姜源性细胞外囊泡及其用途

1.本公开涉及源自姜(zingiber officinale)的细胞外囊泡及其用途。


背景技术：

2.癌症是人类需要克服的无法治愈的疾病之一，并且在全球范围内，巨额资金被投入癌症治疗的开发中。在韩国，这是自1983年以来韩国人死亡的第一大原因，每年有超过100,000人确诊，而有超过60,000人死亡。
3.特别是，自1999年以来，韩国女性的乳腺癌发病率持续增加，并且在2015年，乳腺癌在癌症发病率中排名第一，超过过去作为女性中的主要癌症的甲状腺癌。乳腺癌通过经由淋巴结或血管从原发部位容易地迁移到其它部位，具有转移形成继发性癌症的能力，并且特别众所周知的是，乳腺癌选择性地转移至骨骼或肺，从而使转移性乳腺癌患者即使进行手术和各种疗法也难以得到改善。由于最近的医疗发展，各种方法(例如手术治疗、放射治疗和化学疗法)已得到改善，确保乳腺癌的5年相对存活率达92.7％。尽管存活率高，但由于对复发的担忧以及患者在治疗期间经历的身体症状和社会心理症状，患者的生活质量可能恶化。
4.由于在发作时费力的治疗方法以及治疗后生活质量的恶化，人们对开发副作用较少、同时使人体疼痛最小化的癌症预防和治疗疗法的兴趣增加，所述方法不同于常规的化学疗法(用抗癌药物进行治疗)、手术治疗(例如部分乳房切除术(保乳手术)和全乳房切除术)和放射疗法(使用高能放射线治疗肿瘤)。因此，存在对植物源性的天然物质的很多兴趣，这些物质可易于从自然中获得、具有较少副作用并有效地治疗癌症。
5.细胞外囊泡(ev)是在细胞活动过程中形成的物质，并且也称为纳米囊泡，尺寸为1/109m。细胞外囊泡分为三组：外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体的起源是内吞途径，尺寸为30nm-100nm，并且可以在多细胞真核生物体的体液(例如血液和尿液)和真核细胞培养基中观察到。微囊泡的起源是质膜，并且其尺寸为50nm-1,000nm。凋亡小体的起源也是质膜，并且其尺寸为500nm-2,000nm。正在使用纳米囊泡进行各种临床研究，例如疾病的诊断、预后和治疗。
6.最近，有报道称纳米囊泡从食物中分泌，而在它们之中，已报道姜中的外泌体样纳米颗粒的抗炎作用，但抗癌作用尚未报道。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本公开的目的是提供源自天然产物的细胞外囊泡。
9.本公开的另一目的是提供包含所述细胞外囊泡的抗癌组合物。
10.本公开的另一目的是提供生产所述细胞外囊泡的方法。
11.技术方案
12.为了实现上述目的，本公开的示例实施方式提供了细胞外囊泡，所述细胞外囊泡
源自姜(zingiber officinale)并具有抗癌活性。
13.本公开的示例实施方式提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含所述细胞外囊泡作为活性成分。
14.本公开的示例实施方式提供了用于预防或改善癌症的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含所述细胞外囊泡作为活性成分。
15.此外，本公开的示例实施方式还提供了生产姜源性细胞外囊泡的方法，所述方法包括：制备磨碎的姜；将经制备的磨碎的姜以250g至750g进行第一离心5分钟至15分钟；将通过第一离心获得的上清液以1,000g至3,000g进行第二离心10分钟到30分钟；将通过第二离心获得的上清液以5,000g至15,000g进行第三离心15分钟至45分钟；以及，将通过第三离心获得的上清液以50,000g至150,000g进行第四离心1小时至3小时，以获得团粒(pellet)。
16.有益效果
17.根据本公开的示例实施方式的姜源性细胞外囊泡可穿透到癌细胞中，并具有出色的抗癌活性，例如有效抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移。因此，可以提供姜源性细胞外囊泡作为用于预防、改善或治疗癌症疾病的药物组合物或保健功能食品组合物。
18.此外，通过使用根据本公开的示例实施方式的姜源性细胞外囊泡，而非摄入或使用姜本身，可以弥补有关姜特有的刺激性味道和风味的缺点，易于长期存储，并且即使以较少量也可以达到出色的抗癌特性。
附图说明
