负责细胞中的聚核苷酸稳定性，并且经由cbp与poly-a结合蛋白缔合形成成熟环状mrna物质来引起转译能力。5
′‑
帽结构进一步有助于mrna剪接期间5
′‑
近端内含子的移除。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含5
′‑
帽结构。
[0286]
核酸分子可在5
′
端经细胞内源性转录机构戴帽，由此在聚核苷酸的末端鸟苷帽残基与5
′
末端转录的有义核苷酸之间产生5
′‑
ppp-5
′‑
三磷酸键联。接着，此5
′‑
鸟苷酸帽可经甲基化以产生n7-甲基-鸟苷酸残基。聚核苷酸5
′
端的末端和/或末端前(anteterminal)转录的核苷酸的核糖也可任选地经2
′‑
o-甲基化。经由鸟苷酸帽结构水解和裂解进行的5
′‑
脱帽可靶向核酸分子，例如mrna分子以进行降解。
[0287]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含对由内源过程产生的天然5
′‑
帽结构的一个或多个改变。不受理论束缚，对5
′‑
帽的修饰可增加聚核苷酸的稳定性，增加聚核苷酸的半衰期，并且可增加聚核苷酸的转译效率。
[0288]
对天然5
′‑
帽结构的示例性改变包括产生不可水解的帽结构，以防止脱帽，并由此增加聚核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，因为帽结构水解需要裂解5
′‑
ppp-5
′
磷酸二酯键联，所以在一些实施方案中，可在戴帽反应期间使用经修饰的核苷酸。举例来说，在一些实施方案中，可根据制造商的说明书，将来自new england biolabs(ipswich，mass.)的牛痘病毒戴帽酶(vaccinia capping enzyme)用于α-硫代鸟苷核苷酸以在5
′‑
ppp-5
′
帽中产生硫代磷酸酯键联。可使用额外经修饰的鸟苷核苷酸，例如α-甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。
[0289]
对于天然5
′‑
帽结构的额外示例性改变还包括在戴帽的鸟苷三磷酸(gtp)的2
′
位和/或3
′
位的修饰、糖环氧(产生碳环的氧)替代为亚甲基部分(ch2)、在帽结构的三磷酸桥部分处的修饰或在核碱基(g)部分处的修饰。
[0290]
对于天然5
′‑
帽结构的额外示例性改变包括但不限于聚核苷酸5
′‑
末端和/或5
′‑
末端前核苷酸的核糖在糖2
′‑
羟基上的2
′‑
o-甲基化(如上所述)。可使用多个不同的5
′‑
帽结构产生聚核苷酸(例如mrna分子)的5
′‑
帽。可与本公开结合使用的额外示例性5
′‑
帽结构
进一步包括国际专利公布第wo2008127688号、第wo 2008016473号和第wo 2011015347号中描述的那些5
′‑
帽结构，各案的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0291]
在各个实施方案中，5
′‑
末端帽可包括帽类似物。帽类似物在本文中又称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物、或者结构或功能性帽类似物，其化学结构不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5
′‑
帽，同时保留帽功能。帽类似物可按化学方式（即，非酶方式)或酶方式合成和/或连接至聚核苷酸。
[0292]
举例来说，抗反向帽类似物(arca)帽含有经5
′‑5′‑
三磷酸酯基团连接的两个鸟苷，其中一个鸟苷含有n7-甲基以及3
′‑
o-甲基(即，n7，3
′‑
o-二甲基-鸟苷-5
′‑
三磷酸-5
′‑
鸟苷，即m7g-3
′
mppp-g，其可等效地称为3
′
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g)。另一个未改变的鸟苷的3
′‑
o原子与戴帽聚核苷酸(例如mrna)的5
′‑
末端核苷酸连接。n7-和3
′‑
o-甲基化的鸟苷提供戴帽聚核苷酸(例如mrna)的末端部分。另一个示例性的帽结构为mcap，其类似于arca，但在鸟苷上具有2
′‑
o-甲基(即，n7，2
′‑
o-二甲基-鸟苷-5
′‑
三磷酸-5
′‑
鸟苷，即m7gm-ppp-g)。
[0293]
在一些实施方案中，帽类似物可为二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可在不同磷酸酯位置处用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基(phophoroselenoate)进行修饰，如美国专利第8,519,110号中所描述的二核苷酸帽类似物，该案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。
[0294]
在一些实施方案中，帽类似物可为此项技术中已知和/或本文所描述的n7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。n7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括n7-(4-氯苯氧基乙基)-g(5
′
)ppp(5
′
)g和n7-(4-氯苯氧基乙基)-m3
′‑
og(5
′
)ppp(5
′
)g帽类似物(参见例如kore等人，bioorganic&medicinal chemistry 2013 21：4570-4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；该文献的全部内容以引用的方式并入本文中)。在其他实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
[0295]
在各个实施方案中，帽类似物可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括但不限于肌苷、n1-甲基-鸟苷、2
′‑
氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
[0296]
不受理论束缚，预期尽管帽类似物允许在活体外转录反应中同时进行聚核苷酸的戴帽，但高达20％的转录物仍未戴帽。此情况以及帽类似物与细胞内源转录机构产生的聚核苷酸的天然5
′‑
帽结构的结构差异可能导致转译能力减弱和细胞稳定性降低。
[0297]
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子还可使用酶在转录后戴帽，以便产生更真实(authentic)的5
′‑
帽结构。如本文所使用，短语“更真实”是指一种特征在结构上或功能上密切反映或模仿内源或野生型特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实”的特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在一个或多个方面胜过相应内源性、野生型、天然或生理特征。可与本公开的核酸分子结合使用的更真实的5
′‑
帽结构的非限制性实例为相较于此项技术中已知的合成5
′‑
帽结构(或相较于野生型、天然或生理性5
′‑
帽结构)，尤其具有增强的与帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5
′‑
核酸内切酶的敏感性和/或减少的5
′‑
脱帽的结构。举例来说，在一些实施方案中，重组牛痘病毒戴帽酶和重组2
′‑
o-甲基转移酶可在聚核苷酸的5
′‑
末端核苷酸与鸟
苷帽核苷酸之间产生经典的5
′‑5′‑
三磷酸酯键联其中帽鸟苷含有n7-甲基化，并且聚核苷酸的5
′‑
末端核苷酸含有2
′‑
o-甲基。这种结构称为帽1结构。与例如此项技术中已知的其他5
′
帽类似物结构相比，这种帽引起更高的转译能力、细胞稳定性和减少的细胞促炎性细胞因子的活化。其他示例性帽结构包括7mg(5’)ppp(5’)n，pn2p(帽0)、7mg(5’)ppp(5’)nlmpnp(帽1)、7mg(5’)-ppp(5’)nlmpn2mp(帽2)和m(7)gpppm(3)(6，6，2’)apm(2’)apm(2’)cpm(2)(3，2’)up(帽4)。
[0298]
不受理论束缚，预期本公开的核酸分子可在转录后戴帽，并且由于这种方法较为高效，因此几乎100％的核酸分子可经戴帽。
[0299]
非转译区(utr)
[0300]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含一个或多个非转译区(utr)。在一些实施方案中，utr位于核酸分子中编码区的上游，并被称为5
′‑
utr。在一些实施方案中，utr位于核酸分子中编码区的下游，并被称为3
′‑
utr。utr的序列可与核酸分子中所发现的编码区的序列同源或异源。多个utr可包括在核酸分子中，并且可具有相同或不同的序列和/或基因起源。根据本公开，核酸分子中utr的任何部分(包括没有任何部分)可经密码子优化，并且任何部分可在密码子优化之前和/或之后独立地含有一个或多个不同的结构或化学修饰。
[0301]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含相对于彼此为同源的utr和编码区。在其他实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含相对于彼此为异源的utr和编码区。在一些实施方案中，为了监测utr序列的活性，可在活体外(例如细胞或组织培养物)或在活体内(例如向受试者)施用包含utr和可检测探针的编码序列的核酸分子，并且可使用此项技术中已知的方法测量utr序列的作用(例如调节表达水平、编码产物的细胞定位或编码产物的半衰期)。
[0302]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)的utr包含至少一个转译强化子元件(tee)，所述tee起到增加由所述核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，tee位于核酸分子的5
′‑
utr中。在其他实施方案中，tee位于核酸分子的3
′‑
utr处。在其他实施方案中，至少两个tee分别位于核酸分子的5
′‑
utr和3
′‑
utr处。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)可包含一个或多个拷贝的tee序列或包含多于一个不同的tee序列。在一些实施方案中，存在于本公开的核酸分子中的不同tee序列可相对于彼此为同源的或异源的。
[0303]
各种tee序列是此项技术中已知的，并且可与本公开结合使用。举例来说，在一些实施方案中，tee可为内部核糖体进入位点(ires)、hcv-ires或ires元件。chappell等人，proc.natl.acad.sci.usa 101：9590-9594，2004；zhou等人，proc.natl.acad.sci.102：6273-6278，2005。可与本公开结合使用的额外内部核糖体进入位点(ires)包括但不限于美国专利第7,468,275号、美国专利公布第2007/0048776号和美国专利公布第2011/0124100号，以及国际专利公布第wo2007/025008号和国际专利公布第wo2001/055369号中所述的ires，各案的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，tee可为wellensiek等人，genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements，nature methods，2013年8月；10(8)：747-750的补充表1和补充表2中所述的tee；每篇文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
[0304]
可与本公开结合使用的额外示例性tee包括但不限于美国专利第6,310,197号、美国专利第6,849,405号、美国专利第7,456,273号、美国专利第7,183,395号、美国专利公布第2009/0226470号、美国专利公布第2013/0177581号、美国专利公布第2007/0048776号、美国专利公布第2011/0124100号、美国专利公布第2009/0093049号、国际专利公布第wo2009/075886号、国际专利公布第wo2012/009644号和国际专利公布第wo1999/024595号、国际专利公布第wo2007/025008号、国际专利公布第wo2001/055371号、欧洲专利第2610341号、欧洲专利第2610340号中所述的tee序列，各案的内容以全文引用的方式并入本文中。
[0305]
在各种实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含至少一个utr，其包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或超过60个tee序列。在一些实施方案中，核酸分子utr中的tee序列是相同tee序列的拷贝。在其他实施方案中，核酸分子utr中的至少两个tee序列具有不同的tee序列。在一些实施方案中，多个不同的tee序列以一种或多种重复模式布置于核酸分子的utr区中。仅出于说明的目的，重复模式可为例如ababab、aabbaabbaabb、abcabcabc等，其中在这些示例性模式中，每个大写字母(a、b或c)代表不同的tee序列。在一些实施方案中，在核酸分子的utr中，至少两个tee序列彼此为连续的(即，其间无间隔子序列)。在其他实施方案中，至少两个tee序列通过间隔子序列隔开。在一些实施方案中，utr可包含tee序列-间隔子序列模块，所述模块在utr中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或更多次。在本段中描述的任何实施方案中，utr可为核酸分子的5
′‑
utr、3
′‑
utr或5
′‑
utr和3
′‑
utr两者。
[0306]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)的utr包含至少一个转译抑制元件，所述元件起到减少由所述核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，核酸分子的utr包含经一个或多个微小rna识别的一个或多个mir序列或其片段(例如mir种子序列（seed sequence))。在一些实施方案中，核酸分子的utr包含下调核酸分子的转译活性的一个或多个茎-环结构。用于抑制与核酸分子相关的转译活性的其他机制是此项技术中已知的。在本段中描述的任何实施方案中，utr可为核酸分子的5
′‑
utr、3
′‑
utr或5
′‑
utr和3
′‑
utr两者。
[0307]
聚腺苷酸化(poly-a)区
[0308]
在天然rna加工过程中，通常将长链腺苷核苷酸(poly-a区)添加至信使rna(mrna)分子中以增加分子的稳定性。转录后，立即将转录物的3
′‑
端裂解以释放3
′‑
羟基。接着，poly-a聚合酶将一连串腺苷核苷酸添加至rna中。该过程称为聚腺苷酸化，添加一个长度在100与250个残基之间的poly-a区。不受理论束缚，预期poly-a区可赋予本公开的核酸分子多个优点。
[0309]
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含一个或多个聚腺苷酸化(poly-a)区。在一些实施方案中，poly-a区完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性类似物构成。在一些实施方案中，核酸分子在其3
′
端包含至少一个poly-a区。在一些实施方案中，核酸分子在其5
′
端包含至少一个poly-a区。在一些实施方案中，核酸分子在其5
′
端包含至少一个poly-a区且在
其3
′
端包含至少一个poly-a区。
[0310]
根据本公开，在不同实施方案中，poly-a区可具有不同长度。具体地说，在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少35个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少45个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少50个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少55个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少60个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少65个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少70个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少75个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少80个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少85个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少90个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少95个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少110个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少120个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少130个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少140个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少150个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少160个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少170个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少180个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少190个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少225个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少275个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少350个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少450个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少1000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少1100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少1200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少1300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-a区的长度为至少1400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸
accessibility.nat cell biol.，2010年10月；12(10)：1014-20，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。
[0318]
因此，在一些实施方案中，本文所述的核酸分子(例如mrna)或其一部分可呈茎-环结构，例如但不限于组蛋白茎-环。在一些实施方案中，茎-环结构由长度为约25个或约26个核苷酸的茎-环序列形成，例如但不限于国际专利公布第wo2013/103659号中所述的结构，该案内容以全文引用的方式并入本文中。茎-环序列的额外实例包括国际专利公布第wo2012/019780号和国际专利公布第wo201502667号中所述的序列，各案内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的tee。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的mir序列。在特定实施方案中，茎-环序列可包括mir-122种子序列。在特定实施方案中，核酸分子包含茎-环序列caaaggctcttttcagagccacca(seq id no：1)。在其他实施方案中，核酸分子包含茎-环序列caaaggcucuuuucagagccacca (seq id no：2)。
[0319]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含位于核酸分子中编码区上游(在5
′
端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子5
′‑
utr内。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mrna)包含位于核酸分子中编码区下游(在3
′
端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子3
′‑
utr内。在一些情况下，核酸分子可含有多于一个茎-环序列。在一些实施方案中，核酸分子在5
′‑
utr中包含至少一个茎-环序列且在3
′‑
utr中包含至少一个茎-环序列。
[0320]
在一些实施方案中，包含茎-环结构的核酸分子进一步包含稳定区。在一些实施方案中，稳定区包含至少一个链终止核苷，其起到减慢降解并由此增加核酸分子的半衰期的作用。可与本公开的核酸分子结合使用的示例性链终止核苷包括但不限于3
′‑
脱氧腺苷(虫草素)；3
′‑
脱氧尿苷；3
′‑
脱氧胞嘧啶；3
′‑
脱氧鸟苷；3
′‑
脱氧胸腺嘧啶；2’，3
’‑
双脱氧核苷，例如2’，3
’‑
双脱氧腺苷、2’，3
’‑
双脱氧尿苷、2’，3
’‑
双脱氧胞嘧啶、2’，3
’‑
双脱氧鸟苷、2’，3
’‑
双脱氧胸腺嘧啶；2
′‑
脱氧核苷；或o-甲基核苷；3
′‑
脱氧核苷；2’，3
’‑
双脱氧核苷；3
′‑
o-甲基核苷；3
′‑
o-乙基核苷；3
′‑
阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知和/或本文所描述的其他替代性核苷。在其他实施方案中，茎-环结构可通过改变聚核苷酸的3
′‑
区域来稳定，所述改变可防止和/或抑制寡聚(u)的添加(国际专利公布第wo2013/103659号，其以全文引用的方式并入本文中)。
[0321]
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号。包含至少一个茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号的聚核苷酸序列的非限制性实例包括国际专利公布第wo2013/120497号、国际专利公布第wo2013/120629号、国际专利公布第wo2013/120500号、国际专利公布第wo2013/120627号、国际专利公布第wo2013/120498号、国际专利公布第wo2013/120626号、国际专利公布第wo2013/120499号和国际专利公布第wo2013/120628号中所述的序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。
[0322]
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码病原体抗原或其片段，例如国际专利公布第wo2013/120499号和国际专利公布第wo2013/120628号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。
[0323]
