一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养扩增方法与流程

1.本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养扩增方法。


背景技术：

2.间充质干细胞（mesenchymal stem cells, mscs）是指一类主要来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。自从1960s首次从骨髓中发现以来，脂肪、牙髓、胎盘、脐带等组织中也发现mscs的存在。mscs可以分化为多胚层多类型细胞，用于组织缺损部位细胞更新；并且mscs能够分泌多种生物活性因子，如血管内皮细胞生长因子（vegf）、转化生长因子（tgf-β）、成纤维细胞生长因子（fgf）等，促进损伤部位细胞增殖、分化等，加速组织修复；另外mscs可以分泌γ干扰素（ifn-γ）、白细胞介素（il-6、il-10等）、前列腺素e2（pge2）等抑制b、t、nk等免疫细胞增殖、活化，促进调节性t细胞增殖活化，从而降低免疫，抑制组织炎症反应。因为mscs易体外分离扩增培养、免疫原性低、增殖分化能力强等优点，在再生医学、自身免疫性疾病等领域显示出广阔的应用前景，是细胞治疗的理想种子细胞来源。
3.特别是从人胎盘绒毛膜中分离扩增培养的胎盘间充质干细胞(hp-mscs)，因其来源于临床废弃的孕妇胎盘组织，不存在伦理要求限制，来源广泛，便于采集、保存、运输等。hp-mscs含量丰富，增殖分化能力较成体干细胞强，具有很强的可塑性和分化潜能。并且，hp-mscs低表达hla-dr，异体移植免疫排斥反应低，利于长期存储用于治疗自身免疫性疾病和组织损伤修复。对于hp-mscs的分离培养方法的研究确立是细胞存储、扩增、移植应用和产业化的重要基础，目前对于hp-mscs的分离提取方法主要是酶消化法和组织块贴壁培养法。酶消化法的消化时间较长，并且因为组织块大小不均一、机械剪切力影响等会使死细胞增多、细胞贴壁效果、形态较差，并且大批量提取过程中难于统一量化，另外成本较高。而组织块贴壁培养法操作简单，明显缩短操作时间和减少操作步骤，降低成本的同时，减少对组织和细胞的过多操作，从而最大限度保持细胞活率和提取的活细胞数量。
4.传统的间充质干细胞培养过程中需要添加胎牛血清，培养的间充质干细胞通过胞吞摄取牛血清蛋白而携带牛血清蛋白，会引起受体免疫反应，具有有引入异源血清携带的细菌、病毒的风险。目前，虽然市场上存在一些可购买的人脐带间充质干细胞培养的血清替代物，但是效果仍不甚理想，易影响干细胞的贴壁、增殖以及干性的维持，此外，目前在对间充质干细胞进行培养过程还存在规模化培养效率低下的问题，还需要对间充质干细胞的培养流程进行改进。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养扩增方法，所述人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养扩增方法可解决现有技术中的缺陷，提高间充质干细胞培养效率以及安全性，为临床应用提供保障。
6.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养扩增方法，包括以下步骤：s1：样本预处理：将胎盘组织取出，对其进行清理和浸泡消毒，将消毒后的胎盘用清洗液进行清洗，然后使用组织镊和剪刀剥除胎盘表面羊膜，暴露下面的绒毛膜层；s2：绒毛膜层的获取：使用组织剪和组织镊剥离全部绒毛膜层组织，使用生理盐水清洗后，仔细剥除绒毛膜层组织中的血管组织，并清洗掉残留血液；s3：原代细胞的分离培养：将获取的绒毛膜层剪成2-3 mm3左右的小块组织，将其均匀平铺于培养瓶中，置于细胞培养箱中待组织贴合培养瓶瓶底后，加入间充质干细胞专用培养基进行原代培养；s4：细胞传代培养：观察培养瓶中组织块周围细胞爬出状态，待细胞融合度达到75 %-90 %后，即可采用间充质干细胞专用培养基对获得的间充质干细胞进行传代扩增培养。
7.进一步地，所述间充质干细胞专用培养基包括基础培养基以及添加至所述基础培养基中的培养基添加物，所述培养基添加物至少包括β-巯基乙醇、硫辛酸以及n-乙酰半胱氨酸，所述基础培养基不含动物源性成分和人血小板裂解物。