19.图1示意性地说明了从姜中分离纳米囊泡的方法。
20.图2是根据本公开的实验例对姜纳米囊泡的尺寸进行分析的图。
21.图3是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡浓度的乳腺癌细胞的增殖率的图。
22.图4是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡的浓度的姜纳米囊泡对乳腺癌细胞侵袭的作用的图。
23.图5示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡的浓度的乳腺癌细胞迁移程度。
24.图6是示出了根据本公开的实验例，姜纳米囊泡穿透到乳腺癌细胞中的图。
25.图7是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡浓度的肺癌细胞的增殖率的图。
26.图8示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡浓度的肺癌细胞的迁移程度。
27.图9是根据本公开的实验例，确定姜纳米囊泡的dpph自由基清除能力的图。
具体实施方式
28.在下文中，将对本公开进行详细描述。
29.本发明人通过确定从姜分离的纳米囊泡有效抑制乳腺癌细胞或肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，从而完成了本公开。
30.本公开的示例实施方式提供了具有抗癌活性的细胞外囊泡。
31.所述细胞外囊泡可以源自姜。
32.本文所用的术语“姜”是指属于姜目(zingiberales)姜科(zingiberaceae)的单子叶的多年生植物，并且也是具有黄色块状形状的根茎的药用植物，具有辛辣味道和芳香气味。在东方医学中，干燥的根茎被用作药物，并且已知对治疗以下而言有效：感冒引起的发冷、发烧、头痛、呕吐、慢性咳嗽和粘痰，以及食物中毒引起的腹痛、腹泻和腹胀。
33.姜可以是根茎、叶、花或它们的混合物，并且优选地可使用根茎部分，但不限于此。
34.本文所用的术语“细胞外囊泡(ev)”是指从多种细胞中分泌的小的膜囊泡，代表由于多囊体和质膜融合而被释放到细胞外环境中的囊泡，并且可被定义为纳米囊泡。
35.在本公开中，细胞外囊泡可包括外泌体和微囊泡，但不限于此。
36.细胞外囊泡可以是平均粒径为50nm至300nm的纳米囊泡，并且优选可具有100nm至200nm的平均粒径，但不限于此。
37.在本公开中，可以通过以下方法从姜中分离出细胞外囊泡，例如超速离心、密度梯度离心、超滤、尺寸排阻色谱术、离子交换色谱术、免疫亲和捕获、基于微流控的分离、外泌体沉淀、总外泌体分离试剂盒或基于聚合物的沉淀，但不限于此。
38.优选地，可以通过对姜进行离心来获得细胞外囊泡，并且更优选地，通过以下来获得细胞外囊泡：以250g至750g对磨碎的姜进行第一离心5分钟至15分钟；以1,000g至3,000g对通过第一离心获得的上清液进行第二离心10分钟至30分钟；以5,000g至15,000g对通过第二离心获得的上清液进行第三离心15分钟至45分钟；以及，以50,000g至150,000g对通过第三离心获得的上清液进行第四离心1小时至3小时；并且细胞外囊泡可以是从第四离心获得的离心物中除去上清液的团粒，但不限于此。
39.磨碎的姜可以通过将姜放入磷酸盐缓冲溶液(pbs)中进行研磨，但不限于此。磨碎的姜也可以以姜汁或提取物的形式进行直接制备，或通过购买可商购的磨碎的姜、姜汁或其提取物而获得。
40.由此获得的细胞外囊泡可包含一种或多种酶蛋白，所述酶蛋白选自于由蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶所组成的组，但不限于此。
41.在本公开中，细胞外囊泡可穿透到癌细胞中，并具有抗癌活性以抑制癌细胞的增殖、迁移或侵袭。
42.根据本公开的实验例，证实了细胞外囊泡穿透到乳腺癌细胞或肺癌细胞中，并且还证实了癌细胞的增殖、侵袭和迁移被显著抑制。
43.因此，细胞外囊泡可以作为用于预防或治疗癌症的药物组合物或保健功能食品组合物而被提供。
44.本公开的示例实施方式提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含姜源性细胞外囊泡作为活性成分。
