一种降低抗体酸性峰的细胞培养方法与流程

1.本发明涉及一种细胞培养方法，具体涉及一种降低抗体酸性峰的细胞培养方法。


背景技术：

2.cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞，chinese hamster ovary)是生产蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞之一，相对于其他细胞表达系统，cho细胞表达系统能够与外源基因稳定地整合并经过复杂的翻译后修饰表达出与天然蛋白结构、免疫原性、糖基化类型和方式等几乎相同的蛋白，从而能够保证重组蛋白的药性和药效。此外，cho细胞很少分泌自身的内源蛋白，也有利于外源蛋白的后期分离纯化。
3.单克隆抗体具有复杂的分子结构和较大的分子量，在生产及其后期的储存过程中可产生大量的修饰，比如糖基化、c末端赖氨酸的截除、氧化脱酰胺等，使得抗体分子可以产生多种异构体，这些异构体的组合就产生了单克隆抗体的电荷异质性、糖基化修饰异质性、分子量大小异质性等。
4.翻译后修饰过程产生的电荷变体，尤其是酸性电荷变体，对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异质性产生酸碱峰，其中碱性峰主要来源于c末端赖氨酸的不均一性、甲硫氨酸氧化或天冬氨酸转变为丁二酰亚胺等，而酸性峰一般来源于n-糖末端的唾液酸修饰，脱酰胺，氧化，非经典二硫键，三硫键，硫代硫化物修饰，糖基化，马来酸修饰，半胱氨酸化，未还原的片段等。最小化酸性物质的上游策略总结为针对特定细胞系的细胞培养添加剂补充和工艺参数调节，目前现有技术仅提出了有限的策略，如添加儿茶素(valentine等，2019)、芦丁(hossler等，2015)、迷迭香酸(chung等，2019)为代表的氧化缓解策略。通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法具有一定的挑战性，成为本领域一直难以解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明为了克服上述现有技术中存在的缺陷和不足提供了一种表达系统为cho的细胞培养方法。该方法通过在现有的商业化动物细胞培养基中添加谷氨酸，采用cho表达系统的细胞培养工艺来表达抗体，能在降低抗体酸性峰的同时改善抗体的糖基化水平，优化了抗体质量，保证了抗体的药效。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种降低抗体酸性峰的细胞培养方法，其特征在于，以cho细胞为表达系统，在基础培养基中添加谷氨酸。
7.在本发明的一些实施方式中，所述cho细胞选择cho-k1细胞。
8.在本发明的一些实施方式中，谷氨酸的浓度选自0～3.0g/l。
9.在本发明的一个具体的实施方式中，谷氨酸的浓度为3.0g/l。
10.在本发明的一些实施方式中，加入谷氨酸的时间是第0到7天中的任意一天或多天。
11.在本发明的一些实施方式中，加入谷氨酸的时间是第0、3、5、7天中任意一天。
12.在本发明的一个具体的实施方式中，加入谷氨酸的时间是第3天。
13.在本发明的一些实施方式中，基础培养基选自市售商用培养基chom-b03、chom-s03或chom-s04。
14.在本发明的一些实施方式中，本发明的细胞培养方法还包括从第2天开始在培养皿中加入流加培养基。
15.在本发明的一些实施方式中，所述流加培养基是质量百分比为1.5％的chom-s03和0.15％的chom-s04。
16.在本发明的一些实施方式中，本发明的细胞培养方法还包括从第1天开始，通过添加30％葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度维持在3.0g/l。
17.在本发明的一些实施方式中，本发明的细胞培养方法包括以下步骤：
18.a)将基础培养基chom-b03加入培养皿中，接种cho-k1细胞后，在37℃下培养12天；
19.b)从第一天开始通过添加30％葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度维持在3.0g/l；
