用于调节蛋白质的糖基化谱的方法和组合物与流程

1.本发明涉及包含5-硫代-l-岩藻糖的细胞培养基，以及5-硫代-l-岩藻糖用于调节抗体或其它含fc的蛋白质的糖基化谱并从而调节所述蛋白质的结合亲和力的用途。


背景技术：

2.重组蛋白(如治疗性抗体和fc融合蛋白)通常在哺乳动物细胞系中生产。
3.在哺乳动物宿主细胞中生产的单克隆抗体和fc融合蛋白可以具有多种翻译后修饰，包括糖基化。单克隆抗体(例如igg)通常在每个重链的天冬酰胺297 (asn297)处具有n连接的糖基化位点(每个完整抗体两个)。附着于抗体上asn297的聚糖通常是具有非常低或无二等分n-乙酰基葡糖胺(二等分glcnac)的复合双触角结构，具有低量的末端唾液酸和可变量的半乳糖。聚糖通常还具有高水平的核心岩藻糖基化。已经显示，抗体中核心岩藻糖基化的减少改变fc效应子功能，特别是fc γ受体结合和adcc活性。这一观察结果导致对生产具有降低的核心岩藻糖基化的抗体的细胞系的工程化的兴趣。
4.一些基于抗体的免疫疗法的关键是抗体fc部分与称为fcγ受体(fcγr)的细胞表面受体的结合。取决于胞质内结构域，fcγr触发不同的免疫应答。常见的是用于激活受体(fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)和用于抑制受体(如fcγriib)的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim) [lu j和sun pd, structural mechanism of high affinity fcgammari recognition of immunoglobulin g.immunol rev 2015, 268, 192-200]。此外，受体可以分为高亲和力fcγri (cd64)以及低亲和力fcγrii (cd32)和fcγriii (cd16)。bruhns等人描述了不同的受体类别与所有已知抗体亚类的结合。据报道igg1以不同的亲和力结合所有类型的受体。观察到igg1对fcγriib、fcγriiib、fcyriiia和fcγriia的亲和力增加，其中对fcγri的亲和力最高[bruhns p, iannascoli b, england p, mancardi da, fernandez n, jorieux s和daeron m, specificity and affinity of human fcgamma receptors and their polymorphic variants for human igg subclasses.blood 2009, 113, 3716-25]。
[0005]
两种主要的fc效应子功能是抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。表达fcγriiia的自然杀伤(nk)细胞负责adcc活性。通常，抗体的受体亲和力和从而生物活性取决于抗体的翻译后修饰，如糖基化[harris rj, chin et, macchi f, keck rg, shyong b-j, ling vt, cordoba aj, marian m, sinclair d, battersby je和jones ajs, analytical characterization of monoclonal antibodies: linking structure to function. in current trends in monoclonal antibody development and manufacturing编辑; shire sj等人; springer new york: new york, ny, 2010, 193-205]。
[0006]
抗体在fc部分中每条重链的第297位(asn297)呈现不同的n连接的糖基化。已知重组蛋白的fc部分上核心-岩藻糖基化的存在由于岩藻糖的空间位阻而降低adcc反应
[mizushima t, yagi h, takemoto e, shibata-koyama m, isoda y, iida s, masuda k, satoh m和kato k, structural basis for improved efficacy of therapeutic antibodies on defucosylation of their fc glycans.genes to cells 2011, 16, 1071-1080]。因此，核心-岩藻糖基化的减少导致增强的adcc。这通过无岩藻糖基化的抗egfr和抗cs1抗体的体内研究证实，当与它们的岩藻糖基化的对应物比较时，所述抗体显示增强的adcc和抗肿瘤活性。gomathinayagam s, laface d, houston-cummings nr, mangadu r, moore r, shandil i, sharkey n, li h, stadheim ta和zha d, in vivo anti-tumor efficacy of afucosylated anti-cs1 monoclonal antibody produced in glycoengineered pichia pastoris.journal of biotechnology 2015, 208, 13-21。结论是，fc糖基化的调节是增强治疗性抗体的生物活性的策略。
[0007]
减少岩藻糖基化的方法包括用于工程化细胞系的方法。
[0008]
工程化细胞系的替代方案包括使用作用于糖基化途径中的酶的小分子抑制剂。另一种选择是提供用于生产重组抗体的小分子岩藻糖类似物，所述重组抗体具有复合n连接的聚糖，但具有降低的岩藻糖基化。这例如在wo 09135181中已被提出。
[0009]
但是仍然需要改进对治疗性蛋白质的糖基化模式的调节，并因此对其生物活性的调节。


技术实现要素：

[0010]
已经发现，向细胞培养基和补料中加入5-硫代-l-岩藻糖和/或其某些衍生物导致抗体/含fc的蛋白质的岩藻糖基化减少。产生的蛋白质表现出增强的fcγriiia结合，这与增加的adcc有关。令人惊讶地，使用5-硫代-l-岩藻糖和/或其某些衍生物导致岩藻糖类似物的高度掺入。
[0011]
因此，本发明涉及制备具有降低的岩藻糖基化的抗体或其它含fc的蛋白质的方法，所述方法包括：在包含5-硫代-l-岩藻糖和/或5-硫代-l-岩藻糖衍生物的培养基中培养宿主细胞，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式，其中所述宿主细胞表达具有fc结构域的抗体或其它含fc的蛋白质，所述fc结构域具有至少一个n-糖苷连接的糖链，其通过糖链的还原末端的n-乙酰基葡糖胺与所述fc结构域结合，和从所述细胞分离所述抗体或其它含fc的蛋白质，其中与来自在其它方面相同但不存在5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物的培养条件下培养的相同宿主细胞的所述抗体或其它含fc的蛋白质相比，所述抗体或其它含fc的蛋白质在所述糖链处具有降低的岩藻糖基化，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式。
[0012]
在优选的实施方案中，在包含5-硫代-l-岩藻糖和/或部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖的细胞培养基中培养所述宿主细胞。
[0013]
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0014]
在另一个优选的实施方案中，在补料分批细胞培养或灌注细胞培养中培养所述宿主细胞。
[0015]
在优选的实施方案中，所述宿主细胞如下培养：-将所述宿主细胞和水性细胞培养基填充到生物反应器中，-在所述生物反应器中孵育所述细胞，-在所述生物反应器中所述细胞的整个孵育时间内连续地或在所述孵育时间内一次或数次将细胞培养基加入到所述生物反应器中，其中所述细胞培养基包含5-硫代-l-岩藻糖。
[0016]
优选地，加入的所述培养基的ph低于ph 8.5，并且包含浓度在10 nmol/l至100 mmol/l之间，优选在0.1
ꢀµ
mol/l至10 mmol/l之间的5-硫代-l-岩藻糖。
[0017]
本发明进一步涉及用于制备硫代岩藻糖基化的抗体或其它含fc的蛋白质的方法，所述方法包括：在包含5-硫代-l-岩藻糖和/或5-硫代-l-岩藻糖衍生物的培养基中培养宿主细胞，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式，其中所述宿主细胞表达具有fc结构域的抗体或其它含fc的蛋白质，所述fc结构域具有至少一个n-糖苷连接的糖链，其通过糖链的还原末端的n-乙酰基葡糖胺与所述fc结构域结合，和从所述细胞分离所述抗体或其它含fc的蛋白质。
[0018]
本发明进一步涉及干粉末细胞培养基，其包含5-硫代-l-岩藻糖和/或5-硫代-l-岩藻糖衍生物，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式。
[0019]
在一个实施方案中，所述细胞培养基是补料培养基。
[0020]
在另一个实施方案中，所述细胞培养基包含5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物，其量使得当溶解以提供液体培养基时，所述5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物在所述液体培养基中的浓度在10 nmol/l至100 mmol/l之间，优选在0.1
ꢀµ
mol/l和10 mmol/l之间。
[0021]
通常设计液体培养基(例如补料培养基或灌注培养基)使得5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物在所述细胞培养物中的最终浓度在0.1-1mmol/l之间。
[0022]
在一个实施方案中，所述细胞培养基包含至少一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲液组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分。
[0023]