45.该组合物可包含0.001至50重量份的细胞外囊泡，但不限于此。
46.该组合物可以通过穿透到癌细胞中以抑制癌细胞的增殖、迁移或侵袭来预防或治疗癌症。
47.癌症可以是选自于由以下所组成的组中的疾病：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、子宫癌、卵巢癌、喉癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌和血癌，但不限于此。
48.根据本公开的示例实施方式的药物组合物可以根据药学领域的常规方法来制备。
药物组合物可以根据剂型而与药学上可接受的合适的载体结合，并且如果必要，可通过进一步包含赋形剂、稀释剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、粘合剂、崩解剂和溶剂来制备。合适的载体不会使根据本公开的示例实施方式的姜源性细胞外囊泡的活性和性质恶化，并且根据给予类型和剂型而可以进行不同的选择。
49.使用以下作为可包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。当配制组合物时，可将通常使用的稀释剂或赋形剂(诸如填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)用于制剂。
50.根据本公开的示例实施方式的药物组合物可以以任何剂型施用，并且具体来说，可以通过根据常规方法配制成以下剂型使用：口服剂型(例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气溶胶)、外用制剂、栓剂和无菌注射溶液。优选地，其可以通过配制为适合口服给予的单位剂量的剂型来使用。
51.更具体地，口服剂型中的固体剂型处于片剂、丸剂、散剂、颗粒剂和胶囊剂的形式，其通过混合至少一种或多种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、纤维素和明胶)来制备，并且除简单的赋形剂之外，还可以包含润滑剂(例如硬脂酸镁和滑石)。此外，除上述物质外，胶囊剂型可进一步包含液体载体，例如脂肪油。
52.口服剂型中的液体剂型可以是混悬剂、溶液、乳剂和糖浆剂，并且除了作为通常使用的简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包含各种赋形剂(例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂)。
53.作为肠胃外剂型，可以包括无菌水性溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳化剂、注射剂、冷冻干燥剂型和栓剂。作为非水性溶剂和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射酯(诸如油酸乙酯)。可将witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂精和甘油明胶用作栓剂的基础。可以使用本领域熟知的任何合适的试剂，但不限于此。
54.此外，根据本公开的示例实施方式的药物组合物可以进一步添加有抗氧化剂，以增强治疗功效。作为抗氧化剂，可以使用维生素b族中的化合物，例如硫胺(维生素b1)、核黄素(维生素b2)、烟酸(维生素b3)、泛酸(维生素b5)、吡哆醇(维生素b6)和钴胺素(维生素b12)；以及维生素c；维生素d和维生素e，但不限于此，同时可以使用本领域熟知的所有合适的制剂。
55.可以以药学上有效的量给予根据本公开的示例实施方式的药物组合物。
56.本文使用的术语“药学上有效的量”是指足以以适用于医学治疗的合理的收益/风险比治疗疾病而同时又不引起副作用的量。
57.取决于使用的目的、患者的年龄、性别、重量和健康状况、疾病的类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给予方法、给予持续时间、给予途径和排泄率、治疗期、包括混合或组合使用的药物在内的要素、以及在医学领域中众所周知的其它因素，可以不同地确定药物组合物的有效剂量水平。例如，尽管不是恒定的，但通常0.001mg/kg至100mg/kg、优选0.01mg/kg至10mg/kg可以每天给予一次或多次。上述剂量不以任何方式限制本公开的范围。