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码治疗性蛋白质，例如国际专利公布第wo2013/120497号和国际专利公布第wo2013/
120629号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。
[0324]
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码肿瘤抗原或其片段，例如国际专利公布第wo2013/120500号和国际专利公布第wo2013/120627号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。
[0325]
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-a区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码致敏性抗原或自体免疫性自体抗原，例如国际专利公布第wo2013/120498号和国际专利公布第wo2013/120626号中所述的聚核苷酸序列，各案内容以全文引用的方式并入本文中。
[0326]
功能性核苷酸类似物
[0327]
在一些实施方案中，本文所述的有效负载核酸分子仅含有选自a(腺苷)、g(鸟苷)、c(胞嘧啶)、u(尿苷)和t(胸苷)的经典核苷酸。不受理论束缚，预期某些功能性核苷酸类似物可赋予核酸分子有用的特性。在本公开的上下文中，此类有用特性的实例包括但不限于核酸分子的稳定性增加、核酸分子在诱导先天免疫反应中的免疫原性降低、由核酸分子编码的蛋白质的产量增加、核酸分子的细胞内递送和/或保留增加，和/或核酸分子的细胞毒性降低等。
[0328]
因此，在一些实施方案中，有效负载核酸分子包含至少一种如本文所述的功能性核苷酸类似物。在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有至少一个针对核碱基、糖基和/或磷酸酯基的化学修饰。因此，包含至少一种功能性核苷酸类似物的有效负载核酸分子含有至少一个针对核碱基、糖基和/或核苷间键联的化学修饰。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的示例性化学修饰。
[0329]
如本文所述，有效负载核酸分子中所有核苷酸的0％至100％范围的核苷酸可以为如本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中的所有核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5
′‑
末端、3
′‑
末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
[0330]
如本文所述，有效负载核酸分子中一种类型的所有核苷酸(例如作为一种类型的所有含嘌呤核苷酸、或作为一种类型的所有含嘧啶核苷酸、或作为一种类型的所有a、g、c、t或u)中范围自0％至100％的核苷酸可为本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中一种类型的核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、
约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5
′‑
末端、3
′‑
末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
[0331]
核碱基的修饰
[0332]
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典核碱基。在一些实施方案中，核苷酸中的经典核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)可经修饰或置换以提供所述核苷酸的一种或多种功能性类似物。核碱基的示例性修饰包括但不限于一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤基、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环、氧化和/或还原。
[0333]
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶(s2u)、4-硫代-尿嘧啶(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶(例如5-碘尿嘧啶或5-溴尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m3u)、5-甲氧基尿嘧啶(mo5u)、尿嘧啶5-氧乙酸(cmo5u)、尿嘧啶5-氧乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5u)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶(mcm5s2u)、5-氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(nm5s2u)、5-甲基氨基甲基尿嘧啶(mnm5u)、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(mnm5s2u)、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿嘧啶(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基尿嘧啶(ncm5u)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm5u)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm55s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5u，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(et1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(d)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m5d)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m5u)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(m5s2u)、5，2
’‑
o-二甲基-尿苷(m5um)、2-硫代-2
’‑
o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷（cmnm5um)、3，2
’‑
o-二甲基-尿苷(m3um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2
’‑
o-甲基-尿苷
(inm5um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨甲酰基羟甲基)-尿嘧啶、5-氨甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(1-e-丙烯基氨基)]尿嘧啶。
[0334]
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3c)、n4-乙酰基胞嘧啶(ac4c)、5-甲酰基胞嘧啶(f5c)、n4-甲基-胞嘧啶(m4c)、5-甲基-胞嘧啶(m5c)、5-卤代-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5c)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假异胞苷、2-硫代胞嘧啶（s2c)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶、4-硫代假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(lysidine)(k2c)、5，2
’‑
o-二甲基-胞苷(m5cm)、n4-乙酰基-2
’‑
o-甲基-胞苷(ac4cm)、n4，2
’‑
o-二甲基-胞苷(m4cm)、5-甲酰基-2
’‑
o-甲基-胞苷(fscm)、n4，n4，2
’‑
o-三甲基-胞苷(m42cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。
[0335]
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1a)、2-甲基-腺嘌呤(m2a)、n6-甲基-腺嘌呤(m6a)、2-甲硫基-n6-甲基-腺嘌呤(ms2m6a)、n6-异戊烯基-腺嘌呤(i6a)、2-甲硫基-n6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6a)、n6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲硫基-n6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(g6a)、n6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(m6t6a)、2-甲硫基-n6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2g6a)、n6,n6-二甲基-腺嘌呤(m62a)、n6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(hn6a)、2-甲硫基-n6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6a)、n6-乙酰基-腺嘌呤(ac6a)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、n6，2
’‑
o-二甲基-腺苷(m6am)、n6，n6，2
’‑
o-三甲基-腺苷(m62am)、1，2
’‑
o-二甲基-腺苷(m1am)、2-氨基-n6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、n6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2，8-二甲基-腺嘌呤、n6-甲酰基-腺嘌呤和n6-羟甲基-腺嘌呤。
[0336]
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(i)、1-甲基-肌苷(m1i)、怀俄苷(wyosine)(img)、甲基怀俄苷(mimg)、4-脱甲基-怀俄苷(img-14)、异怀俄苷(img2)、怀丁苷(wybutosine)(yw)、过氧怀丁苷(o2yw)、羟基怀丁苷(ohyw)、修饰不足(undermodified)的羟基怀丁苷(ohyw*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(queuosine)(q)、环氧辫苷(oq)、半乳糖基-辫苷(galq)、甘露糖基-辫苷(manq)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preqo)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preq1)、古嘌苷(archaeosine)(g )、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7g)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌
苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(m1g)、n2-甲基-鸟嘌呤(m2g)、n2，n2-二甲基-鸟嘌呤(m22g)、n2，7-二甲基-鸟嘌呤(m2，7g)、n2，n2，7-二甲基-鸟嘌呤(m2，2，7g)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、n2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、n2，n2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、n2-甲基-2
’‑
o-甲基-鸟苷(m2gm)、n2，n2-二甲基-2
’‑
o-甲基-鸟苷(m22gm)、1-甲基-2
’‑
o-甲基-鸟苷(m1gm)、n2，7-二甲基-2
’‑
o-甲基-鸟苷(m2，7gm)、2
’‑
o-甲基-肌苷(im)、1，2
’‑
o-二甲基-肌苷(m1im)、1-硫代-鸟嘌呤和o-6-甲基-鸟嘌呤。
[0337]
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物的非经典核碱基可独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。举例来说，在一些实施方案中，非经典核碱基可为经修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在其他实施方案中，非经典核碱基还可包括例如碱基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑并[3，4-d]嘧啶；5-甲基胞嘧啶(5-me-c)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤代(例如8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代，尤其为5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤；脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤；吡唑并[3，4-d]嘧啶；咪唑并[1，5-a]1，3，5-三嗪酮；9-脱氮嘌呤；咪唑并[4，5-d]吡嗪；噻唑并[4，5-d]嘧啶；吡嗪-2-酮；1，2，4-三嗪；哒嗪；或1，3，5-三嗪。
[0338]
糖的修饰
[0339]
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典糖基。在各个实施方案中，非经典糖基可为具有一个或多个取代的5-碳或6-碳糖(例如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，所述一个或多个取代例如为卤素、羟基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、氨基、叠氮基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。
[0340]
一般来说，rna分子含有核糖基，所述核糖基是含氧5元环。示例性非限制性替代核苷酸包括核糖中的氧置换(例如用s、se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基置换)；双键的添加(例如用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的缩环(例如用于形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如用于形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，如对于失水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、环己烷基、环己烯基和n-吗啉基(其还具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如三环和“未锁定”形式，如二醇核酸(gna)(例如r-gna或s-gna，其中核糖经连接至磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸(tna，其中核糖经α-l-呋喃苏糖基-(3
’→2’
)置换)和肽核酸(pna其中2-氨基-乙基-甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链))。
[0341]
在一些实施方案中，糖基含有一个或多个碳，所述一个或多个碳具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或l-核糖作为糖的核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包括至少一个其中糖是l-核糖、2
′‑
o-甲基核糖、2
′‑
氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、lna或pna的核苷。
[0342]
核苷间键联的修饰
[0343]
在一些实施方案中，本公开的有效负载核酸分子可含有一个或多个经修饰的核苷
间键联(例如磷酸酯主链)。主链磷酸酯基可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来改变。
[0344]
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物可包括用本文所述的另一个核苷间键联置换未改变的磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧均经硫置换。还可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换连接氧来改变磷酸酯连接体。
[0345]
替代性核苷和核苷酸可包括一个或多个非桥连氧被甲硼烷部分(bh3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置换。作为非限制性实例，在同一位置(例如alpha(α)、beta(β)或gamma(γ)位置)处的两个非桥连氧可经硫(硫代)和甲氧基置换。置换磷酸酯部分(例如α-硫代磷酸酯)位置处的一个或多个氧原子可经由非天然硫代磷酸酯主链键联赋予rna和dna稳定性(例如针对核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性)。硫代磷酸酯dna和rna具有增加的核酸酶抗性，并且因此在细胞环境中具有较长的半衰期。
[0346]
本文描述可根据本公开使用的其他核苷间键联，包括不含磷原子的核苷间键联。
[0347]
可结合本公开使用的核酸分子(例如mrna)、相关组合物、制剂和/或方法的额外实例进一步包括wo2002/098443、wo2003/051401、wo2008/052770、wo2009127230、wo2006122828、wo2008/083949、wo2010088927、wo2010/037539、wo2004/004743、wo2005/016376、wo2006/024518、wo2007/095976、wo2008/014979、wo2008/077592、wo2009/030481、wo2009/095226、wo2011069586、wo2011026641、wo2011/144358、wo2012019780、wo2012013326、wo2012089338、wo2012113513、wo2012116811、wo2012116810、wo2013113502、wo2013113501、wo2013113736、wo2013143698、wo2013143699、wo2013143700、wo2013/120626、wo2013120627、wo2013120628、wo2013120629、wo2013174409、wo2014127917、wo2015/024669、wo2015/024668、wo2015/024667、wo2015/024665、wo2015/024666、wo2015/024664、wo2015101415、wo2015101414、wo2015024667、wo2015062738、wo2015101416中所述者，各案的内容以全文并入本文中。
[0348]
6.5制剂
[0349]
根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可包含至少一种脂质组分和一种或多种额外组分，例如治疗剂和/或预防剂。纳米颗粒组合物可设计成用于一种或多种特定应用或目标。纳米颗粒组合物的成分可基于特定应用或目标，和/或基于一种或多种成分的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特征来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定配方可根据例如每种成分的特定组合的功效和毒性，针对特定应用或目标来选择。
[0350]
纳米颗粒组合物的脂质组分可包括例如本文所述的根据式(i)(和其子式)之一的脂质、磷脂(例如不饱和脂质，例如dope或dspc)、peg脂质和结构脂质。脂质组分各成分可以特定分率提供。
[0351]
在一个实施方案中，本文提供一种纳米颗粒组合物，其包含本文所提供的阳离子或可电离的脂质化合物、治疗剂和一种或多种赋形剂。在一个实施方案中，阳离子或可电离的脂质化合物包含如本文所述的根据式(i)(和其子式)之一的化合物，以及任选地选用的一种或多种额外可电离的脂质化合物。在一个实施方案中，所述一种或多种赋形剂选自中性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，治疗剂是包封于脂质纳米颗粒内
或与脂质纳米颗粒缔合。
[0352]
在一个实施方案中，本文提供一种纳米颗粒组合物(脂质纳米颗粒)，其包含：
[0353]
i)40摩尔％至50摩尔％的阳离子脂质；
[0354]
ii)中性脂质；
[0355]
iii)类固醇；
[0356]
iv)聚合物结合的脂质；以及
[0357]
v)治疗剂。
[0358]
如本文所使用，“摩尔百分比”是指一种组分相对于lnp中所有脂质组分的总摩尔数(即，阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物结合的脂质的总摩尔数)的摩尔百分比。
[0359]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含41摩尔％至49摩尔％、41摩尔％至48摩尔％、42摩尔％至48摩尔％、43摩尔％至48摩尔％、44摩尔％至48摩尔％、45摩尔％至48摩尔％、46摩尔％至48摩尔％或47.2摩尔％至47.8摩尔％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含约47.0摩尔％、47.1摩尔％、47.2摩尔％、47.3摩尔％、47.4摩尔％、47.5摩尔％、47.6摩尔％、47.7摩尔％、47.8摩尔％、47.9摩尔％或48.0摩尔％的阳离子脂质。
[0360]
在一个实施方案中，中性脂质以在5摩尔％至15摩尔％、7摩尔％至13摩尔％或9摩尔％至11摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5摩尔％、10摩尔％或10.5摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1∶1.0至约4.9∶1.0、约4.5∶1.0至约4.8∶1.0、或约4.7∶1.0至4.8∶1.0范围内。
[0361]
在一个实施方案中，类固醇以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范围内。在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。
[0362]
在一个实施方案中，lnp中治疗剂与脂质的比率(即，n/p，其中n表示阳离子脂质的摩尔数，p表示作为核酸主链的一部分存在的磷酸酯的摩尔数)在2∶1至30∶1范围内，例如在3∶1至22∶1范围内。在一个实施方案中，n/p在6∶1至20∶1或2∶1至12∶1范围内。示例性n/p范围包括约3∶1、约6∶1、约12∶1和约22∶1。
[0363]
在一个实施方案中，本文提供一种脂质纳米颗粒，其包含：
[0364]
i)有效pka大于6.0的阳离子脂质；
[0365]
ii)5摩尔％至15摩尔％的中性脂质；
[0366]
iii)1摩尔％至15摩尔％的阴离子脂质；