8.进一步地，所述基础培养基中含有氨基酸、微生物以及无机盐类。
9.进一步地，每1l基础培养基中含有以下培养基添加物：100-150μmβ-巯基乙醇、2-5 mg/l硫辛酸以及10-20 mg/l n-乙酰半胱氨酸。
10.进一步地，所述培养基添加物还包括20-25 μm亚硒酸钠、10-25mg/l胰岛素、0.4-2mg/l氢化可的松以及生长因子添加物中的任意一种或多种。
11.进一步地，所述生长因子添加物为bfgf，所述bfgf的添加浓度为15-20 μg/l。
12.进一步地，所述基础培养基为dmem-f12培养基、l-dmem培养基或imdm培养基中的任意一种。
13.进一步地，所述传代培养的接种密度为5000-5500个/cm2。
14.进一步地，所述清洗液为含青霉素、链霉素和两性霉素的生理盐水溶液。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：第一方面，本发明采用的组织块贴壁分离法获得间充质干细胞的方法操作简单、成本较低、细胞活性好、纯度高，并且最终收获细胞量大，能够快速高效获得足量hp-mscs。
16.第二方面，本发明通过对用于间充质干细胞分离培养的培养基进行改进，使得在进行间充质干细胞的贴壁培养时，所用培养时间更短，培养2天左右即可看到大量细胞从组织块爬出，并且在传代培养时可收获大量的间充质干细胞，使得整体间充质干细胞的培养效率高，成本较低。
17.第三方面，本发明通过采用胎盘组织作为间充质干细胞来源，并对培养过程进行改进，使得整个胎盘间充质干细胞培养工艺能够标准化、程序化、规范化，细胞质量达到临床应用标准。
附图说明
18.图1为本发明处理好后的绒毛膜层图片；图2为本发明采用实施例3提供的间充质干细胞专用培养基对人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行分离培养时的第10天的细胞爬出状态图；
图3为本发明采用实施例3提供的间充质干细胞专用培养基对人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行分离培养得到的p1代细胞形态图；图4为本发明实施例3-5、对比实施例1和对比实施例3所提供的各间充质干细胞专用培养基对间充质干细胞专用培养基的传代培养时的细胞生长曲线图；图5本发明实施例提供的间充质干细胞的流式细胞检测结果；图6本发明实施例提供的间充质干细胞的分化潜能检测结果。
具体实施方式
19.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
20.本发明共设置8个实验组，包括实施例1-5、对比实施例1-3，该实施例1-5、对比实施例1-3均按照表1所给出组分配比制备间充质干细胞专用培养基表1 实施例1-5、对比实施例1-3所提供的间充质干细胞专用培养基的组成1、观察实施例1-5、对比实施例1-3所提供的各间充质干细胞专用培养基对细胞爬出效率的影响采用上述实施例1-5、对比实施例1-3所提供的间充质干细胞专用培养基对人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行分离培养，实验步骤具体如下：s1：于超净台上将无菌获取的胎盘组织取出，清理附着血液及杂物后，将其转移到75 % 酒精中浸泡消毒1 min，将消毒后的胎盘用清洗液清洗3遍，然后使用组织镊和剪刀剥除胎盘表面羊膜，暴露下面的绒毛膜层，该步骤所使用的清洗液为青霉素、链霉素和两性霉素的生理盐水溶液，其中，所述青霉素的浓度为1-2%、链霉素的浓度为1-2%、两性霉素的浓度为2-6 ug/ml。
21.s2：绒毛膜层的获取：使用组织剪和组织镊剥离全部绒毛膜层组织，使用生理盐水