58.可以向可发展出癌症的任何动物给予根据本公开的示例实施方式的药物组合物，并且例如所述动物不仅可包括人类和灵长类动物，还可包括家畜，例如牛、猪、马和犬。
59.可以依据剂型的类型以合适的给予途径给予所述药物组合物，并且只要能够到达目标组织，可以通过各种途径(口服或肠胃外)进行给予。给予方法不受特别的限制，并且可以以常规方法进行，例如口服、直肠或静脉内、肌肉、皮肤施用、呼吸吸入、子宫内、硬脑膜或脑室内注射。
60.根据本公开的示例实施方式的药物组合物可以单独使用、或与手术或其它药物治疗组合使用以用于预防或治疗癌症。
61.本公开的示例实施方式提供了用于预防或改善癌症的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含姜源性细胞外囊泡作为活性成分。
62.该组合物可以通过穿透到癌细胞中以抑制癌细胞的增殖、迁移或侵袭来预防或改善癌症。
63.癌症可以是选自于由以下所组成的组中的疾病：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、子宫癌、卵巢癌、喉癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌和血癌，但不限于此。
64.相应的特征可以代替上述部分。
65.本文所用的术语“保健功能食品”是指具有高的医疗、临床效果的食品，其包括使用根据韩国保健功能食品法第6727号的具有对人体有用的功能性的成分或原材料制造和加工的食品，并且除营养供给外，所述食品还经加工以有效地产生用于本公开的目的的生物调节功能，例如癌症的预防、改善、机体防御、免疫力和恢复。
66.出于预防或改善癌症的目的，根据本公开的示例实施方式的保健功能食品可以以粉末、颗粒、片状物、胶囊、糖浆或饮料的形式制备。对保健功能食品可采用的形式无限制，并且保健功能食品可以按与药物组合物相同的方式进行配制，以便用作功能性食品或被添加到各种食品中。
67.保健功能食品可包括传统意义上的任何食品。例如，可以是饮料和各种饮品、水果及其加工食品(罐头水果和果酱)、鱼、肉及其加工食品(火腿和培根)、面包和面条、饼干和小吃以及乳制品(黄油和奶酪)，并且可以包括传统意义上的所有功能食品。还可包括用作动物饲料的食品。
68.根据本公开的示例实施方式的保健功能食品可通过进一步包括在食品科学中可接受的食品添加剂以及在本领域中常用的其它合适的辅料成分而被制备。除非另有规定，可以通过根据由韩国食品和药物安全部批准的韩国食品添加剂法典(korean food additives codex)的通用规则和通用测试方法的相应项目相关的标准和准则来确定作为食品添加剂的适用性。“韩国食品添加剂法典”中列出的项目可包括化学物质，例如酮、甘氨酸、柠檬酸钙、烟酸和肉桂酸等；天然添加剂，例如柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素和瓜尔胶；以及混合制剂，例如l-谷氨酸钠制剂、面条添加的碱剂、防腐剂制剂和焦油色制剂等。
69.其它辅料成分可另外包括例如调味剂、天然碳水化合物、甜味剂、维生素、电解质、着色剂、果胶酸、海藻酸、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸化剂。特别地，可将单糖(例如葡萄糖和果糖)、二糖(例如麦芽糖和蔗糖)、多糖(例如糊
精和环糊精)以及糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)用作天然碳水化合物，并且可将天然甜味剂(例如索马甜和甜叶菊提取物)或合成甜味剂(例如糖精和阿斯巴甜)用作甜味剂。
70.在根据本公开的示例实施方式的保健功能食品中包含的细胞外囊泡的有效剂量可以根据其使用的目的(例如预防或改善癌症)进行适当调整。
71.通过使用食物作为原料，保健功能食品组合物不会导致在普通药物的长期给予期间可能产生的副作用，并且可以由于良好的便携性而被采用作为预防或改善癌症的佐剂。
72.此外，本公开的示例实施方式提供了生产姜源性细胞外囊泡的方法。