[0367]
iv)30摩尔％至45摩尔％的类固醇；
[0368]
v)聚合物结合的脂质；以及
[0369]
vi)治疗剂，或其药学上可接受的盐或前药，
[0370]
其中摩尔百分比是基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔数确定。
[0371]
在一个实施方案中，阳离子脂质可为在选定ph值，例如生理ph值下带有净正电荷的多种脂质种类中的任一种。示例性阳离子脂质在下文描述。在一个实施方案中，阳离子脂质的pka值大于6.25。在一个实施方案中，阳离子脂质的pka值大于6.5。在一个实施方案中，
阳离子脂质的pka值大于6.1，大于6.2，大于6.3，大于6.35，大于6.4，大于6.45，大于6.55，大于6.6，大于6.65或大于6.7。
[0372]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含40摩尔％至45摩尔％的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含45摩尔％至50摩尔％的阳离子脂质。
[0373]
在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约2∶1至约8∶1范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含5摩尔％至10摩尔％的中性脂质。
[0374]
示例性阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)或1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1
′‑
外消旋-甘油)(dspg)。
[0375]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1摩尔％至10摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1摩尔％至5摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1摩尔％至9摩尔％、1摩尔％至8摩尔％、1摩尔％至7摩尔％或1摩尔％至6摩尔％的阴离子脂质。在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1∶1至1∶10范围内。
[0376]
在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5∶1至1∶1范围内。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含32摩尔％至40摩尔％的类固醇。
[0377]
在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与阴离子脂质的摩尔百分比的总和在5摩尔％至15摩尔％范围内。在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与阴离子脂质的摩尔百分比的总和在7摩尔％至12摩尔％范围内。
[0378]
在一个实施方案中，阴离子脂质与中性脂质的摩尔比在1∶1至1∶10范围内。在一个实施方案中，中性脂质的摩尔百分比与类固醇的摩尔百分比的总和在35摩尔％至45摩尔％范围内。
[0379]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含：
[0380]
i)45摩尔％至55摩尔％的阳离子脂质；
[0381]
ii)5摩尔％至10摩尔％的中性脂质；
[0382]
iii)1摩尔％至5摩尔％的阴离子脂质；以及
[0383]
iv)32摩尔％至40摩尔％的类固醇。
[0384]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0摩尔％至2.5摩尔％的聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。
[0385]
在一个实施方案中，中性脂质以在5摩尔％至15摩尔％、7摩尔％至13摩尔％或9摩尔％至11摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5摩尔％、10摩尔％或10.5摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1∶1.0至约4.9∶1.0、约4.5∶1.0至约4.8∶1.0、或约4.7∶1.0至4.8∶1.0范围内。
[0386]
在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0∶0.9至1.0∶1.2、或1.0∶1.0至1.0∶1.2范围内。
[0387]
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在5∶1至1∶1范围内。
[0388]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含1.0摩尔％至2.5摩尔％的聚合物结合的脂质。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是以约1.5摩尔％的浓度存在。
[0389]
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100∶1至约20∶1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35∶1至约25∶1范围内。
[0390]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径在50nm至100nm或60nm至85nm范围内。
[0391]
在一个实施方案中，所述组合物包含本文所提供的阳离子脂质、dspc、胆固醇和peg-脂质，以及mrna。在一个实施方案中，本文所提供的阳离子脂质、dspc、胆固醇和peg-脂质的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5。
[0392]
纳米颗粒组合物可设计成用于一种或多种特定应用或目标。举例来说，纳米颗粒组合物可设计成用于将治疗剂和/或预防剂，例如rna递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统或其组。纳米颗粒组合物的物理化学特性可经改变以增加对特定身体目标的选择性。举例来说，可基于不同器官的开窗大小来调整粒度。纳米颗粒组合物中所包含的治疗剂和/或预防剂还可基于一个或多个所希望的递送目标进行选择。举例来说，治疗剂和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对递送至特定细胞、组织、器官或系统或其组(例如局部或特异性递送)进行选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含编码感兴趣多肽的mrna，其能够在细胞内转译以产生感兴趣多肽。此类组合物可设计成特异性递送至特定器官。在某些实施方案中，组合物可设计成特异性递送至哺乳动物肝脏。
[0393]
纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、期望目标和/或应用，或其他特性，以及治疗剂和/或预防剂的特性。举例来说，可用于纳米颗粒组合物中的rna的量可取决于rna的大小、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂和其他成分(例如脂质)的相对量也可变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约5∶1至约60∶1，例如为5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1和60∶1。举例来说，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约10∶1至约40∶1。在某些实施方案中，wt/wt比率为约20∶1。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)测量。
[0394]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种rna，并且可选择一种或多种rna、脂质和其量来提供特定n∶p比。组合物的n∶p比是指一种或多种脂质中的氮原子与rna中磷酸酯基的数量的摩尔比。在一些实施方案中，选择较低的n∶p比。可选择一种或多种rna、脂质和其量以提供约2∶1至约30∶1，例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1、22∶1、24∶1、26∶1、28∶1或30∶1的n∶p比。在某些实施方案中，n∶p比可为约2∶1至约8∶1。在其他实施方案中，n∶p比为约5∶1至约8∶1。举例来说，n∶p比可为约5.0∶1、约5.5∶1、约5.67∶1、约6.0∶1、约6.5∶1或约7.0∶1。举例来说，n∶p比可为约5.67∶1。
[0395]
纳米颗粒组合物的物理特性可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地，
纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。特征还可取决于纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。
[0396]
纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微镜检查(例如透射电子显微镜检查或扫描电子显微镜检查)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒度。还可使用仪器，例如zetasizer nano zs(malvem instruments ltd，malvem，worcestershire，uk)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，例如粒度、多分散指数和ζ电位。
[0397]
在各个实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说平均大小可为约40nm至约150nm，例如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm、或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大小可为约80nm。在其他实施方案中，平均大小可为约100nm。
[0398]
纳米颗粒组合物可为相对均质的。多分散指数可用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。较小(例如小于0.3)的多分散指数一般指示较窄的粒度分布。纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0至约0.25，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散指数可为约0.10至约0.20。
[0399]
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正或负电荷的纳米颗粒组合物一般是合意的，因为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其他成分发生不合意的相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约-10mv至约 20mv、约-10mv至约 15mv、约-10mv至约 10mv、约-10mv至约 5mv、约-10mv至约0mv、约-10mv至约-5mv、约-5mv至约 20mv、约-5mv至约 15mv、约-5mv至约 10mv、约-5mv至约 5mv、约-5mv至约0mv、约0mv至约 20mv、约0mv至约 15mv、约0mv至约 10mv、约0mv至约 5mv、约 5mv至约 20mv、约 5mv至约 15mv、或约 5mv至约 10mv。
[0400]
治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率合意地较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如rna)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少
90％。
[0401]
纳米颗粒组合物可任选地包含一种或多种包衣。举例来说，可将纳米颗粒组合物配制成具有包衣的胶囊、膜片或片剂。包含本文所述组合物的胶囊、膜片或片剂可具有任何有用的大小、抗拉强度、硬度或密度。
[0402]
6.6药物组合物
[0403]
根据本公开，纳米颗粒组合物可整体或部分地配制成药物组合物。药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物。举例来说，药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物，所述一种或多种纳米颗粒组合物包含一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，例如本文所述者。关于药物组合物和剂的配制和制造的一般准则可见于例如remington’s the science and practice of pharmacy，第21版，a.r.gennaro；lippincott，williams&wilkins，baltimore，md.，2006。常规赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非任何常规赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分的组合会导致任何不希望的生物作用或其他有害作用，则赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分不相容。
[0404]
在一些实施方案中，所述一种或多种赋形剂或辅助成分可构成包含纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的超过50％。举例来说，所述一种或多种赋形剂或辅助成分可构成医药惯例(pharmaceutical convention)的50％、60％、70％、80％、90％或更高百分比。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂得到美国食品与药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0405]
根据本公开的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物、一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗受试者的身分、体格和/或状况且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可包含在0.1％与100％(wt/wt)之间的一种或多种纳米颗粒组合物。
[0406]
在某些实施方案中，本公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物经冷藏或冷冻储存和/或运输(例如在4℃或更低温度下，例如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间(例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)的温度下储存)。举例来说，包含式(i)(和其子式)中任一个的化合物的药物组合物是在例如约-20℃、30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏储存和/或运输的溶液。在某些实施方案中，本公开还涉及一种通过在4℃或更低温度下，例如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间的温度下，例如在约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃温度下储存包含式(i)(和其子式)中任一个的化合物的纳米颗粒组合物和/或药物组合物来增加所述纳米颗粒组合物和/或药物组合物的稳定性的方法。举例来说，本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在例如4℃或更低(例如约4℃与-20℃之间)的温度下稳定保持约至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少1个月、至少2个月、至少4个
月、至少6个月、至少8个月、至少10个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月或至少24个月。在一个实施方案中，制剂在约4℃下稳定保持至少4周。在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和药学上可接受的载体，所述载体选自以下中的一种或多种：tris、乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、盐水、pbs和蔗糖。在某些实施方案中，本公开的药物组合物的ph值在约7与8之间(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5与8之间或在7与7.8之间)。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物、tris、盐水和蔗糖，并且具有约7.5-8的ph值，其适于在例如约-20℃下储存和/或运输。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和pbs，并且具有约7-7.8的ph值，其适于在例如约4℃或更低温度下储存和/或运输。在本公开的上下文中，“稳定性”、“稳定化”和“稳定的”是指本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在给定制造、制备、转运、储存和/或使用条件下，例如当施加压力，如剪切力、冷冻/解冻压力等时，对化学或物理变化(例如降解、粒度变化、聚集、包封的变化等)具有抗性。
[0407]
可将纳米颗粒组合物和/或包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物施用于任何患者或受试者，包括可受益于通过将治疗剂和/或预防剂递送至一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或其组，如肾脏系统所提供的治疗作用的患者或受试者。尽管本文所提供的关于纳米颗粒组合物和包含纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要针对适于施用于人类的组合物，但所属领域的技术人员应理解，此类组合物一般适于施用于任何其他哺乳动物。为了使组合物适于施用于各种动物而对适于施用于人类的组合物的改进是众所周知的，并且有普通技术的兽医药理学家仅通过普通实验(如果有的话)即可设计和/或进行此类改进。经考虑，施用所述组合物的受试者包括但不限于人类、其他灵长类动物和其他哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
[0408]
包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域中已知或以后将开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且接着，如果需要或必要，则将产物分成、成型成和/或包装成所希望的单剂量或多剂量单元。
[0409]
根据本公开的药物组合物可以散装、作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所使用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将被施用于受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的便利部分，例如此类剂量的一半或三分之一。
[0410]
药物组合物可制备成适合多种施用途径和方法的多种形式。举例来说，药物组合物可制备成液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、粉剂和其他形式。
[0411]
经口和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含此项技术中常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其为棉籽油、花生油、
玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，以及其混合物。除情性稀释剂外，口服组合物还可包含额外治疗剂和/或预防剂、额外剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或加香剂。在供肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，所述增溶剂例如为cremophor
tm
、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。
[0412]
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术，使用适合分散剂、润湿剂和/或助悬剂来配制。无菌可注射制剂可为在无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(ringer’s solution)、usp和等张氯化钠溶液。无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
[0413]
可注射制剂可经灭菌，例如通过滤过细菌截留过滤器过滤，和/或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
[0414]
本公开的特征在于向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂，在哺乳动物细胞中产生感兴趣多肽，以及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物和/或使哺乳动物细胞与所述纳米颗粒组合物接触。
[0415]
7.实施例
[0416]
本节中的实施例仅作为示例提供，而不是作为限制。
[0417]
一般方法.
[0418]
一般制备型hplc方法：hplc纯化是在配备有二极管阵列检测器(dad)的waters 2767上，在inertsil pre-c8 obd柱上，一般利用含0.1％tfa的水作为溶剂a且利用乙腈作为溶剂b进行。
[0419]
一般lcms方法：lcms分析是在shimadzu(lc-ms2020)系统上进行。色谱是在sunfire c18上，一般利用含0.1％甲酸的水作为溶剂a且利用含0.1％甲酸的乙腈作为溶剂b执行。
[0420]
7.1实施例1：制备化合物1.
[0421][0422]
步骤1：制备化合物1-2
[0423]
在0℃下向sm1(2.0g，8.2mmol，1.0eq)和diea(4.2g，32.6mmol，4.0eq)在dcm(50ml)中的混合物中逐滴添加十二酰氯(4.4g，20.5mmol，2.5eq)在dcm(20ml)中的溶液。将混合物在环境温度下搅拌过夜。tlc显示反应完成。将混合物用naoh水溶液(1m，100ml)和水
洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法纯化残余物，得到化合物1-2(2.3g，46％产率)。
[0424]
步骤2：制备化合物1-3
[0425]
向化合物1-2(2.3g，3.8mmol，1.0eq)的溶液中添加氯化氢(在二噁烷中，4m，10ml)，将混合物在室温下搅拌4小时，lcms显示反应完成。浓缩混合物且残余物不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms：rt：1.190min；ms m/z(esi)：510.3[m h]