本发明进一步涉及用于生产根据本发明的细胞培养基的方法，所述方法如下进行：a)将5-硫代-l-岩藻糖和/或5-硫代-l-岩藻糖衍生物与所述细胞培养基的其它组分混合，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式，b)使步骤a)的所述混合物经受研磨。
[0024]
在优选的实施方案中，步骤b)在针磨机、fitz磨机或喷射磨机中进行。
[0025]
在另一个优选的实施方案中，在研磨之前，将来自步骤a)的所述混合物冷却至低于0℃的温度。
附图说明
[0026]
图1显示具有和不具有乙酰化的l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖的结构相似性。
[0027]
图2-5显示使用生产三种不同的igg1 (a、b和c)和融合蛋白(d)的四种不同的cho细胞系，5-硫代-l-岩藻糖对细胞性能的影响。在左侧可视化活细胞密度(vcd)，并且在右侧可视化滴度。对照补料不含补充物，而dmso对照含有1.17% dmso，其与用作两种全乙酰化的岩藻糖类似物的溶剂的浓度相同。进一步的细节参见实施例1。
[0028]
图6显示糖结构(a岩藻糖基化的g0f，b硫代岩藻糖基化的g0硫代f和c g1断裂模式)。关于图6的细节可以在实施例2中找到。
[0029]
图7显示在使用uplc分离释放的、标记的聚糖之后获得的荧光信号，显示与岩藻糖基化的聚糖相比对应于硫代岩藻糖基化的聚糖的峰的改变的保留时间。关于图7的细节可以在实施例2中找到。
[0030]
图8显示使用生产(a) mab1、(b) mab2、(c) mab3和(d)融合蛋白的cho细胞系，5-硫代-l-岩藻糖对岩藻糖基化谱的影响。细节可以在实施例3中找到。
[0031]
图9显示在生产(a) mab1或(b) mab3的补料分批实验期间5-硫代-l-岩藻糖的加速作用。细节可以在实施例4中找到。
[0032]
图10显示5-硫代-l-岩藻糖对糖基化谱的剂量反应。进一步的细节可以在实施例5中找到。
[0033]
图11显示在第12天结合mab3对照(黑色)或结合5-硫代-l-岩藻糖处理的mab3 (灰色)的fcγriiia重叠图。进一步的细节可以在实施例6中找到。
具体实施方式
[0034]
细胞培养基支持和维持细胞在人工环境中的生长。根据其生长将得到支持的生物体的类型，细胞培养基包含组分的复合混合物，有时多于一百种不同的组分。哺乳动物、昆虫或植物细胞繁殖所需的细胞培养基通常比支持细菌和酵母生长的培养基复杂得多。化学限定培养基通常包含但不仅仅限于氨基酸、维生素、金属盐、抗氧化剂、螯合剂、生长因子、缓冲液、激素和本领域技术人员已知的更多物质。
[0035]
根据本发明的细胞培养基是维持和/或支持细胞体外生长的任何组分的混合物。它可以是复合培养基或化学限定培养基。细胞培养基可以包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分或仅一些组分，使得单独加入另外的组分。根据本发明的细胞培养基的实例是全培养基，其包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分以及培养基补充物或补料。在优选的实施方案中，细胞培养基是全培养基、灌注培养基或补料培养基。全培养基也称为基础培养基，其ph通常在6.8-7.8之间。优选补料培养基的ph低于8.5，优选在6.5-8.5之间。
[0036]
细胞培养基可以是液体培养基或干粉末培养基。
[0037]
通常，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持生物反应器中细胞的生长。
[0038]
补料或补料培养基是这样的细胞培养基，其不是支持细胞培养物中的初始生长和生产的基础培养基，而是在后期阶段加入的培养基，以防止营养物的耗尽并维持生产阶段。与基础培养基相比，补料培养基可以具有更高浓度的一些组分。例如，一些组分(例如包括氨基酸或碳水化合物的营养物)可以以基础培养基中约5x、6x、7x、8x、9x、10x、12x、14x、16x、20x、30x、50x、100x、200x、400x、600x、800x或甚至约1000x的浓度存在于补料培养基中。
[0039]
哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞体外生长的组分的混合物。哺乳动物细胞的实例是人或动物细胞，优选cho细胞、cos细胞、i vero细胞、bhk细胞、ak-1细胞、sp2/0细胞、l5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。
[0040]
化学限定的细胞培养基是不包含任何化学上未限定的物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成是已知的。化学限定培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含饲养细胞、血清、提取物或消化物或其它可能对培养基添加化学限定不良的蛋白质的组分。化学上未限定的或限定不良的化学组分是其化学组成和结构未知的那些，以不同的组成存在或仅能用巨大的实验努力来定义-与评价蛋白质(如白蛋白或酪蛋白)的化学组成和结构相当。
[0041]
粉末化的细胞培养基或干粉末培养基是通常由研磨过程、冷冻干燥过程或干法或湿法制粒过程得到的细胞培养基。这意味着粉末化的细胞培养基是粒状的颗粒培养基，而不是液体培养基。术语“干粉末”可以与术语“粉末”互换使用；然而，本文所用的“干粉末”仅指粒状材料的总体外观，而不旨在是指该材料完全不含复合或附聚的溶剂，除非另有说明。由研磨或冷冻干燥过程得到的干粉末培养基通常粒度低于0.5 mm，例如在0.05-0.5 mm之间。
[0042]
由干法或湿法制粒过程(例如通过喷雾干燥、湿法制粒或干法压实)得到的干粉末培养基通常粒度大于0.5 mm，例如在0.5-5 mm之间。干法压实通常在辊压机中进行。us 6,383,810 b2公开了生产附聚的真核细胞培养基粉末的方法。该方法包括用溶剂润湿干粉末细胞培养基，然后将润湿的培养基再次干燥，以获得干燥的附聚的细胞培养基。
[0043]
在一个实施方案中，根据本发明的干粉末培养基通过干法压实来生产。
[0044]
待用根据本发明的培养基培养的细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如植物或动物细胞)。优选地，细胞是哺乳动物细胞。细胞可以是正常细胞、永生化的细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中任何一种都可以是建立的或转化的细胞系或从天然来源获得。宿主细胞是掺入用于表达具有fc结构域的抗体或另一种含fc的蛋白质的基因的细胞。
[0045]
颗粒的尺寸是指颗粒的平均直径。如果给出颗粒的尺寸，则意味着至少80%，优选至少90%的颗粒具有给定的粒度或在给定的粒度范围内。粒径通过激光散射确定。
[0046]
通过用惰性气体填充各个容器或设备产生惰性气氛。合适的惰性气体是稀有气体，如氩气或优选氮气。这些惰性气体是非反应性的，并且防止发生不期望的化学反应。在根据本发明的方法中，产生惰性气氛意味着例如通过引入液氮或氮气将氧的浓度降低低于10% (v/v)绝对值。
[0047]
不同类型的磨机对于本领域技术人员是已知的。
[0048]
针磨机(也称为离心冲击式磨机)粉碎固体，其中高速旋转盘上的突出的针提供断
裂能。例如，针磨机由munson machinery (usa)、premium pulman (india)或sturtevant (usa)出售。
[0049]
喷射磨机使用压缩气体来加速颗粒，引起它们在处理室中彼此冲击。喷射磨机例如由sturtevant (usa)或pmt (austria)出售。
[0050]
由fitzpatrick (usa)商业化的fitz磨机使用具有叶片的转子用于研磨。
[0051]
连续运行的方法是不分批运行的方法。如果研磨过程连续运行，则意味着培养基组分在一定时间内永久和稳定地进料至磨机中。
[0052]
根据本发明的细胞培养基(尤其是全培养基)通常包含至少一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲液组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分。
[0053]
培养基也可以包含丙酮酸钠、胰岛素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或普朗尼克酸和/或表面活性组分(如化学制备的非离子表面活性剂)。合适的非离子表面活性剂的一个实例是封端于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，也称为泊洛沙姆，例如可以以商品名pluronic
ꢀ®
从basf, germany获得。
[0054]
糖组分都是单糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。
[0055]
根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸、蛋白氨基酸，尤其是必需氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，以及非蛋白氨基酸如d-氨基酸，优选l-氨基酸。
[0056]
酪氨酸是指l-或d-酪氨酸，优选l-酪氨酸。
[0057]
半胱氨酸是指l-或d-半胱氨酸，优选l-半胱氨酸。
[0058]
维生素的实例是维生素a (视黄醇、视黄醛、各种类视色素和四种类胡萝卜素)、维生素b
1 (硫胺)、维生素b
2 (核黄素)、维生素b
3 (烟酸、烟酰胺)、维生素b
5 (泛酸)、维生素b
6 (吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素b
7 (生物素)、维生素b
9 (叶酸、亚叶酸)、维生素b
12 (氰钴胺素、羟钴胺素、甲钴胺)、维生素c (抗坏血酸)、维生素d (麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素e (生育酚、生育三烯酚)和维生素k (叶绿醌、甲基萘醌)。还包括维生素前体。
[0059]
盐的实例是包含无机离子(例如碳酸氢根、钙、氯化物、镁、磷酸根、钾和钠)或微量元素(例如co、cu、f、fe、mn、mo、ni、se、si、ni、bi、v和zn)的组分。实例是五水硫酸铜(ii) (cuso
4.
