一种共聚修饰的智能磁性纳米材料的制备方法

1.本发明涉及智能磁性材料制备技术领域，具体是涉及一种共聚修饰的智能磁性纳米材料的制备方法。


背景技术：

2.蛋白质的磷酸化作为一种重要的翻译后修饰(ptm)方法，在细胞运输和代谢、免疫应答等方面中起着重要的作用。异常的蛋白质磷酸化与肿瘤的转移、阿尔兹海默症等疾病密切相关，具有重要的生物学研究价值。由于生物环境中磷酸化肽的丰度较低，且有大量非磷肽的干扰，因此在进行质谱(ms)检测之前需要设计合适的吸附剂对磷酸化肽进行分离富集。常用的磷酸化肽富集方法包括固定化金属离子亲和层析法(imac)、金属氧化物亲和层析法(moac)和离子交换层析法(iec)等。在这里我们将基于静电相互作用的智能聚合物材料引入磷酸化肽的富集领域，
3.近年来，将智能响应材料用于药物/基因传递、诊断和生物医学设备等生物应用的开创性研究引起了人们越来越大的兴趣。与传统材料相比，智能响应材料可以可逆地“打开”和“关闭”，在化学反应中具有更好的可控性。智能材料中起到响应作用的单元称为响应基元，其在外界刺激(如温度、ph、光和电化学)下的可逆变化会导致材料宏观理化性质的动态变化。已报道的常见响应基元包括螺吡喃、n-异丙基丙烯酰胺、二芳基乙烯、偶氮苯等。
4.螺吡喃(spropyran，sp)是一种具有多重响应的基元，如光、ph、温度、金属离子、氧化还原电位和机械应力等都会导致其结构异构化。在紫外光(365nm)的刺激下，sp中的螺环碳原子断裂形成两性离子部花菁(mc)结构，在可见光(520nm)或加热的刺激下， mc将可逆地转变为sp。在酸性条件下，sp异构为带正电的质子化部花菁(mch

)结构。在碱性和可见光的的条件下，可诱导mch 回到闭环态sp结构。n-异丙基丙烯酰胺(nipam) 为温度响应基元，在它的结构中同时含有亲水性酰胺基团和疏水性的异丙基基团，pnipam 的水溶液具有最低零界温度(lcst，32～34℃)。当温度低于lcst时，亲水酰胺基团与水分子之间的氢键作用大于异丙基之间的疏水作用，pnipam分子链呈现自由且舒展的无规卷曲构象。反之，当温度高于lcst时pnipam分子链发生脱水聚集，呈现卷曲紧缩的小球构象。基于n-异丙基丙烯酰胺不同温度下形态变化，以及螺吡喃不同异构体之间理化性质差异，将两者共聚制备出具有多重响应的智能材料，应用于复杂生物环境中磷酸化肽的分离富集。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种共聚修饰的智能磁性纳米材料的制备方法，以解决上述背景技术中的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种共聚修饰的智能磁性纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤一：将1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃溶解于三乙胺和干燥的二氯甲烷混合液中，在氮气保护下，将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合溶液缓慢滴加
至上述混合物中，室温下，连续搅拌反应24h，反应结束后，通过柱层析法提纯的方式得到纯净的光和ph响应单体spma；
9.步骤二：将fecl3·
6h2o、naac与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘稠液体，将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h后，得到黑色fe3o4纳米粒子(mnps)；
10.步骤三：将fe3o4纳米粒子、乙醇、水和nh3·
h2o混合，上述混合物超声15min后加入正硅酸乙酯teos，在室温下反应10h，得到硅烷化磁性纳米粒子；
11.步骤四：取步骤三中的硅烷化磁性纳米粒子，用甲苯超声清洗三次，每次超声5min，清洗完毕后，加入甲苯机械搅拌10min，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应26h，得到氨基修饰的磁性纳米粒子；
12.步骤五：将氨基修饰的磁性纳米粒子、二氯甲烷和三乙胺在0℃下搅拌10min，在0℃下将含有2-溴异丁酰溴的二氯甲烷逐滴加入，通过室温反应24h，得到修饰有引发剂的 mnp-bibb材料；
13.步骤六：利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上，在n2保护下，将mnp-bibb、spma单体、溴化亚铜和三(2-二甲氨基乙基)胺一起分散于干燥的dmf中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧以及80℃反应方式，得到具有光和ph响应的mnp-pspma材料；
14.步骤七：mnp-pspma、溴化亚铜、n-异丙基丙烯酰胺和n，n，n'，n”，n
”‑
五甲基二亚乙基三胺一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h，得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料 mnp-p(spma-b-nipam)。
15.作为本发明进一步的方案，所述步骤一中酰氯试剂选择丙烯酰氯。
16.作为本发明进一步的方案，所述步骤二中fecl3·
6h2o和naac摩尔比为1-3：8-10。
17.作为本发明进一步的方案，所述步骤三中硅烷化时间8-11h。
18.作为本发明进一步的方案，所述步骤四中反应所用溶剂种类乙醇/水混合溶剂以及甲苯。
19.作为本发明进一步的方案，所述步骤五中引发剂2-溴异丁酰溴用量200-600μl。
20.作为本发明进一步的方案，所述步骤六中mnp-bibb用量10-30mg，光响应单体 50-100mg，atrp反应所需络合剂选择三(2-二甲氨基乙基)胺。
21.作为本发明进一步的方案，所述步骤七中温度响应单体n-异丙基丙烯酰胺用量 75-300mg，atrp反应所需络合剂为n，n，n'，n”，n
”‑
五甲基二亚乙基三胺。
22.作为本发明进一步的方案，所述螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的智能磁性纳米材料采用球形，尺寸为200nm左右。
23.综上所述，本发明实施例与现有技术相比具有以下有益效果：