73.此外，该生产方法包括：制备磨碎的姜；将经制备的磨碎的姜以250g至750g进行第一离心5分钟至15分钟；将通过第一离心获得的上清液以1,000g至3,000g进行第二离心10分钟至30分钟；将第二离心获得的上清液以5,000g至15,000g进行第三离心15分钟至45分钟；以及，将第三离心获得的上清液以50,000g至150,000g进行第四离心1小时至3小时，以获得团粒。
74.在该生产方法中，可以通过清洗姜，然后在磷酸盐缓冲溶液(pbs)中研磨或挤压姜来进行磨碎的姜的制备。
75.在该生产方法中，第一离心至第四离心可以进行一次，或重复地进行两次以上，并且尤其是第三离心可以进行一次或重复地进行两次至五次，但不限于此。
76.该生产方法可进一步包括至少一个阶段的离心。
77.根据本公开的实验例，姜源性细胞外囊泡通过经历以下进行制备：第一离心，所述第一离心以500g进行一次，持续10分钟；第二离心，所述第二离心使用第一离心中获得的上清液以2,000g进行一次，持续20分钟；第三离心，所述第三离心使用第二离心中获得的上清液以10,000g进行两次，各持续30分钟；以及第四离心，所述第四离心使用第三离心中获得的上清液以100,000g进行一次，持续2小时。
78.通过如上所述的生产方法，可以有效地获得表现出出色的抗癌活性和均匀的粒径的高纯度的姜源性细胞外囊泡。
79.此外，除了离心方法外，生产方法还可涉及使用超滤、尺寸排阻色谱术、离子交换色谱术、免疫亲和捕获、基于微流控的分离、外泌体沉淀、总外泌体分离试剂盒或基于聚合物的沉淀，但不限于此。生产方法可以通过进一步包含本领域熟知的分离或纯化方法而被实施。
80.实施例
81.下文中，将对实施例进行详细描述，以帮助理解本公开。但是，以下实施例仅是本公开内容的说明，而本公开的范围不限于以下实施例。提供本公开的实施例以向本领域技术人员更完整地解释本公开。
82.实验例1：从姜分离的纳米囊泡的表征
83.实验方法
84.1.从姜分离纳米囊泡
85.在本公开的实验例中使用的姜收获自andong，庆尚北道，并购买自韩国农协(nonghyup)。将购买的姜用干净的水洗涤，使得无污垢留在其上。洗涤后，将姜的皮除去，并将150g姜和500ml的1
×
磷酸缓冲盐水(pbs)放入搅拌器并研磨5分钟。将先前磨碎的姜装在
50ml锥形管中，每个体积50ml。
86.图1示意性地说明了从姜中分离纳米囊泡的方法。提及此处，重量被不断调整，使用离心机以500g进行一次离心，持续10分钟，并将上清液转移到新的50ml锥形管中，以将其以2,000g离心一次，持续20分钟。然后，将上清液转移到新的50ml锥形管中，以将其以10,000g离心两次，各持续30分钟，并将上清液再次放入新管中，以100,000g离心两小时。将上清液弃去，并将剩余的纳米囊泡团粒干燥并溶解在1ml的1
×
pbs中。
87.2.纳米颗粒追踪分析(nta)
88.使用malvern的nanosight对从姜分离的细胞外囊泡(ev)进行分析。在纳米颗粒追踪分析(nta)中，在液体悬浮液中对直径在50nm至1000nm范围内的特定纳米囊泡的尺寸和浓度进行测量。
89.3.姜纳米囊泡蛋白的定量
90.在1
×
ripa溶液中粉碎后，通过二喹啉甲酸(bca，termo fishers)方法对姜纳米囊泡蛋白进行定量。
91.4.乳腺癌细胞和肺癌细胞的培养
92.mda-mb-231乳腺癌细胞和nci-h460肺癌细胞获得自atcc细胞系。通过添加用于培养的dmem培养基、10％胎牛血清和1％抗生素，将细胞在5％co2存在的情况于37℃在培养箱中进行培养。每2-3天对细胞更换培养基。
93.5.细胞增殖测定(mtt测定)
94.将mda-mb-231乳腺癌细胞和nci-h460肺癌细胞分别放置在96孔板中，以使每个孔的细胞数量为2.5
×
104个细胞/ml，并在dmem生长培养基中培养约24小时，使细胞能够附着至板。然后，移除生长培养基，并在0、10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的浓度条件下(对于肺癌细胞为0、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的浓度条件)对姜纳米囊泡进行处理。在保持5％co2、37℃的培养箱中进行培养约24小时。此后，加入溶液并留在37℃的培养箱中2小时，所述溶液通过将2mg/ml mtt溶解在每孔40μl pbs中而得到。接下来，移除mtt溶液，并通过每孔加入100μl二甲基亚砜(dmso)来将所形成的甲臜溶解。用elisa-reader(bio-rad laboratories inc.，hercules，ca，usa)在595nm处对完全溶解的甲臜的吸光度进行测量。