5h2o)、氯化钠(nacl)、氯化钙(cacl
2.
2h2o)、氯化钾(kcl)、硫酸亚铁(ii)、无水磷酸二氢钠(nah2po4)、无水硫酸镁(mgso4)、无水磷酸氢二钠(na2hpo4)、六水合氯化镁(mgcl
2.
6h2o)、七水合硫酸锌。
[0060]
缓冲液的实例是co2/hco
3 (碳酸盐)、磷酸盐、hepes、pipes、aces、bes、tes、mops和tris。
[0061]
辅因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素c、nad/nadp、钴胺素、黄素单核苷酸和衍生物、谷胱甘肽、血红素核苷酸磷酸和衍生物。
[0062]
根据本发明，核酸组分是核碱基，如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，核苷如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷，以及核苷酸如单磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
[0063]
补料培养基可以具有与全培养基不同的组成。它们通常包含氨基酸、微量元素和
维生素。它们也可能包含糖组分，但有时由于生产原因，糖组分以单独的补料加入。
[0064]
合适的补料培养基可能例如包含一种或多种以下化合物：一水合l-天冬酰胺l-异亮氨酸l-苯丙氨酸一水合l-谷氨酸钠l-亮氨酸l-苏氨酸l-赖氨酸单盐酸盐l-脯氨酸l-丝氨酸l-精氨酸单盐酸盐一水合l-组氨酸单盐酸盐l-甲硫氨酸l-缬氨酸一水合l-天冬氨酸单钠l-色氨酸氯化胆碱肌醇烟酰胺d( )泛酸钙吡哆醇盐酸盐氯化硫胺素盐酸盐微粒化的维生素b12(氰钴胺素)生物素叶酸核黄素无水硫酸镁五水合硫酸铜(ii)七水合硫酸锌1,4-二氨基丁烷二盐酸盐四水合七钼酸铵水合硫酸镉四水合氯化镁(ii)六水合氯化镍(ii)偏硅酸钠偏钒酸钠二水合氯化锡(ii)亚硒酸钠(约45% se)
一水合磷酸二氢钠柠檬酸铁(iii)铵(约18% fe)根据本发明的冷冻是指冷却至低于0℃的温度。
[0065]
术语“抗体”指(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即免疫球蛋白家族的多肽或其片段，其含有免疫特异性结合特定抗原(例如cd70)的抗原结合位点和包含一个或多个复合n-糖苷连接的糖链的fc结构域，或(b)免疫特异性结合抗原(例如cd70)的这样的免疫球蛋白多肽或片段的保守取代的衍生物。抗体一般描述于例如harlow和lane, antibodies: a laboratory manual (cold spring harbor laboratory press, 1988)。
[0066]
含fc的蛋白质是包含含有复合n-糖苷连接糖链的fc结构域或区的任何蛋白质。
[0067]
术语“单克隆抗体”是指衍生自单细胞克隆的抗体，包括任何真核或原核细胞克隆，或噬菌体克隆，而不是生产它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。
[0068]
术语“fc区”是指抗体的恒定区，例如ch1-铰链-ch2-ch3结构域，任选地具有ch4结构域，或这样的fc区的保守取代的衍生物。
[0069]
术语“fc结构域”是指抗体的恒定区结构域，例如ch1、铰链、ch2、ch3或ch4结构域，或这样的fc结构域的保守取代的衍生物。
[0070]
术语“fab区”是指与抗原结合的抗体的可变区。
[0071]“抗原”是抗体(通常是抗体fab结构域)特异性结合的分子。
[0072]
术语“特异性结合(binding)”和“特异性结合(binds)”是指抗体或抗体衍生物将以高度选择性的方式与其相应的靶抗原结合，而不与大量其它抗原结合。通常，抗体或其它含fc的蛋白质以至少约1
×
10-7 m，并且优选10-8 m至10-9 m、10-10 m、10-11 m、或10-12 m的亲和力结合，并以其结合除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如bsa、酪蛋白)的亲和力至少两倍的亲和力结合预定抗原。
[0073]
术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition of)”是指降低可测量的量，或完全防止，尤其是降低可测量的量，或完全防止催化反应的特定酶的活性。
[0074]
术语“无岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化的”是指在内部核心结构处没有岩藻糖的聚糖结构。
[0075]
如本文所用，“硫代岩藻糖基化”或“硫代岩藻糖基化的”是指包含至少一个硫代岩藻糖的聚糖结构。通常在“硫代岩藻糖基化的”聚糖结构中，岩藻糖被硫代岩藻糖取代。
[0076]
如本文所用，“5-硫代-l-岩藻糖”或“thiofuc”是指岩藻糖衍生物，其中糖环中的氧被硫原子取代。“5-硫代-l-岩藻糖”是指α和/或β端基异构体。
[0077]
如本文所用，“乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖”或“acthiofuc”是指硫代岩藻糖上的所
有形式的乙酰基，其是指携带1-4个乙酰基的5-硫代-l-岩藻糖。图1显示例如携带4个乙酰基的全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖。
[0078]
5-硫代-l-岩藻糖的衍生物是2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖、5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式。
[0079]
2-f-5-硫代-l-岩藻糖的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式是根据式i的分子：i其中r彼此独立地为h或乙酰基。
[0080]
5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式是根据式ii的分子：ii其中r彼此独立地为h或乙酰基。
[0081]
6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式是根据式iii的分子：iii其中r彼此独立地为h或乙酰基。
[0082]
5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式是的根据式iv分子：
iv其中r彼此独立地为h或乙酰基。
[0083]
以下图片显示非乙酰化的形式。在乙酰化的形式中，一个或多个oh基团被乙酰化。
[0084]
如本文所用，“核心岩藻糖基化”或“岩藻糖基化”是指在n连接的聚糖的还原末端将岩藻糖加入到n-乙酰基葡糖胺(“glcnac”)。
[0085]
如本文所用，“n-糖苷连接的糖链”或“n-糖苷连接的聚糖”通常结合天冬酰胺297 (根据kabat的编号)，尽管复合n-糖苷连接的糖链也可以连接到其它天冬酰胺残基。如本文所用，复合n-糖苷连接的糖链具有双触角复合糖链，主要具有以下结构：