24.本发明提供一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料及其制备方法和应用，该方法通过丙烯酰氯与螺吡喃的酰胺化反应，得到具有光和ph响应的单体spma；通过溶剂热方法，制备fe3o4纳米粒子；对上一步制备fe3o4纳米粒子对其进行硅烷化修饰，接着利用teos和aptes的脱水共缩合得到氨基修饰的磁性纳米粒子；引发剂2-溴异丁酰溴与磁性纳米粒子上氨基发生酰胺化反应，制得修饰有atrp引发剂的磁性纳米粒子；最后基于atrp反应，得到螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚接枝的磁性纳米材料；本发明利用螺吡喃在酸和紫外光下形成的带正电荷异构体，以及nipam在不同温度下形态的变化，
spma单体、溴化亚铜和三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren)一起分散于干燥的dmf中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧以及80℃反应方式，得到具有光和ph响应的mnp-pspma材料；
42.步骤七：mnp-pspma、溴化亚铜、n-异丙基丙烯酰胺(nipam)和n，n，n'，n”，n
”‑ꢀ
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h，得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
43.在本实施例中，提供上述螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体步骤如下：
44.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
45.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液，每次用200μl loading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
46.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μl elution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱。
47.在一个实施例中，参见图1～图7，所述步骤一中酰氯试剂选择丙烯酰氯。
48.进一步的，参见图1～图7，所述的步骤二中fecl3·
6h2o和naac摩尔比为1-3：8-10。
49.进一步的，参见图1～图7，所述步骤三中硅烷化时间8-11h。
50.进一步的，参见图1～图7，所述步骤四中反应所用溶剂种类乙醇/水混合溶剂以及甲苯。
51.进一步的，参见图1～图7，所述步骤五中引发剂2-溴异丁酰溴用量200-600μl。
52.进一步的，参见图1～图7，所述步骤六中mnp-bibb用量10-30mg，单体spma50-100mg， atrp反应所需络合剂选择三(2-二甲氨基乙基)胺。
53.进一步的，参见图1～图7，所述步骤六中温度响应单体n-异丙基丙烯酰胺(nipam) 用量75-300mg，atrp反应所需络合剂为n，n，n'，n”，n
”‑
五甲基二亚乙基三胺。
54.进一步的，参见图1～图7，所述螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的智能磁性纳米材料外貌为球形，尺寸为200nm左右。
55.实施例1
56.一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
57.(1)将0.5g1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃和0.25ml的三乙胺均匀溶解于20ml干燥的二氯甲烷中。然后在氮气保护下，把5ml干燥的二氯甲烷和0.2ml 的丙烯酰氯的混合溶液缓慢滴加至上述混合物中。室温下，连续搅拌反应24h。反应结束后，先过滤除去三乙胺盐酸盐；旋转浓缩后，用二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)作为淋洗剂，柱层析法提纯，得到纯净的光和ph响应单体spma；
58.(2)1.35gfecl3·
6h2o、3.6gnaac(1：8)与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘稠液体。将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h。将得到的黑色fe3o4纳米粒子(mnps)用水和乙醇交替洗三次后，50℃真空干燥过夜。
59.(3)称取350mgmnps于500ml圆底烧瓶中，加入220ml乙醇、55ml水和1.4mlnh3·
h2o。上述混合物超声15min后加入1ml正硅酸乙酯(teos)，优选在室温下反应10h。将得到的硅烷化磁性纳米粒子(mnp-sio2)用水和乙醇交替洗三次后，50℃下真空干燥过夜。
60.(4)称取120mgmnp-sio2于250ml圆底烧瓶中，优选甲苯做反应溶剂。用甲苯超声清洗三次，每次超声5min。清洗完毕后，加入20ml甲苯机械搅拌十分钟。逐滴加入1ml3
‑ꢀ
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在25℃下机械搅拌反应26h。反应结束后，甲苯、丙酮洗三次，在50℃下真空干燥，得到氨基修饰的磁性纳米粒子(mnp-nh2)。
61.(5)称取40mgmnp-nh2于250ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和240μl三乙胺在 0℃下搅拌10min。在0℃下将含有400μl2-溴异丁酰溴的2ml二氯甲烷逐滴加入，并在滴加完毕后0℃下搅拌1h后将温度升至室温，反应24h。将得到的mnp-bibb材料在25℃下真空干燥。
62.(6)利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上。在n2保护下，将 30mgmnp-bibb、100mgspma单体、15mg溴化亚铜和28μl的三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren) 一起分散于2ml干燥的dmf中，这个混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温80℃反应48h。反应结束后，用thf洗涤三次后，冷冻干燥得到具有光和ph响应的 mnp-pspma材料。