20.c)从第二天开始在培养皿中补加流加培养基，所述流加培养基选自质量百分比为1.5％的chom-s03或0.15％的chom-s04；
21.d)于第三天在培养皿中加入浓度为3.0g/l的谷氨酸。
22.本发明的有益效果在于，本发明细胞培养方法所用的关键组分谷氨酸为本领域常用物质，易获取且成本可控，培养方法简单，只需在基础培养基中在合适的时间加入谷氨酸，即可明显降低抗体的酸性峰并减少半乳糖基化，提高蛋白浓度，同时对细胞生长的影响很小，对于cho表达体系的细胞培养方法而言，具有显著的应用和推广价值。
附图说明
23.图1是不同剂量的谷氨酸添加影响下的活细胞密度
24.图2是不同剂量的谷氨酸添加影响下的细胞活率
25.图3是不同剂量的谷氨酸添加影响下的蛋白浓度
26.图4是不同剂量的谷氨酸添加影响下的酸性峰比例
27.图5是不同添加时间的谷氨酸添加影响下的活细胞密度
28.图6显示了不同添加时间的谷氨酸添加影响下的细胞活率
29.图7显示了不同添加时间的谷氨酸添加影响下的蛋白浓度
30.图8显示了不同添加时间的谷氨酸添加影响下的酸性峰比例
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐释。
32.实施例1
33.1.主要实验材料
34.本实施例选用chom-b03培养基作为基础培养基，选用chom-s03和chom-s04培养基作为流加培养基，均购自上海张江生物技术有限公司；protein a亲和层析柱也购自上海张江生物技术有限公司。谷氨酸和pngase f购自sigma-aldrich；色谱系统采用waters公司的acquity uplc h-class system，荧光检测器采用采用waters公司的acquity uplc荧光检
测器。葡萄糖测定试剂盒和氨测定试剂盒购自南京建城生物工程研究所。
35.本实施例选用美国模式培养物集存库(atcc)提供的cho-k1ccl-61tm细胞作为表达系统表达重组抗体。将细胞保持在37.0℃和150rpm的摇瓶中，在5％co2的环境中培养，每3天传代至每毫升5.0
×
105个细胞的密度，共培养12天。
36.2.主要实验方法
37.1)谷氨酸的补充
38.在本发明一个实施例中，从第0天开始，将谷氨酸(购自sigma-aldrich)每日添加到基础培养基chom-b03中，浓度梯度从0g/l到3.0g/l。在本发明另一个实施例中，在第0天，第3天，第5天和第7天将谷氨酸分别添加到基础培养基chom-b03中，终浓度为3.0g/l。
39.2)分批补料实验
40.将存活率高于90％的细胞以每毫升0.5～1.0
×
106个细胞的浓度接种到工作体积为100ml的装有chom-b03基础培养基的500ml摇瓶中。从第2天开始，每天补充1.5％的chom-s03和0.15％的chom-s04培养基作为流加培养基，并每天测试培养液中的葡萄糖浓度。从第1天开始，通过添加浓度为30％的葡萄糖浓缩液将葡萄糖浓度维持在3.0g/l。每天对培养液取样以进行细胞计数和化学分析。
41.3)重组蛋白定量
42.将细胞培养液以1000rpm的速度离心5分钟，然后按照制造商的说明将上清液通过protein a亲和层析柱。
43.4)电荷异质性分析
44.通过阳离子交换色谱法(iex)分析电荷变体。首先将细胞培养上清液如上所述在protein a亲和层析柱上纯化，然后在acquity uplc h-class system上进行分析，检测波长为280nm。
45.5)n-联糖基化分析
46.将纯化后的蛋白质在37℃下用pngase f消化过夜。用冷乙醇沉淀去糖基化的蛋白质并离心混合物后，将上清液蒸发至干。用2-氨基苯甲酰胺(2-ab)标记释出并干燥的n-聚糖。用hilic-spe去除多余的标记剂，并将标记的n-聚糖蒸发至干。重构后，随后在hilic色谱柱(2.1
×
150mm，beh酰胺，1.7mm)上分离2-ab标记的n-聚糖，并通过acquity uplc荧光检测器进行检测。
