一种荧光纳米羟基磷灰石及其制备方法与应用

1.本发明属于无机生物医用材料领域，具体涉及一种荧光纳米羟基磷灰石及其制备方法与应用。


背景技术：

2.碳点自2004年发现以来，其优异的物理化学性质吸引了学者的广泛关注。碳点具有低毒性、良好的生物相容性、优异光致发光特性。目前碳点已在荧光标记、传感器、催化等诸多领域表现出了巨大的应用潜力。
3.羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分，由于其优秀的生物相容性、生物活性和无毒性被广泛应用于生物医药领域，可作为骨组织修复材料，药物载体等。
4.近年来随着研究发现，纳米级羟基磷灰石自身还具有一定的抗癌性，能抑制骨肉瘤细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞等多种癌细胞的活性，且这种抑制作用与纳米羟基磷灰石的尺寸相关，随尺寸的减小抑制作用增大。有研究(cn113307240a)将碳点作为模板，使用水热法制备出了具有不同尺寸的纳米羟基磷灰石，来研究这种抗癌作用。但是这种纳米羟基磷灰石不具有荧光性质，不能够在细胞中进行荧光示踪，以探究抗癌作用机制，限制了其在细胞层面的进一步作用研究。此外，有研究使用荧光指示剂对纳米羟基磷灰石进行荧光标记，但是这种荧光指示剂会改变纳米羟基磷灰石的表面结构和性质，且荧光指示剂本身具有一定的细胞毒性且易受外界因素而荧光淬灭，这些因素都会对研究结果产生一定的影响。
5.为了解决上述纳米羟基磷灰石的荧光问题，有研究(cn 106800931 a)通过碳点与纳米羟基磷灰石进行表面复合，利用碳点的低毒性和荧光性质，使纳米羟基磷灰石具有蓝色荧光。但是由于生物体的组织细胞对这种这种低波段的蓝色荧光敏感，易被组织细胞吸收，使这种低波段荧光难以透过细胞组织而进行示踪成像，且易使组织细胞损伤，限制了其在生物医学领域的进一步应用。
6.因此，制备一种长波发射、低毒性、荧光稳定的荧光纳米羟基磷灰石，对肿瘤的研究和治疗具有重大意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种荧光纳米羟基磷灰石及其制备方法与应用。通过碳点与羟基磷灰石化学结合，实现碳点-纳米羟基磷灰石的固相荧光，且通过高温煅烧，化学结合的碳点进一步碳化，使碳点的共轭结构增加，实现长波发射增强，不易被生物组织吸收，避免短波对细胞的损伤。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：
9.一种荧光纳米羟基磷灰石的制备方法，包括如下步骤：
10.(1)将柠檬酸和邻苯二胺溶解在溶剂中，反应得到产物混合液，将产物混合液透析、干燥得到碳点粉末；
11.(2)将步骤(1)所述的碳点粉末和磷源溶液混合均匀，然后滴入钙源溶液，调节ph，
在室温下搅拌、静置，得到反应产物，洗涤、干燥，得到绿色荧光纳米羟基磷灰石。
12.优选的，步骤(1)所述柠檬酸和邻苯二胺的质量比为2～5：1。
13.进一步优选的，步骤(1)所述柠檬酸和邻苯二胺的质量比为4：1。
14.优选的，步骤(1)所述溶剂为无水乙醇、甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种以上。
15.优选的，步骤(1)所述反应的温度为150℃～250℃；反应的时间为5～12h。
16.进一步优选的，步骤(1)所述反应的温度为200℃；反应的时间为6h。
17.优选的，步骤(1)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为100～3000da；所述透析处理的时间为12～48h。
18.进一步优选的，步骤(1)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为500da；所述透析处理的时间为24h。
19.优选的，步骤(2)所述磷源选自磷酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾的中的至少一种；所述的钙源为硝酸钙、氯化钙中的至少一种；所述钙源和磷源的钙磷摩尔比为1.66～1.68。
20.优选的，步骤(2)所述ph为9～14；所述搅拌的时间为10～15h；所述静置的时间为10～15h。
21.进一步优选的，步骤(2)所述ph为13；所述搅拌的时间为12h；所述静置的时间为12h。
22.优选的，将所述的绿色荧光纳米羟基磷灰石煅烧，洗涤、干燥，得到橙色荧光纳米羟基磷灰石。
23.进一步优选的，所述煅烧的温度为300-550℃；煅烧的时间为1-5h。更优选的，所述煅烧的温度为500℃；煅烧的时间为3h。