。
[0426]
步骤3：制备化合物1
[0427]
将化合物1-3(200mg，0.39mmol，1.0eq)和环氧乙烷在thf(20ml)中的混合物在环境温度下搅拌48小时，lcms显示反应完成。浓缩混合物并通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物1(84mg，38.9％产率)。
[0428]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.88(t，j＝13.6hz，6h)，1.26(s，32h)，1.56-1.63(m，8h)，2.29-2.33(m，4h)，2.48-2.50(m，4h)，2.53-2.56(m，2h)，3.58-3.61(m，2h)，4.02(s，4h)。lcms：rt：1.010min；ms m/z(esi)：554.4[m h]

。
[0429]
使用对应起始原料，以与化合物1类似的方式制备以下化合物。
[0430][0431]
7.2实施例2：制备化合物2.
[0432][0433]
步骤1：制备化合物2-2
[0434]
在80℃下向sm2(750.0mg，10mmol，1.0eq)和3-溴丙酸甲酯(2.0g，12mmol，1.2eq)在acn(15.0ml)中的溶液中添加k2co3(2.7g，20.0mmol，2.0eq)和nai(0.15g，1.0mmol，0.1eq)。将混合物搅拌16小时。lcms显示反应完成，将混合物在减压下蒸发，并通过fcc(pe/ea＝5/1-0/1)纯化，得到呈无色油状的化合物2-2(1.2g，74％产率)。lcms：rt：0.426min；ms m/z(esi)：162.5[m h]