95.6.细胞迁移测定
96.将mda-mb-231乳腺癌细胞和nci-h460肺癌细胞以各1ml的体积置于6孔中，并在37℃、5％co2存在的情况下在培养箱中进行培养。细胞受伤后，在显微镜下观察细胞的愈合。
97.7.细胞侵袭测定
98.将悬浮在无血清培养基中的300μl的mda-mb-231乳腺癌细胞置于施加有孔径为8μm的经复水的聚碳酸酯膜的插入物中，并在外腔室上以含有10％fbs的500μl培养基进行处理，其中，在膜的外腔室上产生诱导细胞穿透的富营养环境。以100ng/ml的浓度用血管内皮生长因子(vegf)处理mda-mb-231乳腺癌细胞作为阳性对照，并针对每种浓度以姜纳米囊泡进行处理，然后在37℃下培养24小时。去除未经穿透的细胞后，用细胞染色溶液对外膜上的经穿透的细胞进行染色。对经染色的细胞进行计数。
99.8.基质金属肽酶9(mmp-9)elisa测定
100.通过用酶标记抗体(或抗原)进行mmp-9酶联免疫吸附测定(elisa，r&d system)，
并使用该公司的方案确定酶活性。
101.9.did标记
102.将mda-mb-231乳腺癌细胞以1
×
104个细胞/孔铺在8孔腔室载玻片上，并在dmem生长培养基中培养约24小时。此后，各孔均用did标记的姜纳米囊泡进行处理，并在24小时后去除培养基，随后用pbs洗涤，然后用70％的乙醇处理。在4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色后，用荧光显微镜确定姜纳米囊泡向细胞中的穿透。
103.10.蛋白质组学测定
104.将姜纳米囊泡用胰蛋白酶缓冲液(500ng/μl胰蛋白酶、50mm的碳酸氢铵)进行处理，随后在37℃下反应16小时。通过添加5％甲酸将胰蛋白酶灭活后，使用25mm三乙基碳酸氢铵(teabc)和乙腈(acn)提取肽。使用真空干燥器将提取的肽完全干燥，并且紧临测定之前，将肽溶解在a缓冲液(0.1％甲酸)中，并通过质谱术进行分析。使用mascot distiller将通过质谱术获得的数据转换为峰列表(mgf文件)。使用mascot(matrix science；版本2.2.1)程序，用mgf文件进行蛋白质识别。
105.11.dpph(2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼基)的测量
106.将dpph溶解在乙醇中，并将维生素c溶解在初级蒸馏水中。将维生素c的浓度调节至1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125，并将维生素c与姜纳米囊泡一起放入各96孔。在每个孔中以150μl dpph进行处理后，测量517nm处的吸光度。
107.12.统计处理
108.结果通过三个以上的重复实验获得，并表示为各样品浓度的平均值
±
标准偏差。在各样本浓度组的显著差异测试中，与对照组相比进行学生t检验，并且将p《0.05的值认为是统计学显著的。
109.实验结果
110.1.姜纳米囊泡尺寸的确定
111.图2是根据本公开的实验例对姜纳米囊泡的尺寸进行分析的图。提及此处，作为根据图1分离的姜纳米囊泡的纳米颗粒追踪分析(nta)的结果，确定了直径为168nm的纳米囊泡的尺寸。
112.2.确认姜纳米囊泡对乳腺癌细胞存活的抑制作用
113.图3是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡的浓度的乳腺癌细胞的增殖率的图。
114.为了确认姜纳米囊泡对mda-mb-231乳腺癌细胞存活的作用，以每种浓度进行处理，随后通过mtt测定进行观察。如图3所示，当分别以0、10μg、50μg和100μg的浓度用姜纳米囊泡处理24小时，各浓度的细胞活力为100％、92％、88％和79％，表明与对照组相比，从10μg的浓度起细胞活力以浓度依赖性方式显著降低。
115.因此，已经证实，姜纳米囊泡以10μg以上的浓度诱导mda-mb-231乳腺癌细胞的浓度依赖性凋亡，这与姜纳米囊泡在乳腺癌细胞中以浓度依赖性方式降低细胞活力的结果相同。通过这些结果，可以确认姜纳米囊泡显示出对癌细胞的抑制作用。