63.(7)10mgmnp-pspma、4mg溴化亚铜、150mgn-异丙基丙烯酰胺(nipam)和6μ ln,n,n',n”,n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h。反应结束后，水洗三次，冷冻干燥后得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
64.图2为本发明得到的mnp-p(spma-b-nipam)的sem图，图2说明mnp-p(spma-b-nipam) 外貌为球形，尺寸约为200nm左右。
65.实施例1磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体包括：
66.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
67.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液。每次用200μlloading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
68.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μlelution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱。图3说明 mnp-p(spma-b-nipam)对磷酸化肽具有一定的富集能力。
69.实施例2
70.一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
71.(1)将0.5g1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃和0.25ml的三乙胺均匀溶解于20ml干燥的二氯甲烷中。然后在氮气保护下，把5ml干燥的二氯甲烷和0.2ml 的丙烯酰氯的混合溶液缓慢滴加至上述混合物中。室温下，连续搅拌反应24h。反应结束后，先过滤除去三乙胺盐酸盐；旋转浓缩后，用二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)作为淋洗剂，柱层析法提纯，得到纯净的光和ph响应单体spma；
72.(2)2.70gfecl3·
6h2o、7.38gnaac(2：9)与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘
稠液体。将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h。将得到的黑色fe3o4纳米粒子(mnps)用水和乙醇交替洗三次后，50℃真空干燥过夜。
73.(3)称取350mgmnps于500ml圆底烧瓶中，加入220ml乙醇、55ml水和1.4mlnh3·
h2o。上述混合物超声15min后加入1ml正硅酸乙酯(teos)，优选在室温下反应9h。将得到的硅烷化磁性纳米粒子(mnp-sio2)用水和乙醇交替洗三次后，50℃下真空干燥过夜。
74.(4)称取120mgmnp-sio2于250ml圆底烧瓶中，选甲苯做反应溶剂。用甲苯超声清洗三次，每次超声5min。清洗完毕后，加入20ml甲苯机械搅拌十分钟。逐滴加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在25℃下机械搅拌反应26h。反应结束后，甲苯、丙酮洗三次，在50℃下真空干燥，得到氨基修饰的磁性纳米粒子(mnp-nh2)。
75.(5)称取40mgmnp-nh2于250ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和240μl三乙胺在 0℃下搅拌10min。在0℃下将含有300μl2-溴异丁酰溴的2ml二氯甲烷逐滴加入，并在滴加完毕后0℃下搅拌1h后将温度升至室温，反应24h。将得到的mnp-bibb材料在25℃下真空干燥。
76.(6)利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上。在n2保护下，将20mgmnp-bibb、100mgspma单体、15mg溴化亚铜和28μl的三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren) 一起分散于2ml干燥的dmf中，这个混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温80℃反应48h。反应结束后，用thf洗涤三次后，冷冻干燥得到具有光和ph响应的 mnp-pspma材料。
77.(7)10mgmnp-pspma、4mg溴化亚铜、75mgn-异丙基丙烯酰胺(nipam)和6μ ln,n,n',n”,n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h。反应结束后，水洗三次，冷冻干燥后得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
78.实施例2磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体包括：
79.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
80.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液。每次用200μlloading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
81.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μlelution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图4 所示。
82.实施例3
83.一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