。
[0435]
步骤2：制备化合物2-3
[0436]
在室温下向化合物2-2(1.2g，7.4mmol，1.0eq)在thf(15.0ml)和h2o(3.0ml)中的溶液中添加lioh
·
h2o(3.1g，74.5mmol，10.0eq)。将混合物搅拌2小时。lcms显示反应完成，
用1m hcl将残余物调整至ph＝4-5。将混合物在减压下蒸发，得到呈黄色油状的化合物2-3(3.0g，粗品)。lcms：rt：0.266min；ms m/z(esi)：148.4[m h]

。
[0437]
步骤3：制备化合物2
[0438]
向化合物2-3(107.6mg，0.73mmol，2.0eq)和化合物1-3(200.0mg，0.366mmol，1.0eq)在dmf(5.0ml)中的溶液中添加hatu(181mg，0.475mmol，1.3eq)和diea(142mg，1.09mmol，3.0eq)。16小时后，通过lcms观察到起始原料的完全转化。在真空下移除溶剂以得到粗化合物，将粗品经制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物2(45.0mg，19％产率)。
[0439]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，6h)，1.26-1.28(m，32h)，1.52-1.63(m，9h)，2.30-2.34(m，4h)，2.55(s，3h)，2.75-2.85(m，4h)，3.08(s，2h)，3.46-3.49(m，2h)，3.60-3.63(m，2h)，3.80(s，2h)，4.00-4.08(m，4h)。lcms：rt：1.424min；ms m/z(esi)：639.4[m h]

。
[0440]
使用对应起始原料，以与化合物2类似的方式制备以下化合物。
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
[0445]
[0446]
[0447][0448]
7.3实施例3：制备化合物5.
[0449][0450]
向化合物1-3(200mg，0.39mmol，1.0eq)、diea(100mg，0.78mmol，2.0eq)和3-(吡咯烷-1-基)丙酸(62mg，0.43mmol，1.1eq)在dmf(20ml)中的混合物中添加hatu(270mg，0.71mmol，1.5eq)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，lcms显示反应完成。通过制备型hplc纯化所得物，得到呈无色油状的化合物5(48mg，19.4％严率)。
[0451]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.88(t，j＝13.6hz，6h)，1.26(s，34h)，1.59-1.62(m，4h)，1.81-1.82(m，6h)，2.31(t，j＝15.2hz，4h)，2.56-2.60(m，6h)，2.82-2.85(m，2h)，3.46-3.48(m，2h)，3.59-3.62(m，2h)，4.00-4.08(m，4h)。lcms：rt：1.050min；ms m/z(esi)：
635.4[m h]

。
[0452]
使用对应起始原料，以与化合物5类似的方式制备以下化合物。
[0453]
[0454]
[0455]
[0456][0457]
7.4实施例4：制备化合物11.
[0458][0459]
步骤1：制备化合物11-2
[0460]
使(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g，8.4mmol，1.0eq)、3-(甲基氨基)丙酸甲酯(1.2g，10.1mmol，1.2eq)和k2co3(1.7g，12.6mmol，1.5eq)在mecn(20ml)中的混合物回流过夜；lcms显示反应完成。将所得混合物用ea稀释，继而用水和盐水洗涤，接着经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈无色油状的化合物11-2(2.2g，95.4％产率)。
[0461]
步骤2：制备化合物11-3
[0462]
将含化合物11-2(2.0g，8.0mmol，1.0eq)的浓盐酸(10ml)回流搅拌过夜，lcms显示反应完成。浓缩混合物且残余物不经进一步纯化即用于下一步骤。
[0463]
步骤3：制备化合物11-4
[0464]
向3，4-二乙氧基环丁-3-烯-1，2-二酮(500mg，3.1mmol，1.0eq)的溶液中添加含diea(1.2g，9.4mmol，3.0eq)和化合物3(620mg，3.1mmol，1.0eq)的乙醇(20ml)，并将所得混合物在50℃下搅拌2小时，接着添加过量的甲胺。将混合物再搅拌2小时。浓缩所得混合物并通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物11-4(230mg，27.6％产率)。
[0465]
步骤4：制备化合物11
[0466]
向化合物11-4(100mg，0.37mmol，1.0eq)、diea(95mg，0.74mmol，2.0eq)和化合物1-3(227mg，4.5mmol，1.2eq)在dmf(5ml)中的混合物中添加hatu(210mg，0.56mmol，1.5eq)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，lcms显示反应完成。通过制备型hplc纯化所得物，得到呈无色油状的化合物11(52mg，18.5％产率)。
[0467]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.88(t，j＝13.2hz，6h)，1.26-1.28(m，34h)，1.54-1.63(m，4h)，1.72-1.77(m，6h)，2.33(t，j＝15.2hz，4h)，2.53-2.56(m，4h)，2.63-2.66(m，2h)，
2.7(s，3h)，3.20(d，j＝4.8hz，3h)，3.57-3.56(m，4h)，3.77-3.78(m，2h)，4.01-4.12(m，4h)。lcms：rt：1.825min；ms m/z(esi)：761.8[m h]

。
[0468]
使用对应起始原料，以与化合物11类似的方式制备以下化合物。
[0469][0470]
7.5实施例5：制备化合物13.
[0471][0472]
步骤1：制备化合物13-2
[0473]
在氩气下，将嘧啶-2，4(1h，3h)-二酮(1g，8.93mmol，1.0eq)加热以溶解于hmds(5.73g，35.6mmol，4.0eq)中。接着添加tmscl(187.5μl)，并将溶液在126℃下搅拌4.5小时。将混合物冷却，并在减压下移除过量溶剂以产生黄色油状物。
[0474]
紧接着此油状物用于在105℃下与无水1，3-二溴丙烷(7.5ml)反应3h。将混合物冷却至室温，向其中添加水。将dcm(50ml
×
2)用作有机相以自水中萃取，并且有机相经无水na2so4干燥，过滤且在减压下浓缩以获得粗产物。通过柱色谱法(pe∶ea＝1∶2)纯化粗产物，得到化合物13-2(770mg，产率：40％)。lcms：rt：0.870min；ms m/z(esi)：233.0[m h]

。
[0475]
步骤2：制备化合物13-3
[0476]
向化合物13-2(300mg，1.28mmol，1.0eq)、3-(甲基氨基)丙酸甲酯(151mg，1.28mmol，1.0eq)在mecn(10ml)中的混合物中添加k2co3(213mg，1.54mmol，1.2eq)。将混合物在80℃下搅拌过夜。lcms显示反应完成。将所得物用ea(50ml)稀释，用水和盐水(50ml
×
2)洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法pe∶ea＝(1∶2)纯化粗产物，得到化合物13-3(240mg，产率：73％)。lcms：rt：0.263min；ms m/z(esi)：270.2[m h]

。
[0477]
步骤3：制备化合物13-4
[0478]
将化合物13-3(200mg，0.78mmol，1.0eq)和单水合氢氧化锂(94.1mg，3.92mmol，5.0eq)在thf/h2o(5ml/1m1)中的混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完成。在减压下浓缩反应混合物以移除有机溶剂。将含水层用1n hcl酸化至ph＝4-5，接着在真空下浓缩，得到粗产物。粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms：rt：0.330min；ms m/z(esi)：256.2[m h]

。
[0479]
步骤4：制备化合物13
[0480]
向化合物1-3(200mg，0.83mmol，2.0eq)在dmf(5ml)中的溶液中添加化合物13-4(211mg，0.41mmol，1.0eq)、hatu(315mg，0.83mmol，2.0eq)和dipea(160mg，1.25mmol，3.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(20ml
×
2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈黄色油状的化合物13(13mg，4.1％产率)。
[0481]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ12.47(s，1h)，8.19(s，1h)，5.75(s，1h)，4.23(s，6h)，3.66-.3.59(m，6h)，3.29-2.91(m，6h)，2.48(s，5h)，1.63(s，10h)，1.28-1.26(m，32h)，0.89-0.86(t，j＝6.8hz，6h)。lcms：rt：1.473min；ms m/z(esi)：747.06[m h]

。
[0482]
7.6实施例6：制备化合物14.
[0483][0484]
步骤1：制备化合物14-2
[0485]
在0℃下向sm5(2.0g，13.1mmol，1.0eq)在dmf(100ml)中的溶液中逐份添加nah(629mg，15.7mmol，1.2eq)。接着将所得混合物在室温下搅拌30min。添加1，3-二溴丙烷(4.0g，19.6mmol，1.5eq)，并将反应混合物在室温下搅拌36小时。将反应混合物倒入水(200ml)中，并用ea(100ml
×
5)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用dcm/meoh＝40/1纯化残余物，得到呈黄色固体状的化合物14-2(250mg，7％产率)。
[0486]
步骤2：制备化合物14-3
[0487]
向化合物14-2(250mg，0.91mmol，1.0eq)在乙腈(10ml)中的溶液中添加3-(甲基氨基)丙酸甲酯(160mg，1.37mmol，1.5eq)、碳酸钾(251mg，1.82mmol，2.0eq)和碘化钠(13mg，0.091mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(20ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用dcm/meoh＝40/1-30/1纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的化合物14-3(200mg，71％严率)。lcms：rt：0.360min；ms m/z(esi)：311.2[m h]

。
[0488]
步骤3：制备化合物14-4
[0489]
向化合物14-3(200mg，0.64mmol，1.0eq)在thf/h2o(8ml/8ml)中的溶液中添加单水合氢氧化锂(107mg，2.56mmol，4.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。lcms显示反应完全进行。在减压下浓缩反应混合物以移除有机溶剂。将含水层用1n hcl酸化至ph＝5，接着浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物14-4(70mg，43％产率)。lcms：rt：0.280min；ms m/z(esi)：255.2[m h]

。
[0490]
步骤4：制备化合物14
[0491]
将化合物14-4(70mg，0.28mmol，1.0eq)、化合物1-3(143mg，0.28mmol，1.0eq)、hatu(128mg，0.34mmol，1.2eq)和dipea(108mg，1.84mmol，3.0eq)在dmf(6ml)中的混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(20ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物14(27mg，13％产率)。
[0492]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ7.55(d，1h，j＝7.2hz)，5.84(d，1h，j＝7.2hz)，4.10-4.01(m，4h)，3.90-3.88(m，2h)，3.61-3.47(m，4h)，3.00-2.45(m，8h)，2.32(t，j＝7.6hz，4h)，2.07-2.04(m，2h)，1.63-1.51(m，10h)，1.31-1.28(m，33h)，0.88(t，j＝6.8hz，6h)。lcms：rt：1.660min；ms m/z(esi)：746.4[m h]