116.3.确认姜纳米囊泡对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用
117.图4是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡的浓度的对乳腺癌细胞侵袭的作用的图。提及此处，显示出当分别以0、10μg、50μg和100μg的浓度用姜纳米囊泡处理
24小时，mda-mb-231乳腺癌细胞的侵袭以浓度依赖性方式降低。
118.因此，可以证实，在mda-mb-231乳腺癌细胞中姜纳米囊泡以浓度依赖性方式抑制细胞侵袭。通过这些结果，可以确认姜纳米囊泡显示出对癌细胞的抑制作用。
119.4.确认姜纳米囊泡对乳腺癌细胞迁移的抑制作用
120.图5示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡的浓度的乳腺癌细胞的迁移程度。提及此处，显示出当分别以0、1μg、5μg、10μg、50μg和100μg的浓度用姜纳米囊泡处理24小时，mda-mb-231乳腺癌细胞的迁移以浓度依赖性方式降低。
121.因此，可以证实，姜纳米囊泡以浓度依赖性方式抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的细胞迁移。通过这些结果，可以确认姜纳米囊泡显示出对癌细胞的抑制作用。
122.5.确认姜纳米囊泡对乳腺癌细胞内化的作用
123.图6是示出了根据本发明的实验例的姜纳米囊泡穿透至乳腺癌细胞中的图。提及此处，当以10μg的浓度用姜纳米囊泡处理24小时，鉴别出向mda-mb-231乳腺癌细胞中的穿透。
124.因此，可以确定姜纳米囊泡通过使姜纳米囊泡穿透到mba-md-231乳腺癌细胞中而显示出对癌细胞的抑制作用。
125.6.确认姜纳米囊泡对肺癌细胞存活的抑制作用
126.图7是示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡浓度的肺癌细胞的增殖率的图。
127.为了确认姜纳米囊泡对nci-h460肺癌细胞存活的影响，以每种浓度进行处理，随后通过mtt测定进行观察。如图7所示，当分别以0、1μg、5μg、10μg、50μg和100μg的浓度用姜纳米囊泡处理24小时，与对照组相比，各浓度的细胞活力显示出从5μg的浓度起细胞存活以浓度依赖性方式显著降低。
128.因此，可以证实，姜纳米囊泡在nci-h460肺癌细胞中以5μg以上的浓度诱导浓度依赖性凋亡，这与姜纳米囊泡在肺癌细胞中以浓度依赖性方式降低细胞活力的结果相同。通过这些结果，可以确认姜纳米囊泡显示出对癌细胞的抑制作用。
129.7.确认姜纳米囊泡对肺癌细胞迁移的抑制作用
130.图8示出了根据本公开的实验例，依赖于姜纳米囊泡浓度的肺癌细胞的迁移程度。提及此处，当分别以0、1μg、5μg、10μg、50μg和100μg的浓度用姜纳米囊泡处理24小时，nci-h460肺癌细胞的迁移以浓度依赖性方式降低。
131.因此，可以证实，姜纳米囊泡在nci-h460肺癌细胞中以浓度依赖性方式抑制细胞迁移，并且通过这些结果可以确定姜纳米囊泡显示出对癌细胞的抑制作用。
132.8.姜纳米囊泡的蛋白质鉴别
133.通过姜纳米囊泡的胰蛋白酶消化来制备肽后，进行蛋白质组学测定。结果，在姜纳米囊泡中鉴别出五种蛋白质，如下表1所示。证实了姜纳米囊泡中包含酶蛋白，例如蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶，它是在植物光合作用的能量生产中起着重要作用的酶蛋白。
134.表1
[0135][0136]
9.各浓度的姜纳米囊泡的dpph自由基清除能力
[0137]
图9是根据本公开的实验例，确定姜纳米囊泡的dpph自由基清除能力的图。提及此处，作为以5天的间隔测量dpph自由基的结果，其显示出dpph自由基清除能力每次都降低。
[0138]
因此，可以证实，姜纳米囊泡随着时间而被氧化，并且姜纳米囊泡具有抗氧化功能。另外，在储存姜的方法中，确定分离为纳米囊泡后的储存很重要。
[0139]
尽管上文已经对本发明的特定部分进行详细描述，但对于本领域技术人员而言清楚的是，这些特定的描述仅是优选的示例实施方式，而本发明的范围不限于此。换句话说，本公开的实质范围由所附权利要求书及其等同物所限定。