24.上述的制备方法制得的荧光纳米羟基磷灰石。
25.上述的荧光纳米羟基磷灰石在发光材料、荧光示踪和纳米医药领域中的应用。包括作为骨组织修复材料，药物载体等。
26.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
27.(1)本发明制备的产物是一种全新的荧光纳米羟基磷灰石。与现有技术相比，通过碳点与羟基磷灰石化学结合，实现羟基磷灰石的绿色荧光，且通过高温煅烧，使碳点进一步碳化，共轭结构增加，长波发射增强，表现出橙色荧光，实现了羟基磷灰石的长波发射荧光，且制备的产物荧光纳米羟基磷灰石颗粒尺寸小、亲水性好、荧光稳定，在发光材料、荧光示踪、细胞成像、骨修复和纳米医药领域具有潜在的应用前景。
28.(2)本发明具有制备工艺简单、所用原材料价格低廉、无毒、环境友好等优点。
附图说明
29.图1是本发明实施例1中的碳点的透射电镜(tem)图。
30.图2是本发明实施例1中的碳点溶液在不同激发波长下的荧光光谱图。
31.图3是本发明实施例3中的绿色荧光纳米羟基磷灰石的透射电镜(tem)图。
32.图4是本发明实施例3中的绿色荧光纳米羟基磷灰石的荧光光谱图。
33.图5是本发明实施例4中的橙色荧光纳米羟基磷灰石的透射电镜(tem)图。
34.图6是本发明实施例4中的橙色荧光纳米羟基磷灰石的荧光光谱图。
具体实施方式
35.以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
36.实施例1
37.碳点的制备
38.(1)取8g柠檬酸和2g邻苯二胺于烧杯中，加入40ml二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌1h至溶液澄清。
39.(2)将溶液转入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃下反应6h。
40.(3)待反应釜自然冷却后得到产物混合液，使用截留分子量500da的透析袋对混合液透析24h。将透析后的保留液冻干，得到碳点粉末。
41.图1是本发明实施例1中的碳点的透射电镜(tem)图。
42.图2是本发明实施例1中的碳点溶液在不同激发波长下的荧光光谱图。
43.参照图1，实施例1所获得的碳点为类球体纳米颗粒，分散性较好，尺寸均为10nm以下。
44.参照图2，实施例1所获得的碳点溶液在激发光下发射出峰位在510nm左右的绿色荧光。
45.实施例2
46.纳米羟基磷灰石的制备
47.(1)量取12.5ml、0.25mol/l的硝酸钙，通过蠕动泵，以0.5ml/min的速度滴加至37.5ml、0.05mol/l的磷酸钠溶液。
48.(2)全部滴加后，用naoh溶液(5mol/l)调节ph至13，在室温下(25℃)将混合液搅拌12h，并静置12h。
49.(3)反应结束后，将产物混合液转移至离心管中，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到纳米羟基磷灰石。
50.本实施例所得纳米羟基磷灰石无荧光特性。
51.实施例3
52.绿色荧光纳米羟基磷灰石的制备
53.(1)取8g柠檬酸和2g邻苯二胺于烧杯中，加入40ml二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌1h至溶液澄清。
54.(2)将溶液转入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃下反应6h。
55.(3)待反应釜自然冷却后得到产物混合液，使用截留分子量500da的透析袋对混合液透析24h。将透析后的保留液冻干，得到碳点粉末。
56.(4)称取所得的碳点粉末0.05g于烧杯中，加入37.5ml、0.05mol/l的磷酸钠溶液，磁力搅拌1h。
57.(5)量取12.5ml、0.25mol/l的硝酸钙，通过蠕动泵，以0.5ml/min的速度滴加至步骤(1)所得的混合液。
58.(6)全部滴加后，用naoh溶液(5mol/l)调节ph至13，在室温下(25℃)将混合液搅拌12h，并静置12h。
59.(7)反应结束后，将产物混合液转移至离心管中，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到绿色荧光纳米羟基磷灰石。
60.图3是本发明实施例3中的绿色荧光纳米羟基磷灰石的透射电镜(tem)图。
61.图4是本发明实施例3中的绿色荧光纳米羟基磷灰石的荧光光谱图。
62.实施例4