84.(1)将0.5g1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃和0.25ml的三乙胺均匀溶解于20ml干燥的二氯甲烷中。然后在氮气保护下，把5ml干燥的二氯甲烷和0.2ml 的丙烯酰氯的混合溶液缓慢滴加至上述混合物中。室温下，连续搅拌反应24h。反应结束后，先过滤除去三乙胺盐酸盐；旋转浓缩后，用二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)作为淋洗剂，柱层析法提纯，得到纯净的光和ph响应单体spma；
85.(2)2.70gfecl3·
6h2o、3.7gnaac(2：9)与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘稠
液体。将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h。将得到的黑色fe3o4纳米粒子(mnps)用水和乙醇交替洗三次后，50℃真空干燥过夜。
86.(3)称取350mgmnps于500ml圆底烧瓶中，加入220ml乙醇、55ml水和1.4mlnh3·
h2o。上述混合物超声15min后加入1ml正硅酸乙酯(teos)，优选在室温下反应10h。将得到的硅烷化磁性纳米粒子(mnp-sio2)用水和乙醇交替洗三次后，50℃下真空干燥过夜。
87.(4)称取120mgmnp-sio2于250ml圆底烧瓶中，选甲苯做反应溶剂。用甲苯超声清洗三次，每次超声5min。清洗完毕后，加入20ml甲苯机械搅拌十分钟。逐滴加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在25℃下机械搅拌反应26h。反应结束后，甲苯、丙酮洗三次，在50℃下真空干燥，得到氨基修饰的磁性纳米粒子(mnp-nh2)。
88.(5)称取40mgmnp-nh2于250ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和240μl三乙胺在 0℃下搅拌10min。在0℃下将含有400μl2-溴异丁酰溴的2ml二氯甲烷逐滴加入，并在滴加完毕后0℃下搅拌1h后将温度升至室温，反应24h。将得到的mnp-bibb材料在25℃下真空干燥。
89.(6)利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上。在n2保护下，将 30mgmnp-bibb、100mgspma单体、15mg溴化亚铜和28μl的三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren) 一起分散于2ml干燥的dmf中，这个混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温80℃反应48h。反应结束后，用thf洗涤三次后，冷冻干燥得到具有光和ph响应的mnp-pspma材料。
90.(7)10mgmnp-pspma、4mg溴化亚铜、300mgn-异丙基丙烯酰胺(nipam)和6μ ln,n,n',n”,n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h。反应结束后，水洗三次，冷冻干燥后得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
91.实施例3磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体包括：
92.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
93.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液。每次用200μlloading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
94.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μlelution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图5 所示。
95.实施例4
96.一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
97.(1)将0.5g1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃和0.25ml的三乙胺均匀溶解于20ml干燥的二氯甲烷中。然后在氮气保护下，把5ml干燥的二氯甲烷和0.2ml 的丙烯酰氯的混合溶液缓慢滴加至上述混合物中。室温下，连续搅拌反应24h。反应结束后，先过滤除去三乙胺盐酸盐；旋转浓缩后，用二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)作为淋洗剂，柱层析法提纯，得到纯净的光和ph响应单体spma；
98.(2)5.40gfecl3·
6h2o、5.5gnaac(3：10)与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘
稠液体。将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h。将得到的黑色fe3o4纳米粒子(mnps)用水和乙醇交替洗三次后，50℃真空干燥过夜。
99.(3)称取350mgmnps于500ml圆底烧瓶中，加入220ml乙醇、55ml水和1.4mlnh3·
h2o。上述混合物超声15min后加入1ml正硅酸乙酯(teos)，优选在室温下反应10h。将得到的硅烷化磁性纳米粒子(mnp-sio2)用水和乙醇交替洗三次后，50℃下真空干燥过夜。
100.(4)称取120mgmnp-sio2于250ml圆底烧瓶中，选乙醇和水的混合物(1：1，v/v) 做反应溶剂。用乙醇和水的混合物超声清洗三次，每次超声5min。清洗完毕后，加入20ml 乙醇和水的混合物机械搅拌10min。逐滴加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在25℃下机械搅拌反应26h。反应结束后，乙醇、水洗三次，在50℃下真空干燥，得到氨基修饰的磁性纳米粒子(mnp-nh2)。
101.(5)称取40mgmnp-nh2于250ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和240μl三乙胺在 0℃下搅拌10min。在0℃下将含有500μl2-溴异丁酰溴的2ml二氯甲烷逐滴加入，并在滴加完毕后0℃下搅拌1h后将温度升至室温，反应24h。将得到的mnp-bibb材料在25℃下真空干燥。