其中 /-指示糖分子可以存在或不存在，并且数字指示在糖分子之间的连接位置。在上述结构中，结合天冬酰胺的糖链末端称为还原末端(右侧)，而相对侧称为非还原末端。岩藻糖通常与还原末端的n-乙酰基葡糖胺(“glcnac”)结合，通常通过α 1,6键(glcnac的6-位与岩藻糖的1-位连接)。“gal”是指半乳糖，并且“man”是指甘露糖。
[0086]“复合n-糖苷连接的糖链”不包括其中仅将甘露糖掺入核心结构的非还原末端的高甘露糖型糖链，但包括1)复合型，其中核心结构的非还原末端侧具有一个或多个半乳糖-n-乙酰基葡糖胺(也称为“gal-glcnac”)的分支，并且gai-glcnac的非还原末端侧任选地具有唾液酸、二等分n-乙酰基葡糖胺等；或2)杂合型，其中核心结构的非还原末端侧具有高甘露糖n-糖苷连接的糖链和复合n-糖苷连接的糖链的两个分支。
[0087]
在一些实施方案中，“复合n-糖苷连接的糖链”包括其中核心结构的非还原末端侧具有零个、一个或多个半乳糖-n-乙酰基葡糖胺(也称为“gal-glcnac”)分支，并且gal-glcnac的非还原末端侧任选地进一步具有结构(例如唾液酸、二等分n-乙酰基葡糖胺等)的复合型。
[0088]
本发明的要点是提供减少核心岩藻糖基化(即含fc的蛋白质或抗体的n-糖苷连接的糖链的岩藻糖基化)的试剂和方法。在一个实施方案中，岩藻糖基化被抑制，并因此减少或完全被抑制。在另一个实施方案中，取而代之地，含fc的蛋白质或抗体的n-糖苷连接的糖链被硫代岩藻糖基化。两种作用也可以平行发生，在不同的抗体中或在携带两种不同的聚糖结构的一种抗体中。
[0089]
还提供了通过这样的方法生产的抗体。在其它方面，提供了包含有效量的5-硫代-l-岩藻糖和/或5-硫代-l-岩藻糖衍生物的培养基，所述衍生物选自部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、2-f-5-硫代-l-岩藻糖、5-炔基-5-硫代-l-岩藻糖、6,6,6-三氟-5-硫代-l-岩藻糖和5-硫代-l-岩藻糖膦酸酯的非乙酰化的、部分乙酰化的或完全乙酰化的形式。在下文中，衍生物不是每次都指定的。显然，如果提到5-硫代-l-岩藻糖，它也包括上述指定的衍生物。然而，优选5-硫代-l-岩藻糖和/或部分或完全乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖。
[0090]
在一些实施方案中，与来自在其它方面相同但不存在5-硫代-l-岩藻糖的培养条件下培养的相同宿主细胞的抗体或其它含fc的蛋白质相比，结合fc区(或结构域)的复合n-糖苷连接的糖链的岩藻糖基化被完全抑制或降低。“在其它方面相同但不存在5-硫代-l-岩藻糖的培养条件下”通常是指细胞培养含有相同的成分并且在相同的条件下进行，但不同之处在于不存在5-硫代-l-岩藻糖。
[0091]
为了抑制或降低核心岩藻糖基化，将宿主细胞在包含5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物的细胞培养基中培养。
[0092]
在优选的实施方案中，在其中培养宿主细胞的细胞培养基不包含l-岩藻糖。
[0093]
包含在在其中培养宿主细胞的液体细胞培养基中的5-硫代-l-岩藻糖的量是有效减少岩藻糖掺入的量。在此上下文中，“有效量”是指足以将岩藻糖掺入抗体或另一种含fc的蛋白质的复合n-糖苷连接的糖链减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少60%的5-硫代-l-岩藻糖量。
[0094]
典型地，该量在0.1
ꢀµ
m至1 mm之间。
[0095]
如果将补料培养基加入到细胞培养物中，它们可能包含更高量的5-硫代-l-岩藻糖。
[0096]
有效的5-硫代-l-岩藻糖的量可以通过标准细胞培养方法确定。例如，可以使用细胞培养测定来帮助鉴定最佳的剂量范围。待使用的精确量还取决于给药时间、宿主细胞系、细胞密度等。
[0097]
抗体的岩藻糖基化和/或硫代岩藻糖基化模式可以通过改变培养基中5-硫代-l-岩藻糖的浓度和/或暴露于5-硫代-l-岩藻糖的持续时间来调节。
[0098]
本发明的粉末化的细胞培养基优选通过混合所有组分并研磨它们来生产。通过研磨生产干粉末化的细胞培养基的领域中的技术人员已知混合各组分。优选地，将所有组分充分混合，使得混合物的所有部分具有几乎相同的组成。组合物的均匀性越高，所得培养基在均匀细胞生长方面的质量越好。
[0099]
研磨可以用任何类型的适于生产粉末化的细胞培养基的磨机进行。典型的实例是球磨机、针磨机、fitz磨机或喷射磨机。优选针磨机、fitz磨机或喷射磨机，非常优选针磨机。
[0100]
本领域技术人员知道如何运行这样的磨机。
[0101]
例如，在针磨机的情况下，具有约40 cm的盘直径的大型设备磨机通常以1-6500转/分钟运行，优选1-3000转/分钟。
[0102]
研磨可以在标准研磨条件下进行，得到粒度在10-300
ꢀµ
m之间，最优选在25-100
ꢀµ
m之间的粉末。
[0103]
优选地，经受研磨的混合物的所有组分是干燥的。这意味着，如果它们包含水，它们确实仅包含结晶水，但不超过10重量%，优选不超过5重量%，最优选不超过2重量%的未结合或未配位的水分子。
[0104]
在优选的实施方案中，研磨在惰性气氛中进行。优选的惰性保护气体是氮气。
[0105]
在另一个优选的实施方案中，在研磨之前将混合物的所有组分冷冻。在研磨之前冷冻组分可以通过确保将成分冷却至低于0℃并且最优选低于-20℃的温度的任何方式进行。在优选的实施方案中，冷冻用液氮进行。这意味着在引入磨机中之前用液氮处理成分，例如通过将液氮倒入其中储存成分的容器中。在优选的实施方案中，容器是补料器。如果容器是补料器，则优选在补料器的引入成分的一侧或靠近补料器的引入成分的一侧引入液氮。
[0106]
通常，经2-20秒，用液氮处理成分。
[0107]
优选地，以进入磨机的所有成分的温度低于0℃，最优选低于-20℃的方式进行成分的冷却。
[0108]
在优选的实施方案中，将所有成分放入容器中，将混合物从该容器转移到补料器
中，最优选转移到计量螺旋补料器中。在补料器中，有时将成分进一步混合(取决于补料器的类型)并且另外冷却。然后将冷冻的混合物从补料器转移至磨机，使得在磨机中研磨的混合物仍优选温度低于0℃，更优选低于-20℃。
[0109]
通常，共混时间(即成分的混合物在补料器中的停留时间)超过一分钟，优选在15-60分钟之间。
[0110]
计量螺旋补料器(也称为计量蜗形轮)通常以10-200转/分钟的速度运行，优选其以40-60转/分钟运行。
[0111]
通常，磨机的温度保持在-50℃至 30℃之间。在优选的实施方案中，温度保持在约10℃。
[0112]
在研磨期间氧水平优选低于10% (v/v)。
[0113]
该方法可以例如分批或连续进行。在优选的实施方案中，根据本发明的方法通过在一定时间内将各成分的混合物永久性地填充到用于冷却的补料器中并将冷却的混合物从补料器永久性地填充到磨机中而连续进行。
[0114]
在研磨之后，所得干粉末培养基可以例如通过在辊压机中干法压实而进一步压实以扩大颗粒的尺寸。
[0115]
为了使用例如由研磨或湿法或干法压实产生的干粉末化的培养基，将溶剂(优选水(最特别地蒸馏和/或去离子水或纯化水或注射用水)或水性缓冲液)加入到培养基中，并且将组分混合直到培养基完全溶解在溶剂中并且产生即用型液体培养基。