将胎盘组织清洗3遍后，仔细剥除绒毛膜层组织中的血管组织，并清洗掉绒毛膜层上残留的血液，处理好后的绒毛膜层如图1所示；s3：原代细胞的分离培养：将获取的绒毛膜层剪成3 mm3以下的小块组织，将其均匀平铺于t-175细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中待组织贴合瓶底后（过夜），分别缓慢加入实施例1-5、对比实施例1-3所制备得到的间充质干细胞专用培养基（上述间充质干细胞专用培养基的添加量为5 ml/瓶）进行原代培养，培养条件为37℃、5 % co2浓度，第二天每瓶补加20 ml培养基，每4 d进行一次半量换液，并记录各个实验组的细胞爬出状况，实验结果记录为表2，且采用实施例3所提供的间充质干细胞专用培养基对人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行分离培养时的第10天的爬出状态如图2所示，通过该培养基所分离得到的p1代细胞形态如图3所示。
22.表2 观察实施例1-5、对比实施例1-3所提供的各间充质干细胞专用培养基对细胞爬出效率的影响 3d5d8d11d14d实施例12491317实施例226111419实施例336121621实施例4124711实施例501358对比实施例101369对比实施例201258对比实施例301246根据上述实验结果可知，采用本发明实施例1-实施例3所提供的各间充质干细胞专用培养基对间充质干细胞专用培养基对人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行分离培养时可有效地提高进行原代培养时的细胞爬出效率。具体而言，在本实验中，该对比实施例1和对比实施例2通过在普通dmem-f12培养基的基础上添加亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松以及bfgf作为培养基添加物，其细胞爬出效率略有提高，同时，本发明还通过进一步设置对照，在对比实施例1和对比实施例2的基础上进一步添加β-巯基乙醇和硫辛酸可较为明显地提高细胞爬出效率，此外，在该对比实施例3基础上进一步添加n-乙酰半胱氨酸时可以明显地观察到，将该n-乙酰半胱氨酸与β-巯基乙醇和硫辛酸同时在细胞培养过程中进行添加，可起到协同增效的作用，相较于单纯添加β-巯基乙醇和硫辛酸，该实施例1-实施例3的细胞爬出效率有显著提高。
23.2、观察实施例3-5、对比实施例1和对比实施例3所提供的各间充质干细胞专用培养基对间充质干细胞专用培养基的传代培养速率的影响2.1实验方法：采用实施例3所提供的间充质干细胞专用培养基分离获得的间充质干细胞进行传代培养，传代培养过程分别采用对比实施例3、对比实施例1以及实施例3、实施例4、实施例5所提供的间充质干细胞专用培养基多获得的间充质干细胞进行传代培养，培养结果分别记录为对照3、对照1和实验组3、实验组4和实验组5，传代过程具体操作如下：使用胎盘间充质干细胞专用温和消化酶消化细胞，并按照5000个/cm2接种传代培
养,在细胞融合度达到85%-95%时收获，分别计算第一代到第五代细胞收获数量，作图。
24.2.2实验结果：实验结果如附图4所示，从图中可以看出，实验组3的各代细胞收获量明显高于实验组4和实验组5，以及对照组；实验组5和对照组3的细胞收获量相近；对照组1的细胞收获量最少。
25.3、流式细胞检测：采用实施例3所提供的各间充质干细胞专用培养基对间充质干细胞进行传代培养，将获得的p5代的胎盘间充质干细胞收集后进行流式分析细胞表面标记物，实验结果如附图5所示。
26.该实验结果显示：胎盘间充质干细胞均质性较好，均高表达（阳性率》95%）cd73、cd90和cd105，低表达（阳性率《2%）cd34、cd45、hla-dr、cd11b和cd19。
27.4、分化潜能检测：对采用实施例3所提供的间充质干细胞专用培养基分离获得的间充质干细胞进行分化潜能检测：为检测胎盘间充质干细胞的多向分化潜能，分别取收获间充质干细胞进行成骨、成脂和成软骨分化实验，检测结果如附图6所示，其中图6中的a1为成骨分化后倒置显微镜下细胞形态，a2为茜素红染色后照片；图6中的b1为成脂分化后倒置显微镜下细胞形态，b2为油红o染色照片；图6中的c1为三维培养条件下成软骨分化细胞球形态，c2为细胞球石蜡包埋切片后阿利辛蓝染色照片。
28.实验结果显示，通过本方法获得的胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能。
29.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。