102.(6)利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上。在n2保护下，将 20mgmnp-bibb、100mgspma单体、15mg溴化亚铜和28μl的三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren) 一起分散于2ml干燥的dmf中，这个混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温80℃反应48h。反应结束后，用thf洗涤三次后，冷冻干燥得到具有光和ph响应的 mnp-pspma材料。
103.(7)10mgmnp-pspma、4mg溴化亚铜、300mgn-异丙基丙烯酰胺(nipam)和6μ ln,n,n',n”,n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h。反应结束后，水洗三次，冷冻干燥后得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
104.实施例4磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体包括：
105.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
106.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液。每次用200μlloading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
107.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μlelution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图6 所示。
108.实施例5
109.一种螺吡喃和n-异丙基丙烯酰胺嵌段共聚修饰的磁性材料的制备方法，包括以下步骤：
110.(1)将0.5g1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基吲哚啉-6'-硝基苯并螺吡喃和0.25ml的三乙胺均匀溶解于20ml干燥的二氯甲烷中。然后在氮气保护下，把5ml干燥的二氯甲烷和0.2ml 的丙烯酰氯的混合溶液缓慢滴加至上述混合物中。室温下，连续搅拌反应24h。反应结束后，先过滤除去三乙胺盐酸盐；旋转浓缩后，用二氯甲烷/石油醚(2:1，v/v)作为淋洗剂，柱层析法提纯，得到纯净的光和ph响应单体spma；
111.(2)1.35gfecl3·
6h2o、3.6gnaac(3：10)与75ml乙二醇混合搅拌1h，得到姜黄色粘稠液体。将上述混合物倒入100ml反应釜中，在200℃下反应16h。将得到的黑色fe3o4纳米粒子(mnps)用水和乙醇交替洗三次后，50℃真空干燥过夜。
112.(3)称取350mgmnps于500ml圆底烧瓶中，加入220ml乙醇、55ml水和1.4mlnh3·
h2o。上述混合物超声15min后加入1ml正硅酸乙酯(teos)，优选在室温下反应11h。将得到的硅烷化磁性纳米粒子(mnp-sio2)用水和乙醇交替洗三次后，50℃下真空干燥过夜。
113.(4)称取120mgmnp-sio2于250ml圆底烧瓶中，选乙醇和水的混合物(1：1，v/v) 做反应溶剂。用乙醇和水的混合物超声清洗三次，每次超声5min。清洗完毕后，加入20ml 乙醇和水的混合物机械搅拌10min。逐滴加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在25℃下机械搅拌反应26h。反应结束后，乙醇、水洗三次，在50℃下真空干燥，得到氨基修饰的磁性纳米粒子(mnp-nh2)。
114.(5)称取40mgmnp-nh2于250ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷和240μl三乙胺在0℃下搅拌10min。在0℃下将含有600μl2-溴异丁酰溴的2ml二氯甲烷逐滴加入，并在滴加完毕后0℃下搅拌1h后将温度升至室温，反应24h。将得到的mnp-bibb材料在25℃下真空干燥。
115.(6)利用atrp反应将聚合物pspma接枝在磁性纳米粒子上。在n2保护下，将 20mgmnp-bibb、100mgspma单体、15mg溴化亚铜和28μl的三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren) 一起分散于2ml的干燥dmf中，这个混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温80℃反应48h。反应结束后，用thf洗涤三次后，冷冻干燥得到具有光和ph响应的 mnp-pspma材料。
116.(7)10mgmnp-pspma、4mg溴化亚铜、150mgn-异丙基丙烯酰胺(nipam)和6μ ln,n,n',n”,n
”‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)一起分散于2ml水中，混合物通过“冷冻-抽气-解冻”的八次循环除氧后，恒温25℃反应24h。反应结束后，水洗三次，冷冻干燥后得到具有光、ph和温度三重响应的磁性嵌段聚合物材料mnp-p(spma-b-nipam)。
117.实施例5磁性材料在分离富集磷酸化肽上的应用，具体包括：
118.(1)将预处理好的mnp-p(spma-b-nipam)(1mg)分散在300μl的loading buffer (70％acn 0.1％tfa)中，向其中加入200μl胰蛋白酶酶解的β-酪蛋白(1mg/ml)，在紫外光照射下20℃孵育1h；
119.(2)在黑暗环境中，将孵育好的mnp-p(spma-b-nipam)通过外磁场分离，倒掉上清液。每次用200μlloading buffer洗涤磁性材料3次，磁分离后倒掉上清液；
120.(3)将洗涤好的mnp-p(spma-b-nipam)用20μlelution buffer(1％nh3h2o)洗脱富集的磷酸化肽，在可见光下40℃孵育1h，外磁场分离后，取上清液测质谱，质谱图如图7 所示。
121.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。