。
[0493]
7.7实施例7：制备化合物15.
[0494]
[0495]
步骤1：制备化合物15-2
[0496]
在氩气下向腺嘌呤(1.35g，10mmol，1.0eq)和dmap(122mg，1mmol，0.1eq)在thf(50ml)中的溶液中添加boc2o(9.38g，43mmol，4.3eq)。将反应物在室温下搅拌5h。在移除溶剂后，添加etoac(400ml)，并用1n hcl(30ml)且接着用饱和nacl溶液(3
×
100ml)洗涤溶液。在经na2so4干燥、过滤且在减压下移除溶剂后，将残余物溶解于甲醇(100ml)和饱和nahco3(45ml)中。接着将反应物在50℃下搅拌1小时，并在移除溶剂后，添加水(100ml)。接着用chcl3(2
×
300ml)萃取水相，并在经na2so4干燥后，在减压下移除溶剂。通过快速色谱法(环己烷∶ea＝1∶9)纯化所得粗产物，得到呈白色固体状的化合物15-2(2.44g，73％)。lcms：rt：1.140min；ms m/z(esi)：336.3[m h]

。
[0497]
步骤2：制备化合物15-3
[0498]
向15-2(0.67g，2.0mmol，1.0eq)在dmf(10ml)中的溶液中添加nah(0.1g，2.6mmol，1.3eq)，并在氩气下在室温下搅拌0.5小时。接着添加1，3-二溴丙烷(482mg，2.4mmol，1.2eq)，并将所得混合物再搅拌16小时。接着通过添加水(10.0ml)来淬灭反应。接着用ea萃取水相，并在经na2so4干燥后，在减压下移除溶剂。通过快速色谱法(pe/ea，5∶1)纯化所得粗产物，得到呈无色油状的化合物15-3(0.45g，50％)。lcms：rt：1.418min；ms m/z(esi)：458.3[m h]

。
[0499]
步骤3：制备化合物15-4
[0500]
在80℃下向15-3(456.0mg，1.0mmol，1.0eq)和3-(甲基氨基)丙酸甲酯(128mg，1.1mmol，1.1eq)在acn(15.0ml)中的溶液中添加k2co3(276mg，2.0mmol，2.0eq)和nai(14.6mg，0.1mmol，0.1eq)。将混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈无色油状的15-4(440mg，粗品)。lcms：rt：0.855min；ms m/z(esi)：493.3[m h]

。
[0501]
步骤4：制备化合物15-5
[0502]
在室温下向15-4(250.0mg，0.55mmol，1.0eq)在thf(6.0ml)和h2o(2.0ml)中的溶液中添加lioh.h2o(27.6mg，0.65mmol，1.2eq)。将混合物搅拌2小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈黄色油状的15-5(200 mg，粗品)。lcms：rt：0.806min；ms m/z(esi)：479.3[m h]

。
[0503]
步骤5：制备化合物15-6
[0504]
向化合物1-3(212mg，0.42mmol，1.0eq)和15-5(200.0mg，0.42mmol，1.0eq)在dmf(5.0ml)中的溶液中添加hatu(207mg，0.55mmol，1.3eq)和diea （162mg，1.26mmol，3.0eq)。在室温下16小时后，通过lcms观察到起始原料的完全转化。添加h2o，接着用ea萃取水相，在经无水na2so4干燥后，在减压下移除溶剂。通过快速色谱法(dcm/meoh，20∶1)纯化所得粗产物，得到呈褐色油状的化合物15-6(0.25g，粗品)。lcms：rt：1.938min；ms m/z(esi)：770[m-100]

。
[0505]
步骤6：制备化合物15
[0506]
在室温下向15-6(100.0mg，0.1mmol，1.0eq)在dcm(6.0ml)中的溶液中添加tfa(1.0ml)。将混合物搅拌2小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，并通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物15(14mg，50％产率)。
[0507]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，12h)，1.25-1.46(m，27h)，1.62-1.70(m，
23h)，2.32-2.40(m，4h)，3.44-3.67(m，2h)，4.08-4.22(m，4h)，7.53-7.55(m，1h)，7.70-7.73(m，1h)。lcms：rt：1.305min；ms m/z(esi)：770.4[m h]

。
[0508]
7.8实施例8：制备化合物17.
[0509][0510]
将羟基丙酮(0.1g，0.2mmol，1.0eq)和化合物1-3(30.0mg，0.4mmol，2.0eq)在甲醇(10.0ml)中的混合物在氩气和室温下搅拌2h。接着添加nacnbh3(25.0mg，0.4mmol，2.0eq)，并将所得混合物再搅拌16小时。接着通过添加水(10.0ml)来淬灭反应。在室温下继续搅拌20min，接着将反应混合物用ea萃取，用盐水洗涤。将有机层分离并经na2so4干燥，将混合物在减压下蒸发，并用制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物17(20.0mg，17％产率)。
[0511]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.81-0.90(m，6h)，0.98-1.08(m，3h)，1.26(s，32h)，1.61-1.81(m，8h)，2.30-2.34(m，4h)，2.53-2.63(m，2h)，2.72-3.06（m，3h)，3.36-3.59(m，2h)，4.03(s，4h)。lcms：rt：1.597min；ms m/z(esi)：568.4[m h]

。
[0512]
7.9实施例9：制备化合物18.
[0513][0514]
向化合物1-3(200mg，0.39mmol，1.0eq)在乙腈(10ml)中的溶液中添加3-溴-1-丙醇(65mg，0.47mmol，1.2eq)、碳酸钾(162mg，1.17mmol，3.0eq)和碘化钠(6mg，0.039mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完成。将反应混合物用ea稀释，用水、盐水洗涤，并经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物18(30mg，14％产率)。
[0515]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ4.00(s，4h)，3.79(t，j＝5.2hz，2h)，2.64-2.5(m，6h)，2.30(t，j＝7.6hz，4h)，1.73-1.60(m，10h)，1.26（s，32h)，0.88(t，j＝6.4hz，6h)。lcms：rt：1.80min；ms m/z(esi)：568.4[m h]

。
[0516]
使用对应起始原料，以与化合物18类似的方式制备以下化合物。
[0517][0518][0519]
7.10实施例10：制备化合物25.
[0520][0521]
步骤1：制备化合物25-2
[0522]
向乙醇胺(600mg，9.8mmol，1.0eq)在乙腈(30ml)中的溶液中添加1-溴戊烷(1.48g，9.8mmol，1.0eq)、碳酸钾(2.0g，14.7mmol，1.5eq)和碘化钠(145mg，0.98mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌1小时。lcms显示反应完成。将反应混合物用ea稀释，用水、盐水洗涤，并经na2so4干燥且浓缩，得到呈黄色油状的化合物25-2(510mg，40％产率)。
lcms：rt：0.545min；ms m/z(esi)：132.5[m h]

。
[0523]
步骤2：制备化合物25-3
[0524]
向化合物25-2(510mg，3.89mmol，1.0eq)在乙腈(25ml)中的溶液中添加3-溴丙酸甲酯(780mg，4.67mmol，1.2eq)、碳酸钾(805mg，5.84mmol，1.5eq)和碘化钠(57mg，0.39mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完成。将反应混合物用ea稀释，用水、盐水洗涤，并经na2so4干燥且浓缩，得到呈黄色油状的化合物25-3(400mg，47％产率)。lcms：rt：0.725min；ms m/z(esi)：218.5[m h]

。
[0525]
步骤3：制备化合物25-4
[0526]
向化合物25-3(400mg，1.84mmol，1.0eq)在thf/h2o(10ml/10ml)中的溶液中添加单水合氢氧化锂(309mg，7.36mmol，4.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完成。在减压下浓缩反应混合物以移除有机溶剂。将含水层用1n hcl酸化至ph＝4-5，接着浓缩，得到呈无色油状的化合物25-4(170mg，46％产率)。lcms：rt：0.705min；ms m/z(esi)：204.4[m h]

。
[0527]
步骤4：制备化合物25
[0528]
将化合物1-3(200mg，0.39mmol，1.0eq)、化合物25-4(79mg，0.39mmol，1.0eq)、hatu(179mg，0.47mmol，1.2eq)和dipea(151mg，1.17mmol，3.0eq)在dmf(6ml)中的混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(20ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物25(29mg，10％严率)。
[0529]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ4.54-3.94(m，4h)，3.60-3.43(m，4h)，3.20-3.04(m，4h)，2.32(t，j＝7.6hz，4h)，1.84(s，21h)，1.60-1.13(m，32h)，0.95-0.86(m，9h)。lcms：rt：1.880min；ms m/z(esi)：695.4[m h]

。
[0530]
使用对应起始原料，以与化合物25类似的方式制备以下化合物。
[0531][0532]
7.11实施例11：制备化合物32.
[0533][0534]
步骤1：制备化合物32-2
[0535]
在0℃下向化合物sm1(500mg，2.0mmol，1.0eq)和diea(1050mg，8.2mmol，4.0eq)在无水dcm(20ml)中的混合物中逐滴添加癸酰氯(1560mg，8.2mmol，4.0eq)在dcm(20ml)中的溶液。将混合物搅拌过夜。tlc显示反应完成。将所得物用水和盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过色谱管柱纯化残余物，得到呈黄色固体状的化合物32-2(770mg，69.5％产率)。
[0536]
步骤2：制备化合物32-3
[0537]
向化合物32-2(770mg，1.4mmol，1.0eq)在二噁烷(5ml)中的溶液中添加3ml hcl(在二噁烷中，4m)。将混合物在50℃下搅拌2小时并浓缩。残余物未经进一步纯化即用于下一步骤中。
[0538]
步骤3：制备化合物32
[0539]
将化合物32-3(200mg，0.44mmol，1.0eq)、diea(230mg，1.76mmol，4.0eq)、羧酸(190mg，0.88mmol，2.0eq)和hatu(340mg，0.88mmol，2.0eq)在dcm(5ml)中的混合物在环境温度下搅拌30min，并浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(56mg，18.4％产率)。
[0540]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，12h)，1.26-1.28(m，36h)，1.41-1.43(m，4h)，1.51-1.63(m，8h)，2.30-2.33(m，4h)，2.39-2.49(m，6h)，2.76-2.80(m，2h)，3.45-3.48(m，2h)，3.58-3.61(m，2h)，4.00-4.08(m，4h)。lcms：rt：0.940min；ms m/z(esi)：693.5[m h]

。
[0541]
使用对应起始原料，以与化合物32类似的方式制备以下化合物。
[0542][0543]
7.12实施例12：制备化合物35.
[0544][0545]
步骤1：制备化合物35-2
[0546]
向化合物sm1(1.2g，13.46mmol，1.0eq)在乙腈(60ml)中的溶液中添加4-溴丁酸甲酯(3.65g，20.19mmol，1.5eq)、碳酸钾(3.71g，26.92mmol，2.0eq)和碘化钠(199mg，1.346mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(100ml)中，并用ea(50ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用pe/ea＝3/1纯化残余物，得到呈无色油状的化合物35-2(1.5g，59％产率)。lcms：rt：0.400min；ms m/z(esi)：190.2[m h]