[0116]
溶剂也可以包含盐水、提供合适的ph范围(通常在ph 1.0至ph 10.0之间的范围内)的可溶性酸或碱离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和醇或其它极性有机溶剂。
[0117]
也可以向细胞培养基和溶剂的混合物中加入其它物质，如用于调节ph的缓冲物质、胎牛血清、糖等。然后将所得液体细胞培养基与待生长或维持的细胞接触。
[0118]
根据本发明的干粉末或粒状培养基通常包含5-硫代-l-岩藻糖，其量使得在溶解后，所得液体培养基包含有效量的5-硫代-l-岩藻糖，通常在10 nmol/l至100 mmol/l之间，优选在0.1
ꢀµ
mol/l至10 mmol/l之间。干粉末或粒状培养基优选不含任何l-岩藻糖。
[0119]
本发明进一步涉及用于培养细胞的方法，所述方法如下进行：a)提供生物反应器，b)将待培养细胞与通过溶解根据本发明的干粉末培养基而产生的细胞培养基混合，c)孵育步骤b)的混合物。
[0120]
在一个实施方案中，生物反应器是灌注生物反应器。
[0121]
生物反应器是可以在其中培养细胞的任何容器、烧瓶或罐。孵育通常在合适的条件(如合适的温度等)下进行。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞生长/培养的合适的孵育条件，例如合适的温度、ph、渗透性、通气、搅动等，以及限制或理想地避免来自环境的外来微生物污染的生物反应器。
[0122]
灌注生物反应器是可以在其中进行灌注细胞培养的生物反应器。它包含在细胞培养期间通常是封闭的生物反应器容器、容器中的搅拌器、用于引入新鲜培养基的管线、用于从生物反应器中去除包含细胞、液体培养基和目标产物的收获流的收获管线以及收获管线中的细胞保留装置，所述细胞保留装置保留细胞，同时可以收集收获物的液体部分。提供有
利设置的细节的关于灌注细胞培养的综述可以在“perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing
ꢀ–ꢀ
a critical review
”ꢀ
jean-marc bielser等人, biotechnology advances 36 (2018) 1328-1340中找到。
[0123]
本发明还涉及在生物反应器中培养细胞的方法，所述方法如下进行：-将细胞和水性细胞培养基填充到生物反应器中，-在生物反应器中孵育细胞，-在生物反应器中细胞的整个孵育时间内连续地或在所述孵育时间内一次或数次将细胞培养基加入到生物反应器中，其中培养基优选ph小于ph 8.5，并且包含至少5-硫代-l-岩藻糖和/或其如上定义的衍生物。
[0124]
在优选的实施方案中，培养基是补料培养基。
[0125]
通常补料培养基包含在50-300 g/l之间的溶解于溶剂中的固体组分。
[0126]
在另一个实施方案中，培养基是灌注培养基。
[0127]
在一个实施方案中，在本发明的方法中，在孵育期间连续地或在所述时间内一次或数次加入到生物反应器中的补料培养基具有不同的组成。
[0128]
在另一个通常优选的实施方案中，在本发明的方法中，在孵育期间连续地或在所述时间内一次或数次加入到生物反应器中的补料培养基总是具有相同的组成。
[0129]
通过本发明的方法生产的抗体和抗体衍生物可以从细胞培养物中分离，并使用例如凝胶电泳、过滤、透析和层析(如例如亲和层析和/或离子交换层析)进行纯化。
[0130]
在一些实施方案中，比起在不存在5-硫代-l-岩藻糖的情况下生产的抗体或抗体衍生物，通过本发明的方法生产的抗体或抗体衍生物具有更高的效应子功能(例如adcc活性)。adcc活性可以使用本领域已知的测定来测量，并且在示例性实施方案中，与核心岩藻糖基化的亲本抗体相比，adcc活性增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。
[0131]
5-硫代-l-岩藻糖和/或其衍生物特别适合于修饰核心岩藻糖基化，因为它们通常对细胞性能(vcd和滴度)没有显著影响。通过本发明的方法生产的抗体的糖基化模式显示，有时核心岩藻糖基化减少，由此发生较少的总体核心岩藻糖基化，并且有时核心岩藻糖基化由于其被硫代岩藻糖基化替代而减少。有时可以同时观察到两种作用。通常，通过使用增加量的5-硫代-l-岩藻糖可以降低岩藻糖基化水平，并且平行地，通过使用增加量的5-硫代-l-岩藻糖来增加5-硫代-l-岩藻糖的掺入，由此所述作用不完全反平行，使得无岩藻糖基化以及硫代岩藻糖基化可以通过仔细选择加入到细胞培养物中的5-硫代-l-岩藻糖的浓度来修饰。
[0132]
与已知的抑制剂2f-全乙酰基岩藻糖相比，5-硫代-l-岩藻糖显示更高的效率。如在实施例4中所见，与对照相比，在第7、10和12天，用5-硫代-l-岩藻糖处理的抗体的生产分别显示岩藻糖基化降低64%、68%和67%。相比之下，加入相同浓度的2f-全乙酰基岩藻糖(一种已知的岩藻糖类似物)，在第7天、第10天和第12天分别仅能够实现降低11%、50%和58%。
[0133]
可以进一步显示，用包含5-硫代-l-岩藻糖的培养基使用本发明的方法生产的抗体对其受体显示更高的结合亲和力。
[0134]
通过以下附图和实施例来进一步说明本发明，然而，本发明不限于此。
[0135]
以上和以下引用的所有申请、专利和出版物以及在2019年12月19日提交的相应的ep 19218172.5的全部公开内容通过引用并入本文。
实施例
[0136]
以下实施例代表本发明的实际应用。
[0137]
实施例1：在5-硫代-l-岩藻糖存在下重组蛋白的表达。
[0138]
使用常见的补料分批方法来确定5-硫代-l-岩藻糖(图1)对重组蛋白的糖基化谱的作用。测试表达三种不同的单克隆抗体(mab)和融合蛋白的四种不同的中国仓鼠卵巢(cho)细胞克隆。将细胞在旋转管中于37℃、5% co2和80%湿度下培养14-20天之间。作为起始细胞密度，将在30 ml cellvento
®
4 cho培养基(ph 7.0
±
0.1)中的3
×
105个细胞/ml用于分别生产mab1和mab2的克隆1和2 (cellvento
®ꢀ
platform)。细胞以320 rpm的搅动速率培养，并在第3、5、10、12和14天用3体积%的cellvento
®ꢀ
4feed (v/v)饲养，并在第7天用6% (v/v)的补料饲养。生产mab3和融合蛋白的克隆3和4以相同的细胞密度接种在30 ml ex-cell
®ꢀ
advanced media (ph 7.2
±
0.1)中，同时搅动设定为230 rpm。在第3、5、7、10、12、14和17天，用5% ex-cell
®ꢀ
advanced feed (v/v)饲养克隆3和4。用400 μm 5-硫代-l-岩藻糖、400
ꢀµ
m乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、400 μm乙酰的化2f-岩藻糖作为阳性对照，或者用相应量的dmso (1.17%)作为两种乙酰化的岩藻糖类似物的溶剂补充补料。将所有cellvento
®
补料的ph调节至7.0
±
0.1，并将ex-cell
®ꢀ
feed的ph调节至8.5
±
0.1。
[0139]