63.橙色荧光纳米羟基磷灰石的制备
64.(1)取8g柠檬酸和2g邻苯二胺于烧杯中，加入40ml二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌1h至溶液澄清。
65.(2)将溶液转入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃下反应6h。
66.(3)待反应釜自然冷却后得到产物混合液，使用截留分子量500da的透析袋对混合液透析24h。将透析后的保留液冻干，得到碳点粉末。
67.(4)称取所得的碳点粉末0.05g于烧杯中，加入37.5ml、0.05mol/l的磷酸钠溶液，磁力搅拌1h。
68.(5)量取12.5ml、0.25mol/l的硝酸钙，通过蠕动泵，以0.5ml/min的速度滴加至步骤(1)所得的混合液。
69.(6)全部滴加后，用naoh溶液(5mol/l)调节ph至13，在室温下(25℃)将混合液搅拌12h，并静置12h。
70.(7)反应结束后，将产物混合液转移至离心管中，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到绿色荧光纳米羟基磷灰石。
71.(8)将所得的绿色荧光纳米羟基磷灰石放入坩埚中，并置于马弗炉中，在500℃下煅烧3h得到产物，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到橙色荧光纳米羟基磷灰石。
72.图5是本发明实施例4中的橙色荧光纳米羟基磷灰石的透射电镜(tem)图。
73.图6是本发明实施例4中的橙色荧光纳米羟基磷灰石的荧光光谱图。
74.实施例5
75.纳米羟基磷灰石的制备
76.(1)取8g柠檬酸和2g邻苯二胺于烧杯中，加入40ml二甲基甲酰胺，用玻璃棒搅拌1h至溶液澄清。
77.(2)将溶液转入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200℃下反应6h。
78.(3)待反应釜自然冷却后得到产物混合液，使用截留分子量500da的透析袋对混合液透析24h。将透析后的保留液冻干，得到碳点粉末。
79.(4)称取所得的碳点粉末0.05g于烧杯中，加入37.5ml、0.05mol/l的磷酸钠溶液，磁力搅拌1h。
80.(5)量取12.5ml、0.25mol/l的硝酸钙，通过蠕动泵，以0.5ml/min的速度滴加至步骤(1)所得的混合液。
81.(6)全部滴加后，用naoh溶液(5mol/l)调节ph至13，在室温下(25℃)将混合液搅拌12h，并静置12h。
82.(7)反应结束后，将产物混合液转移至离心管中，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到绿色荧光纳米羟基磷灰石。
83.(8)将所得的绿色荧光纳米羟基磷灰石放入坩埚中，并置于马弗炉中，在600℃下煅烧3h得到产物，在10000rpm、3min条件下水洗3次、无水乙醇洗3次后干燥、研磨得到纳米羟基磷灰石。
84.本实施例所得纳米羟基磷灰石无荧光特性。
85.结果分析：
86.参照图3，实施例3所制备的绿色荧光纳米羟基磷灰石是小尺寸纳米级颗粒。
87.参照图4，实施例3所获得的绿色荧光纳米羟基磷灰石半峰宽较大，主要发射峰位在480nm，并拖尾至650nm，观测显示出一种绿色荧光。对比实施例2，这种不添加碳点制备的纳米羟基磷灰石是没有没有荧光的，实施例3得到的纳米羟基磷灰石显示出绿色荧光，这说明绿色荧光纳米羟基磷灰石的荧光中心是碳点。但是，这种荧光性质与图2碳点溶液的荧光性质有所区别，这是碳点所处的化学环境不同所导致的，其中实施例3的碳点和纳米羟基磷灰石是通过化学结合的，包括c-o-ca、n-p等。
88.参照图5，实施例4煅烧后的橙色荧光纳米羟基磷灰石晶粒发生融合并长大，但仍然是小尺寸纳米结构。
89.参照图6，实施例4所获得的橙色荧光纳米羟基磷灰石有两个主要发射峰，其中峰位在480nm的发射峰减弱，但是585nm的发射峰增强，并拖尾至650nm，观测显示出一种橙色荧光。这与图4的荧光行为又有所区别，这是因为在高温煅烧下，碳点表面的官能团进一步碳化，碳点中的共轭结构增多，使碳点的长波发射增强，最终表现为橙光纳米羟基磷灰石。对比实施例5，实施例5是没有荧光的，在600℃煅烧3h后，荧光完全淬灭，这是因为在碳点在600℃的煅烧下，碳点完全碳化，表面含氧含氮官能团消失，表面缺陷能级调控的荧光机制消失，从而导致荧光淬灭。
90.以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。