。
[0547]
步骤2：制备化合物35-3
[0548]
向化合物35-2(1.5g，7.9mmol，1.0eq)在dcm(40ml)中的溶液中添加咪唑(806mg，11.8mmol，1.5eq)和tbdpscl(2.6g，9.5mmol，1.2eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(50ml)中，并用dcm(40ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用pe/ea＝3/1纯化残余物，得到呈
无色油状的化合物35-3(1.8g，53％产率)。lcms：rt：1.340min；ms m/z(esi)：428.2[m h]

。
[0549]
步骤3：制备化合物35-4
[0550]
向化合物35-3(1.0g，2.34mmol，1.0eq)在thf/h2o(15ml/15ml)中的溶液中添加单水合氢氧化锂(393mg，9.36mmol，4.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。在减压下浓缩反应混合物，得到呈白色固体状的化合物35-4(800mg，83％产率)。lcms：rt：1.260min；ms m/z(esi)：414.2[m h]

。
[0551]
步骤4：制备化合物35-5
[0552]
向化合物1-3(400mg，0.97mmol，2.0eq)在dmf(15ml)中的溶液中添加化合物35-4(247mg，0.485mmol，1.0eq)、hatu(369mg，0.97mmol，2.0eq)和dipea(188mg，1.455mmol，3.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(30ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物35-5(190mg，43％产率)。
[0553]
步骤5：制备化合物35
[0554]
向化合物35-5(190mg，0.21mmol，1.0eq)在dcm(8ml)中的溶液中添加hcl的1，4-二噁烷溶液(2.0ml，4.0m)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完全进行。浓缩反应混合物，并通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物35(20mg，14％产率)。
[0555]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ4.10-4.01(m，4h)，3.88-3.87(m，1h)，3.60-3.45(m，4h)，3.05-2.99(m，4h)，2.50(s，2h)，2.32(t，j＝7.6hz，4h)，2.09-2.08(m，2h)，1.63-1.47(m，14h)，1.35-1.25(m，32h)，0.88(t，j＝6.4hz，6h)。lcms：rt：1.680min；ms m/z(esi)：667.3[m h]

。
[0556]
7.13实施例13：制备化合物37.
[0557][0558]
步骤1：制备化合物37-1
[0559]
向2-溴乙醇(6.0g，48mmol，1.0eq)在dcm(80ml)中的溶液中添加对甲苯磺酸(10mg)。将混合物在室温下搅拌10分钟。接着逐滴添加dhp(4.4g，53mmol，1.1eq)，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完成。用nahco3(1.0g)淬灭反应。将反应混合物倒入水(100ml)中，并用dcm(40ml
×
2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用pe/ea＝30/1纯化残余物，得到呈无色油状的化合物37-1(7.0g，70％产率)。1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ4.68(t，j＝3.2hz，1h)，4.05-3.99(m，1h)，3.92-3.86(m，1h)，3.80-3.74(m，1h)，3.55-3.48(m，3h)，1.86-1.81(m，1h)，1.77-1.70(m，1h)，1.64-1.49(m，4h)。
[0560]
步骤2：制备化合物37-2
[0561]
向4-氨基丁酸甲酯(2.0g，13.07mmol，1.0eq)在meoh(50ml)中的溶液中添加丁醛
(942mg，13.07mmol，1.0eq)和acoh(2滴)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。接着添加nacnbh3(985mg，13.07mmol，1.0eq)，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完成。浓缩反应混合物，并通过柱色谱法用pe/ea＝3/1-1/1纯化，得到呈淡黄色油状的化合物37-2(1.8g，80％产率)。lcms：rt：0.590min；ms m/z(esi)：174.1[m h]

。
[0562]
步骤3：制备化合物37-3
[0563]
向化合物37-2(1.0g，5.8mmol，1.0eq)在乙腈(40ml)中的溶液中添加化合物37-1(1.46g，7.0mmol，1.2eq)、碳酸钾(1.60g，11.6mmol，2.0eq)和碘化钠(86mg，0.58mmol，0.1eq)。将反应混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(80ml)中，并用ea(50ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过柱色谱法用pe/ea＝3/1纯化残余物，得到呈无色油状的化合物37-3(800mg，46％产率)。lcms：rt：0.940min；ms m/z(esi)：302.2[m h]

。
[0564]
步骤4：制备化合物37-4
[0565]
向化合物37-3(800mg，2.65mmol，1.0eq)在thf/h2o(10ml/10ml)中的溶液中添加单水合氢氧化锂(445mg，10.62mmol，4.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。在减压下浓缩反应混合物，得到呈白色固体状的化合物37-4(600mg，78％产率)。lcms：rt：1.000min；ms m/z(esi)：288.5[m h]

。
[0566]
步骤5：制备化合物37-5
[0567]
向化合物37-4(69mg，0.24mmol，1.0eq)在dmf(6ml)中的溶液中添加hatu(109mg，0.29mmol，1.2eq)和dipea(93mg，0.72mmol，3.0eq)。将混合物在室温下搅拌10min。接着添加化合物1-3(120mg，0.24mmol，1.0eq)，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水(30ml)中，并用ea(30ml
×
4)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物37-5(40mg，21％严率)。lcms：rt：2.065min；ms m/z(esi)：800.0[m h]

。
[0568]
步骤6：制备化合物37
[0569]
向化合物37-5(40mg，0.05mmol，1.0eq)在dcm(4ml)中的溶液中添加hcl的1，4-二噁烷溶液(1.0ml，4.0m)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。浓缩反应混合物并通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物37(10mg，28％产率)。
[0570]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ4.10-4.01(m，5h)，3.59-3.46(m，3h)，3.22-3.11(m，4h)，2.22(s，1h)，2.34-2.30(m，5h)，1.57-1.39(m，20h)，1.28-1.26(m，30h)，1.01-0.98(m，4h)，0.88(t，j＝6.8hz，6h)。lcms：rt：1.815min；ms m/z(esi)：696.1[m h]

。
[0571]
7.14实施例14：制备化合物44.
[0572][0573]
步骤1：制备化合物44-2
[0574]
在80℃下，向(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.74g，10mmol，1.0eq)和3-溴丙酸甲酯(2.0g，12mmol，1.2eq)溶解于acn(20.0ml)中的溶液中添加k2co3(2.1g，15.0mmol，1.5eq)。将混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物并通过fcc(pe/ea＝5/1-0/1)纯化，得到呈黄色油状的化合物44-2(1.7g，65％产率)。lcms：rt：0.629min；ms m/z(esi)：260.9[m h]

。
[0575]
步骤2：制备化合物44-3
[0576]
在80℃下，向化合物44-2(0.7g，2.7mmol，1.0eq)和1-溴戊烷(0.6g，4.0mmol，1.5eq)溶解于acn(10.0ml)中的溶液中添加k2co3(0.74g，5.4mmol，2.0eq)。将混合物在80℃下搅拌16小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物并通过fcc(pe/ea＝10/1-5/1)纯化，得到呈黄色油状的化合物44-3(0.6g，67％严率)。lcms：rt：0.829min；ms m/z(esi)：331.2[m h]

。
[0577]
步骤3：制备化合物44-4
[0578]
在100℃下，向化合物44-3(0.6g，1.82mmol，1.0eq)溶解于hcl(5.0ml，6m)中的溶液。将混合物搅拌16小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈无色油状的化合物44-4（0.5g，粗品)。lcms：rt：0.418min；ms m/z(esi)：216.2[m h]

。
[0579]
步骤4：制备化合物44-5
[0580]
向44-4(150.0mg，0.69mmol，1.0eq)溶解于etoh(5.0ml)中的溶液中添加7(120.0mg，0.69mmol，1.0eq)，将混合物在室温下搅拌16小时。接着添加nh3/meoh(2.0ml)，并搅拌1小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物并通过制备型hplc纯化，得到呈白色固体状的化合物44-5(80.0mg，62％产率)。lcms：rt：0.730min；ms m/z(esi)：312.1[m h]

。
[0581]
步骤5：制备化合物44
[0582]
向化合物1-3(65mg，0.13mmol，1.0eq)和44-5(80.0mg，0.26mmol，2.0eq)在dmf(5.0ml)中的溶液中添加hatu(71.0mg，0.19mmol，1.3eq)和diea （56.0mg，0.44mmol，3.0eq)。在室温下16小时后，通过lcms观察到起始原料的完全转化。在真空下移除溶剂以得
到粗化合物，并将粗品经制备型hplc纯化，得到呈白色固体状的化合物44(20.0mg，23％产率)。
[0583]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，9h)，1.22-1.29(m，38h)，1.55-78(m，10h)，2.31-2.69(m，12h)，3.50-3.58(m，4h)，3.78(s，2h)，4.01-4.11(m，4h)，7.06(s，2h)，7.71-8.05(m，1h)。lcms：rt：1.676min；ms m/z(esi)：803.5[m h]

。
[0584]
使用对应起始原料，以与化合物44类似的方式制备以下化合物。
[0585][0586]
7.15实施例15：制备化合物46.
[0587][0588]
步骤1：制备化合物46-2
[0589]
向44-4(150.0mg，0.69mmol，1.0eq)溶解于etoh(5.0ml)中的溶液中添加3，4-二乙氧基环丁-3-烯-1，2-二酮(120.0mg，0.69mmol，1.0eq)，将混合物在室温下搅拌16小时。接着添加ch3nh2(2.0ml)，并搅拌1小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物并通过制备型hplc纯化，得到呈白色固体状的化合物46-2(80.0mg，57％严率)。lcms：rt：0.710min；ms m/z(esi)：326.1[m h]

。
[0590]
步骤2：制备化合物46
[0591]
向1-3(65mg，0.13mmol，1.0eq)和46-2(80.0mg，0.26mmol，2.0eq)在dmf(5.0ml)中
的溶液中添加hatu(71.0mg，0.19mmol，1.3eq)和diea(56.0mg，0.44mmol，3.0eq)。在室温下16小时后，通过lcms观察到起始原料的完全转化。在真空下移除溶剂以得到粗化合物，并将粗品通过制备型hplc纯化，得到呈白色固体状的化合物46(35.0mg，30％产率)。
[0592]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，9h)，1.22-1.29(m，38h)，1.41-1.45(m，2h)，1.53-1.63(m，8h)，1.76(s，2h)，2.31-2.35(m，4h)，2.42-2.43(m，2h)，2.56-2.62(m，4h)，2.73(s，2h)，3.31(d，j＝6.2hz，3h)，3.50-3.58(m，4h)，3.76(s，2h)，4.01-4.11(m，4h)。lcms：rt：1.942min；ms m/z(esi)：817.9[m h]