通过在一周期间根据需要加入特定量的400 g/l葡萄糖储备溶液到至多6 g/l，并经周末到至多13 g/l，使葡萄糖水平保持在高于4 g/l。用生物过程分析仪cedex bio ht (roche, mannheim, germany)基于分光光度法和浊度法检测上清液中的葡萄糖和滴度。用vi-cell
™ꢀ
xr 2.04细胞计数器(beckman coulter, fullerton, ca, usa)评价活细胞密度(vcd)和生存力。
[0140]
通常，将5-硫代-l-岩藻糖处理与没有任何补充的对照条件进行比较。将乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖与已知的阳性对照2f-全乙酰基岩藻糖和用于溶解两种乙酰化的岩藻糖类似物的dmso对照进行比较。
[0141]
如在图2-5中所示，在四个生物学重复中，当与两个对照条件和阳性对照比较时，具有或不具有乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖处理显示对这四个研究的cho细胞系的细胞性能(vcd和滴度)没有显著影响。在用于mab2和mab3的两个平台中检测到轻微的变化。与未补充的对照相比，mab2的生产导致在所有条件下第12天后滴度略微降低。在第17天，分别用5-硫代-l-岩藻糖处理和dmso对照将对照中2.18 g/l的滴度降低至2.02 g/l和1.99 g/l。用乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖检测到进一步减少至1.82 g/l，到与阳性对照2f-全乙酰基岩藻糖(1.78g/l)相似的水平。由于两种全乙酰化的岩藻糖类似物都溶解于dmso中，降低的滴度部分是由于溶剂。
[0142]
对于mab3的生产，通过计算直到第17天的曲线下面积(与对照相比)，对于5-硫代-l-岩藻糖和乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖检测到约13%和24%的降低的vcd。dmso对照显示类似的13%的减少，指示乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖的溶剂最可能导致vcd的进一步减少。由于降低的vcd不影响滴度(2.25 g/l至2.33 g/l)，认为其在实验的生物可变性范围内。
[0143]
实施例2：将5-硫代-l-岩藻糖掺入聚糖结构中
将在对照补料分批中生产的重组蛋白的糖基化谱与在补充有岩藻糖类似物的补料分批方法中获得的谱进行比较。使用蛋白a phytips
®ꢀ
(phynexus inc, san jose, ca)从细胞培养物上清液中纯化抗体。
[0144]
通过与质谱仪偶联的超高效液相色谱法(uplc-ms)分析糖基化模式。将纯化的抗体变性，并且通过用肽n-糖苷酶f (pngase f)消化从抗体中释放聚糖，然后根据制造商的方案用glycoworks
™ꢀ
rapifluor-ms
™ꢀ
n-聚糖试剂盒标记聚糖。为了分析，使用uplc聚糖柱(2.1
×
150 mm)，其根据聚糖的疏水性分离聚糖。在45℃下用50 mm甲酸铵(a) (ph 4.4)溶液和乙腈(b)梯度进行层析。详细地，在开始时，a:b的比率为20:80 (0分钟)，并且以0.5 ml/min的流速，在3分钟时变为27:73，并且在35分钟时变为37:63。从36.5分钟到39.5分钟，仅使用a作为流动相，流速降低到0.2 ml/分钟。随后，将该比率变为20% a:80% b，并且流速在43.1分钟时增加到0.5 ml/min，直到过程在55分钟时结束。用激发波长为265 nm且发射波长为425 nm的荧光检测器进行检测。聚糖结构的鉴定通过使用正电喷雾电离(esi)的ms进行，每30 s用标准物校准。
[0145]
通过保留时间位移、质量位移和断裂模式鉴定含有非天然5-硫代-l-岩藻糖的聚糖。约 16 da的质量位移由岩藻糖(164.0684 g/mol)中的环氧与硫代-l-岩藻糖衍生物中的硫交换引起，导致5-硫代-l-岩藻糖衍生物的理论质量为180.0455 g/mol。该质量类似于半乳糖的质量(180.0633 g/mol)，但可以通过更高分辨率的质谱仪(质量差115 ppm)区分。
[0146]
此外，使用lc-ms/ms获得片段光谱。含有硫代岩藻糖的聚糖的断裂模式与相应的岩藻糖基化的聚糖断裂模式相似，但对于每个含有岩藻糖的聚糖片段是不同的。例如，rapifluor-glcnac-fuc片段的理论质量为679.3304 g/mol，而rapifluor glcnac-thiofuc的理论质量为695.3076 g/mol。该差异使得可以明确鉴定糖结构(图6，a岩藻糖基化的g0f，b硫代岩藻糖基化的g0thiof和c g1断裂模式)。
[0147]
另外，硫代岩藻糖基化的聚糖的保留时间可以与岩藻糖基化的聚糖区分开。在图7中，显示用800
ꢀµ
m 5-硫代-l-岩藻糖处理的mab的荧光峰保留时间的示例性位移。在17.19分钟时检测到硫代岩藻糖基化的g0f峰，而在17.38分钟时发生g0峰洗脱。硫代岩藻糖基化的g1f同种型峰的分离可以在20.88分钟和21.52分钟观察到，相比之下，两种岩藻糖基化的g1f同种型的保留时间为22.81分钟和23.51分钟。总之，该数据证实聚糖结构中5-硫代-l-岩藻糖对核心岩藻糖基化的替换。
[0148]
图7显示在使用uplc分离释放的、标记的聚糖之后获得的荧光信号，显示与岩藻糖基化的聚糖相比对应于硫代岩藻糖基化的聚糖的峰的改变的保留时间。
[0149]
实施例3：通过掺入5-硫代-l-岩藻糖，5-硫代-l-岩藻糖可以减少岩藻糖基化。
[0150]
使用常见的补料分批方法来确定5-硫代-l-岩藻糖对糖基化谱的影响。测试表达三种不同的单克隆抗体(mab)和融合蛋白的四种不同的中国仓鼠卵巢(cho)细胞克隆。将细胞在旋转管中于37℃、5% co2和80%湿度下培养14-20天之间。作为起始细胞密度，将在30 ml cellvento
®
4 cho培养基(ph 7.0
±
0.1)中的3
×
105个细胞/ml用于分别生产mab1和mab2的克隆1和2 (cellvento
®ꢀ
platform)。细胞以320 rpm的搅动培养，并在第3、5、10、12和14天用3体积%的cellvento
®ꢀ
4feed (v/v)饲养，并在第7天用6% (v/v)的补料饲养。生产mab3和融合蛋白的克隆3和4以相同的细胞密度接种在30 ml ex-cell
®ꢀ
advanced media (ph 7.2
±
0.1)中，同时搅动设定为230 rpm (ex-cell
®ꢀ
platform)。在第3、5、7、
10、12、14和17天，用5% ex-cell
®ꢀ
advanced feed (v/v)饲养克隆3和4。用400 μm 5-硫代-l-岩藻糖、400
ꢀµ
m乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖、400 μm乙酰的化2f-岩藻糖作为阳性对照，或者用相应量的dmso (1.17%)作为两种乙酰化的岩藻糖类似物的溶剂补充补料。将所有cellvento
®
补料的ph调节至7.0
±
0.1，并将ex-cell
®ꢀ