47.表1为在基础培养基中添加谷氨酸的糖基化情况。从第0天开始向基础培养基chom-bo3中补充谷氨酸，每天分别添加1.5％的chom-so3和0.15％的chom-so4作为流加培养基。
48.表1.在基础培养基中添加谷氨酸的纯化蛋白的糖基化情况
[0049] 对照谷氨酸0.5g/l谷氨酸1.0g/l谷氨酸2.0g/l谷氨酸3.0g/lg0f(％)65.70
±
1.5664.40
±
0.1468.30
±
1.2770.15
±
0.9171.10
±
0.14g1f’(％)6.85
±
0.497.50
±
0.015.85
±
0.075.45
±
1.485.00
±
0.70g1f(％)19.60
±
0.9920.65
±
0.2117.05
±
0.9114.75
±
1.3414.85
±
1.48g2f(％)2.05
±
0.212.45
±
0.071.75
±
0.211.35
±
0.631.20
±
0.14甘露糖5(％)2.35
±
0.072.00
±
0.142.90
±
0.562.80
±
0.982.90
±
1.13
[0050]
上述每种条件下的糖基化分布如表1所示。g0f表示糖基化组成中的半乳糖修饰为
0，而g1f和g1f’均表示一个半乳糖修饰，但位置不同。g2f代表两个半乳糖修饰。与对照组相比，可以看出，当谷氨酸添加量大于1.0g/l时，g0f的百分比增加，而半乳糖基化水平降低，表现为g1f，g1f
′
和g2f百分比均降低。因此，由表1可知，补充谷氨酸能够相对降低抗体的半乳糖基化水平。
[0051]
实施例2.不同谷氨酸浓度对细胞生长的影响
[0052]
本实施例中，在第0天将谷氨酸分别以0(对照)，0.5、1.0、2.0和3.0g/l的浓度加入基础培养基中，每种条件下的活细胞密度，细胞活率，蛋白浓度和酸性峰比例依次见附图1～4。对于对照组，由图1可见，在第6天活细胞密度从约1.0
×
106个细胞/ml增加至最大16-18
×
106个细胞/ml，之后由于细胞死亡而逐渐降低。当使用0.5g/l和1.0g/l的谷氨酸时，最大活细胞密度几乎相同，但是，随着谷氨酸浓度增加到2.0g/l和3.0g/l，活细胞密度开始降低，且在补充高于3.0g/l的谷氨酸时进一步降低。由图2可见，与对照组相比，补充3.0g/l谷氨酸的实验组细胞活率增加，其趋势与活细胞密度一致。用protein a法测定蛋白浓度，发现在不同条件下的蛋白浓度差异不显著，如图3所示。用iex法测定电荷异质性，并分别计算酸性峰、碱性峰和主峰的浓度。当将谷氨酸从0.5g/l升至3.0g/l时，与对照组相比，碱性峰比例差异不显著，但是，酸性峰的比例以剂量依赖的方式显著降低，并且随着时间的推移，随着酸性峰的比例降低，观测到主峰的比例同步升高，如图4所示。
[0053]
实施例3.不同谷氨酸添加时间对细胞生长的影响
[0054]
本实施例中，在第0、3、5和7天分别添加谷氨酸。每种条件下的活细胞密度，细胞活率，蛋白浓度和酸性峰比例依次见附图5～8。由图5可见，与在第0天补充谷氨酸相比，在第3、5和7天加入谷氨酸对细胞生长的影响最小，最大细胞活率达到对照组的90％。从第6天开始，谷氨酸延迟的出峰时间开始对细胞活率有负面影响，而在第5天和第7天补充谷氨酸，对细胞活率的影响差异微小，如图6所示。与不补充谷氨酸和在第0天补充谷氨酸相比，在第3天补充谷氨酸使得蛋白浓度显著增加，但如果在第3天以后补充谷氨酸，蛋白浓度的改善则不明显，如图7所示。在不同的谷氨酸补充时间下，酸性峰的比例没有显著差异，而碱性峰的比例随着补充时间的延迟而增加。对于主峰，可以清楚地看到，在第3天和第0天补充谷氨酸并没有显著差异，如图8所示。根据上述条件和结果的比对，可知在第3天补充谷氨酸，能够提高蛋白浓度并降低酸性峰。
[0055]
结论：
[0056]
综上所述，本发明研究了在基础培养基中添加谷氨酸的细胞培养方法并评估了不同浓度和不同添加时间的谷氨酸补充对细胞生长的影响。由上述各实施例可知，补充3.0g/l的谷氨酸可有效降低酸性峰，同时保持碱性峰，最终使得主峰提升。本发明进一步发现，在第3天补充3.0g/l的谷氨酸，能够增加蛋白浓度和同时降低酸性峰，且不影响细胞生长。因此，在第3天补充3.0g/l的谷氨酸是本发明细胞培养方法的最优选。