。
[0593]
使用对应起始原料，以与化合物46类似的方式制备以下化合物。
[0594]
[0595][0596]
7.16实施例16：制备化合物50.
[0597][0598]
步骤1：制备化合物50-2
[0599]
向化合物sm1(200mg，0.81mmol)在ch2cl2(20ml)中的溶液中添加diea(0.9g，
6.52mmol)、亚麻油酸(685mg，2.45mmol)、edci(500mg，2.45mmol)和dmap(20mg，0.45mmol)。将反应物在室温下搅拌10小时。将反应混合物倒入水(100ml)中，并用ch2cl2(3*100ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥且在真空下浓缩。通过快速柱色谱法(etoac∶pe＝5∶1)纯化粗产物，得到呈无色油状的化合物50-2（500mg，产率：48％)。
[0600]
步骤2：制备化合物50-3
[0601]
向化合物3(200mg，1.41mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液中添加tfa(1ml)。将反应物在室温下搅拌2小时。在真空下浓缩反应混合物，得到化合物50-3(174mg，粗品)。
[0602]
步骤3：制备化合物50
[0603]
向化合物50-3(150mg，0.22mmol)在dmf(5ml)中的溶液中添加diea(90mg，0.67mmol)、化合物sm9(40mg，0.27mmol)和hatu(130mg，0.33mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。将反应混合物倒入水(100ml)中，并用etoac(3
×
100ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥且在真空下浓缩。通过制备型hplc纯化粗产物，得到呈无色油状的化合物50(19mg，产率：10％)。
[0604]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.87(t，j＝8hz，6h)，1.25-1.39(m，32h)，1.50-1.63(m，8h)，1.92-1.94(m，4h)，2.02-2.07(m，8h)，2.30-2.33(m，4h)，2.72-2.79(m，4h)，2.89-3.10(m，4h)，3.45-3.61(m，4h)，4.00-4.10(m，4h)，5.32-5.40(m，8h)。lcms：rt：1.97min；ms m/z (esi)：795.5[m h]

。
[0605]
7.17实施例17：制备化合物51.
[0606][0607]
步骤1：制备化合物51-2
[0608]
在0℃下将庚二酸(10.0g，62.5mmol，1.0eq)加入socl2(30.0ml)中。将混合物在80℃下搅拌16小时。tlc显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈黄色油状的化合物51-2(12.0g，粗品)。
[0609]
步骤2：制备化合物51-3
[0610]
在0℃下向51-2(6.2g，31.8mmol，1.0eq)和2-己基-1-癸醇(7.8g，31.8mmol，1.0eq)溶解于thf(50.0ml)中的溶液中接着添加diea(5.2g，80.0mmol，2.5eq)。将混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈黄色油状的化合物51-3(14g，粗品)。
[0611]
步骤3：制备化合物51-4
[0612]
向sm1(2.0g，8mmol，1.0eq)溶解于thf(50.0ml)中的溶液中添加51-3(14.0g，32.0mmol，4.0eq)和吡啶(3.2g，40.0mmol，5.0eq)，将混合物在70℃下搅拌16小时。tlc显示反应完成，在减压下蒸发混合物并通过fcc(pe/ea＝1/0-10/1)纯化，得到呈黄色油状的化
合物51-4(9.0g，粗品)。
[0613]
步骤4：制备化合物51-5
[0614]
向化合物51-4(0.5g，0.5mmol，1.0eq)溶解于dcm(5.0ml)中的溶液中添加tfa(0.5ml)，将混合物在室温下搅拌1小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈黄色油状的化合物51-5(0.5g，粗品)。
[0615]
步骤5：制备化合物51
[0616]
向3-(二甲基氨基)丙酸(80mg，0.68mmol，2.0eq)和51-5(300.0mg，0.34mmol，1.0eq)在dmf(5.0ml)中的溶液中添加hatu(168.0mg，0.44mmol，1.3eq)和diea(131.0mg，1.02mmol，3.0eq)。在室温下16小时后，通过lcms观察到起始原料的完全转化。在真空下移除溶剂以得到粗化合物，并将粗品通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物51(120.0mg，36％产率)。
[0617]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.90(m，14h)，1.22-1.26(m，61h)，1.62-1.67(m，12h)，2.27-2.35(m，6h)，2.86-3.01(m，4h)，3.31-3.61(m，3h)，3.85-4.09(m，6h)。lcms：rt：1.367min；ms m/z(esi)：977.7[m h]

。
[0618]
7.18实施例18：制备化合物61.
[0619][0620]
步骤1：制备化合物61-2
[0621]
在0℃下向61-1(1.0g，2.5mmol，1.0eq)和diea(0.64g，5.0mmol，2.0eq)溶解于dcm(20.0ml)中的溶液中接着添加mscl(0.34g，3.0mmol，1.2eq)。将混合物在室温下搅拌16小时。tlc显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈黄色油状的化合物61-2(1.2g，粗品)。
[0622]
步骤2：制备化合物61-3
[0623]
在0℃下向sm1(245.0mg，1.0mmol，1.0eq)溶解于thf(10.0ml)中的溶液中接着添加nah(88.0mg，2.2mmol，2.2eq)。将混合物在室温下搅拌0.5小时，接着添加61-2(1.2g，2.5mmol，2.5eq)。将混合物在70℃下搅拌16小时，添加十二酰氯(0.54g，2.5mmol，2.5eq)，并在70℃下搅拌16小时。tlc显示反应完成，将混合物倒入h2o中，用ea萃取。在减压下蒸发混合物，并通过fcc(pe/ea＝1/0-10/1)纯化，得到呈黄色油状的化合物61-3(0.4g，粗品)。
[0624]
步骤3：制备化合物61-4
[0625]
向61-3(0.4g，0.5mmol，1.0eq)溶解于dcm(5.0ml)中的溶液中添加tfa(0.5ml)，将混合物在室温下搅拌1小时。lcms显示反应完成，在减压下蒸发混合物，得到呈白色固体状的化合物61-4(120mg，粗品)。lcms：rt：1.538min；ms m/z(esd：708.5[m h]

。
[0626]
步骤4：制备化合物61
二噁烷中的溶液(9ml，4.0m)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。在减压下浓缩混合物并通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物63-4(360mg，54％严率)。lcms：rt：0.790min；ms m/z(esi)：282.1[m h]

。
[0637]
步骤4：制备化合物63-5
[0638]
将化合物63-4(360mg，1.28mmol，1.0eq)、3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(295mg，1.92mmol，1.5eq)、hatu(779mg，2.05mmol，1.6eq)和dipea(662mg，5.12mmol，4.0eq)在dmf(15ml)中的混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水中，并用ea萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物63-5(152mg，31％产率)。lcms：rt：1.000min；ms m/z(esi)：381.2[m h]

。
[0639]
步骤5：制备化合物63-6
[0640]
向化合物63-5(152mg，0.40mmol，1.0eq)在thf(10ml)中的溶液中添加pd/c(30mg)。将反应混合物在室温下在h2下搅拌16小时。在减压下浓缩混合物，得到呈无色油状的化合物63-6(125mg，81％产率)。lcms：rt：0.830min；ms m/z(esi)：385.2[m h]

。
[0641]
步骤6：制备化合物63-7
[0642]
向化合物63-6(125mg，0.33mmol，1.0eq)在thf/h2o(5ml/2ml)中的溶液中添加单水合氢氧化锂(55mg，1.32mmol，4.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。lcms显示反应完全进行。在减压下浓缩反应混合物以移除有机溶剂。将含水层用2n hcl酸化至ph＝5，接着通过制备型hplc纯化，得到呈无色油状的化合物63-7(84mg，78％产率)。lcms：rt：0.430min；ms m/z(esi)：329.2[m h]

。
[0643]
步骤7：制备化合物63
[0644]
将化合物63-7(45mg，0.14mmol，1.0eq)、壬-1-醇(50mg，0.35mmol，2.5eq)、edci(81mg，0.42mmol，3.0eq)、dmap(2mg，0.014mmol，0.1eq)和dipea(90mg，0.70mmol，5.0eq)在dmf(6ml)中的混合物在30℃下搅拌16小时。lcms显示反应完全进行。将反应混合物倒入水中，并用dcm萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥且浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到呈无色油状的化合物63(25mg，31％产率)。
[0645]1h nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.86-0.88(m，6h)，1.18-1.43(m，30h)，1.55-1.67(m，8h)，2.21-2.26(m，4h)，2.60-2.64(m，5h)，2.84-2.87(m，2h)，3.12-3.16(m，1h)，3.4-3.57(m，4h)，4.04-4.08(m，4h)。lcms：rt：1.440min；ms m/z(esi)：581.4[m h]

。
[0646]
7.20实施例20：脂质纳米颗粒的制备和表征
[0647]
简单地说，将本文所提供的阳离子脂质、dspc、胆固醇和peg-脂质以50∶10∶38.5∶1.5的摩尔比溶解于乙醇中，并在10mm至50mm柠檬酸盐缓冲液ph＝4中稀释mrna。通过使用微流体设备，以在9-30ml/min范围内的总流速，以1∶3的体积比混合脂质乙醇溶液与mrna水溶液，以大约10∶1至30∶1的总脂质与mrna重量比制备出lnp。使用透析移除乙醇且以dpbs替代。最后，将脂质纳米颗粒经0.2μm无菌过滤器过滤。
[0648]
通过动态光散射，使用malvern zetasizer nano zs(malvern uk)，使用173
°
反向散射检测模式测定脂质纳米颗粒大小。使用quant-it ribogreen rna定量分析试剂盒(thermo fisher scientific，uk)，根据制造商的说明书，测定脂质纳米颗粒的包封效率。
[0649]
如文献中所报导，lnp制剂的表观pka与在活体内lnp对于核酸的递送效率相关。使
用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(tns)的荧光的分析来测定各制剂的表观pka。如上文所述，制备出在pbs中包含阳离子脂质/dspc/胆固醇/dmg-peg(50/10/38.5/1.5mol％)的lnp制剂。制备tns于蒸馏水中的300μm储备液。在3ml含有50mm柠檬酸钠、50mm磷酸钠、50mm硼酸钠和30mm氯化钠的缓冲溶液(其中ph值在3至9范围内)中将lnp制剂稀释至0.1mg/ml总脂质。添加tns溶液的等分试样以得到0.1mg/ml的最终浓度且在涡旋混合后，在室温下，在molecular devices spectramax id3光谱仪中，使用325nm的激发波长和435nm的发射波长测量荧光强度。将s形曲线最佳拟合分析应用于荧光数据，并将pka值测量为产生半数最大荧光强度的ph值。
[0650]
7.21实施例21：动物研究
[0651]
通过尾静脉注射将0.5mg/kg剂量的包封人促红细胞生成素(hepo)mrna的包含下表中的化合物的脂质纳米颗粒经全身施用于6-8周龄的雌性icr小鼠(xipuer-bikai，shanghai)，并在施用后的特定时间点(例如6小时)时收集小鼠血液样品。除前述测试组外，还将相同剂量的包封hepo mrna的包含二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(dlin-mc3-dma，通常缩写为mc3)的脂质纳米颗粒以类似方式施用于年龄和性别相当组的小鼠作为阳性对照。
[0652]
在最后一个取样时间点后，通过超剂量co2对小鼠实施安乐死。通过在4℃下以5000g离心10分钟，自全血分离出血清，急速冷冻并在-80℃下储存以进行分析。使用可商购试剂盒(dep00，r&d systems)，根据制造商的说明书，进行elsa分析。
[0653]
自测试组测量的测试脂质纳米颗粒的特征，包括优于mc3的表达水平列于下表中。
[0654]
表2.
[0655]
[0656][0657]
na＝未测试
[0658]
a：≥2
[0659]
b：≥1且＜2
[0660]
c：≥0.1且＜1
[0661]
d：＜0.1。