feed的ph调节至8.5
±
0.1。通过在一周期间根据需要加入特定量的400 g/l葡萄糖储备溶液到至多6 g/l，并经周末到至多13 g/l，使葡萄糖水平保持在高于4 g/l。用生物过程分析仪cedex bio ht (roche, mannheim, germany)检测上清液中的葡萄糖和滴度。
[0151]
为了研究在补料分批实验期间的糖基化谱，离心样品，并使用蛋白a phytips
®ꢀ
(phynexus inc, san jose, ca)从细胞培养上清液中纯化抗体和fc融合蛋白。如通过与质谱仪偶联的超高效液相色谱法(uplc-ms)所述，使用glycoworks
™ꢀ
rapifluor-ms
™ꢀ
n-聚糖试剂盒分析糖基化模式。
[0152]
通常，将有或没有乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖处理与无任何补充的对照条件、与已知的阳性对照2f-全乙酰基岩藻糖和用于溶解两种乙酰化的岩藻糖类似物的dmso对照进行比较。由于在第12天重组生产的蛋白质的收获是常见的，可视化在第12天的糖基化谱。使用荧光信号的相对峰面积获得聚糖的定量。几乎所有峰都根据其质量归于聚糖结构。未进行质量检测的未知聚糖结构和信号概括为未知种类(未显示)。
[0153]
测试了表达三种不同的单克隆抗体(mab)和融合蛋白的四种不同的中国仓鼠卵巢(cho)细胞克隆。在所有生产不同的重组蛋白的测试的细胞系中，通过5-硫代-l-岩藻糖处理有效减少核心-岩藻糖基化。
[0154]
通过岩藻糖类似物的高度掺入，克隆1中生产的mab1由5-硫代-l-岩藻糖实现了降低的岩藻糖基化。与对照中94%的核心-岩藻糖基化的聚糖相比，在第12天，加入400 μm的具有或不具有乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖导致核心-岩藻糖基化的聚糖减少至约26% (图8a)。加入相同浓度的乙酰化的2f-岩藻糖(一种已知的减少岩藻糖基化的岩藻糖类似物)，在第12天效率较低，导致36%的核心-岩藻糖基化。与乙酰化的2f-岩藻糖相比，通过高度掺入5-硫代-l-岩藻糖至约70%的聚糖，天然岩藻糖基化通过5-硫代-l-岩藻糖实现减少，而与乙酰化无关。与对照和5-硫代-l-岩藻糖(5%)相比，在第12天，乙酰化的2f-岩藻糖仅使无岩藻糖基化增加至60%。
[0155]
与对照中77%岩藻糖基化相比，在有或没有乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖处理后第12天，mab2的生产导致8%核心-岩藻糖基化(图8b)。与其无岩藻糖基化水平不响应5-硫代-l-岩藻糖处理而改变的mab1相反，通过32%掺入5-硫代-l-岩藻糖和60%无岩藻糖基化，mab2的岩藻糖基化实现降低(与之相比，对照条件中为20%)。通过将无岩藻糖基化提高至78%，已知的阳性对照在第12天实现14%的岩藻糖基化水平。
[0156]
与已知的岩藻糖类似物乙酰化的2f-岩藻糖相比，通过表达mab3的克隆3仅实现相同量的无岩藻糖基化，在第12天导致约34%的无岩藻糖基化(图8c)。掺入43%的5-硫代-l-岩藻糖导致21%的较低的岩藻糖化水平，相比之下，在第12天，对照中为90%，并且阳性对照中为65%。
[0157]
在第12天，在克隆4中生产的融合蛋白中观察到与mab2类似的糖基化模式(图8d)。与对照相比，通过有或没有乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖处理，核心-岩藻糖基化降低约63%。对于两者，5-硫代-l-岩藻糖掺入在39%的聚糖中观察到，并且52%是无岩藻糖基化的。阳性
对照达到82%的无岩藻糖基化，没有可检测的岩藻糖类似物的掺入。
[0158]
总之，在第12天，对于mab2、融合蛋白、mab3和mab1，分别检测到增加量的掺入的5-硫代-l-岩藻糖，为约32%、39%、43%和70%。
[0159]
对于mab1、mab3、融合蛋白和mab2，检测到增加量的无岩藻糖基化，为约5%、34%、52%和60%。
[0160]
图8显示使用生产(a) mab1、(b) mab2、(c) mab3和(d)融合蛋白的cho细胞系，5-硫代-l-岩藻糖对岩藻糖基化谱的影响。数据表示在第12天时两个生物学重复的平均值
±
sem。
[0161]
实施例4：与加入2f-全乙酰基岩藻糖相比，向过程中加入5-硫代-l-岩藻糖导致岩藻糖基化的更快减少。
[0162]
为了鉴定5-硫代-l-岩藻糖补充影响重组生产的蛋白质的糖基化谱所需的时间，研究了在补料分批期间的不同时间点采集的样品。在第5、7、10、12和14天收集其中细胞生存力高于60%的样品。离心后，使用蛋白a phytips
®ꢀ
(phynexus inc, san jose, ca)从细胞培养上清液中纯化抗体和fc融合蛋白。如通过与质谱仪偶联的超高效液相色谱法(uplc-ms)所述，使用glycoworks
™ꢀ
rapifluor-ms
™ꢀ
n-聚糖试剂盒分析糖基化模式。
[0163]
在补料分批实验期间对聚糖谱的早期研究指示5-硫代-l-岩藻糖的高效率。与对照相比，在第7、10和12天，用5-硫代-l-岩藻糖处理的mab1生产分别显示岩藻糖基化降低64%、68%和67%。相比之下，加入相同浓度的2f-全乙酰基岩藻糖(一种已知的岩藻糖类似物)在第7天、第10天和第12天仅能够分别实现降低11%、50%和58%。这指示与已知的抑制剂2f-全乙酰基岩藻糖相比，5-硫代-l-岩藻糖的效率更高。
[0164]
为了在补料分批中较早地检测5-硫代-l-岩藻糖的影响，在第5天另外研究mab3的糖基化谱。在第5天用400 μm 5-硫代-l-岩藻糖处理获得的检测的岩藻糖基化水平已经在约48%的低水平，而在第5天400 μm乙酰化的2f-岩藻糖导致约84%的岩藻糖基化，与在对照中检测的具有87%岩藻糖基化的水平相似。在第7、10、12和14天，对照的岩藻糖基化水平恒定在87%至90%之间，由此5-硫代-l-岩藻糖处理将核心-岩藻糖基化分别降低至约34%、25%、21%和18%。相比之下，在第7、10、12和14天，已知的抑制剂乙酰化的2f-岩藻糖仅分别显示岩藻糖基化水平降低至约78%、72%、65%和57%。因此，5-硫代-l-岩藻糖可能有利于以短培养时间应用，如分批或灌注方法。此外，可以应用减少量或不同的补料方案来减少通过该方法加入的岩藻糖衍生物的需要量或滴定岩藻糖化水平。
[0165]
图9显示在生产(a) mab1或(b) mab3的补料分批实验期间5-硫代-l-岩藻糖的加速作用。数据代表两个生物学重复的平均值
±
sem。
[0166]
实施例5：增加5-硫代-l-岩藻糖的浓度导致更高的掺入。
[0167]
用两个平台和生产mab1或mab3的两个不同的cho克隆研究在补料分批期间通过加入5-硫代-l-岩藻糖实现不同的岩藻糖基化水平的能力。
[0168]
将细胞在旋转管中于37℃、5% co2和80%湿度下培养14-20天之间。作为起始细胞密度，在30 ml cellvento
®
4 cho培养基(ph 7.0
±
0.1)中的3
×
105个细胞/ml用于生产mab1的克隆1 (cellvento
®ꢀ
platform)。细胞以320 rpm的搅动培养，并在第3、5、10、12和14天用3体积%的cellvento
®ꢀ
4feed (v/v)饲养，并在第7天用6% (v/v)的补料饲养。生产mab3的克隆3以相同的细胞密度接种在30 ml ex-cell
®ꢀ
advanced media (ph 7.2
±
0.1)
中，同时搅动设定为230 rpm (ex-cell
®ꢀ
platform)。在第3、5、7、10、12、14和17天，用5% ex-cell
®ꢀ
advanced feed (v/v)饲养克隆3。
[0169]
补料补充有增加浓度的5-硫代-l-岩藻糖、乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖或用作乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖的溶剂的相应量的dmso (1.17%)。将所有cellvento
®
补料的ph调节至7.0
±
0.1，并将ex-cell
®ꢀ
feed的ph调节至8.5
±
0.1。通过在一周期间根据需要加入特定量的400 g/l葡萄糖储备溶液到至多6 g/l，并经周末到至多13 g/l，使葡萄糖水平保持在高于4 g/l。用生物过程分析仪cedex bio ht (roche, mannheim, germany)检测上清液中的葡萄糖和滴度。
[0170]
用200、400和800 μm乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖进行生产mab1的克隆1的剂量反应(图10a)。在第7、10和12天研究糖基化谱。由于随着时间的推移仅检测到微小的变化，所生产的igg的聚糖结构以所有三天的平均值呈现。数据指示通过分别加入200 μm、400 μm和800 μm乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖，非天然岩藻糖类似物的掺入从50%增加至81%和87%。从而，与两种对照条件(包括1.17% dmso作为乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖的溶剂)中的96%岩藻糖基化相比，岩藻糖基化水平降低至46%、16%和9%。
[0171]
此外，研究了增加浓度的5-硫代-l-岩藻糖对生产mab3的克隆3的影响。从50 μm至800 μm的浓度的5-硫代-l-岩藻糖产生增加量的掺入的5-硫代-l-岩藻糖以及增加量的无岩藻糖基化。在第12天，800 μm 5-硫代-l-岩藻糖的最高施用浓度导致约36%的无岩藻糖基化，并且约48%掺入的岩藻糖类似物导致约15%的剩余天然岩藻糖基化的聚糖。因此，当与对照相比时，在第12天，加入800 μm 5-硫代-l-岩藻糖能够将岩藻糖基化降低约75%。浓度逐渐降低至400 μm、200 μm和50 μm 5-硫代-l-岩藻糖导致在第12天岩藻糖类似物的掺入分别减少约44%、36%和11%。该数据指示，通过仔细选择浓度，可以规定掺入5-硫代-l-岩藻糖的目标量。
[0172]
图10显示5-硫代-l-岩藻糖对糖基化谱的剂量反应。(a)乙酰化的5-硫代-l-岩藻糖对生产mab1的cho细胞系的影响。数据代表第7、10和12天的平均值
±
sem。(b) 5-硫代-l-岩藻糖对生产mab3的cho细胞系的影响。数据代表第12天两次生物学重复的平均值
±
sem。
[0173]
实施例6：5-硫代-l-岩藻糖处理对fcγriiia结合的影响本部分的目的是研究在含有硫代岩藻糖的方法中生产的抗体是否对fcγriiia呈现更高的结合亲和力并因此潜在地增加的adcc。
[0174]
实际上，在文献中描述了无岩藻糖基化的抗体与fcγriiia的增加的结合和从而增强的adcc活性。已知fcγriiia在158位上具有苯丙氨酸(f158)或缬氨酸(v158)残基的两种同种型。据报道，与f同种型相比，后一同种型对igg1具有更高的亲和力，并用于这些研究。
[0175]
使用biacore t200系统(ge healthcare, uppsala, sweden)，通过表面等离子体共振技术研究在5-thiofuc处理后样品的结合。分析温度设定为25℃，并且样品隔室温度设定为15℃。使用来自ge healthcare的his捕获试剂盒，根据制造商的说明书，在活性和参比流动池中，使用s系列传感器芯片cm 5偶联抗his抗体。对于所有实验，固定化水平在12185
±
436共振单位(ru；1 ru≈1 pg/mm2)的范围内。抗his抗体进一步用于捕获来自acrobiosystems (newark, de, usa)的his-标记的fcγriiia v176 (cd8-h52h4)。受体在hek293细胞中表达，并将0.011 μg/ml以10 μl/min的流速注射到活性流动池中60 s，导致
4.5
±
0.2 ru的捕获水平。随后，mab3以30 μl/min的流速注射150 s，在参比和活性流动池中五种浓度增加，范围为1.9、5.6、16.7、50、150和450 nm。连续记录结合，同时自动减去非特异性结合和注射假象。使用单循环动力学，解离时间为600s，流速为30 μl/min。数据收集速率在10 hz下进行。在每个实验后，根据试剂盒说明书，用10 mm甘氨酸-hcl (ph 1.5)将两个流动池再生30 s。用1:1结合模型拟合三个技术重复和两个生物学重复的数据。由解离动力学速率常数(kd)和结合动力学速率常数(ka)值的比率确定总解离常数kd。数据作为与对照相比的倍数变化呈现在表1中。
[0176]
用增加浓度的5-硫代-l-岩藻糖处理的细胞生产对fcγriiia具有增加的亲和力的抗体。与对照相比，用50
ꢀµ
m 5-硫代-l-岩藻糖或400
ꢀµ
m 2f-peracfuc处理的样品从第5天实现1.2和1.3倍增强的结合。与对照相比，用200、400和800 μm 5-硫代-l-岩藻糖处理的样品在第5天显示亲和力分别增加2.0、2.9和2.6倍。在稍后的时间点，对于所有处理的样品观察到对fcγriiia增加的亲和力。在第12天，用50、200、400和800 μm 5-硫代-l-岩藻糖处理分别检测到2.0、3.1、3.8和4.8倍的增加的亲和力。由注射相同浓度系列的对照和处理的抗体得到的传感图(图11)说明与对照相比，在第12天，通过用5-硫代-l-岩藻糖处理的抗体的更高的应答的更高的亲和力。另外，与400 μm 2f-peracfuc (一种已知的抑制剂)相比，用400 μm 5-硫代-l-岩藻糖处理显示稍微更高的结合亲和力，导致亲和力增加3.6倍。在第14天，由于相似的糖基化模式，处理的样品显示与第12天相比相似的kd值。通过5-硫代-l-岩藻糖处理，在50、200、400和800 μm分别检测到1.7、3.6、4.1和4.5倍的增强的结合。
[0177]
表1：在第5天(a)、12天(b)和14天(c)，5-硫代-l-岩藻糖处理对mab3与fcγriiia亲和力的影响。数据代表两个生物学重复。
[0178]
图11显示在第12天结合mab3对照(黑色)或结合5-硫代-l-岩藻糖处理的mab3 (灰色)的fcγriiia的重叠图。传感图显示浓度系列为6-486 nm时与捕获的fcγriiia的结合水平(n =3)。所有的传感图都是双重参照的。