由乳果糖制备低聚半乳糖的方法与流程

由乳果糖制备低聚半乳糖的方法
1.本发明涉及一种对患有低聚半乳糖(gos)相关过敏的受试者和患有乳糖不耐受的受试者是可接受的gos制剂。
2.常规的gos包含通过β-半乳糖苷酶催化的、由连续转半乳糖基化反应产生的半乳糖单元和末端葡萄糖单元链。某些gos组分在人母乳和牛初乳中天然存在。典型的gos制剂主要包含二糖至六糖。
3.已经报告了gos的各种生理功能，包括刺激肠道中双歧杆菌生长、支持正常肠道转运、促进自然防御、增强矿物质吸收以及刺激免疫功能和降低炎症的能力。gos因其促进双歧杆菌、乳杆菌和其他肠道细菌生长的益生元效应而受到了特别关注。因此，gos通常用于婴儿配方食品、乳杆菌发酵饮料、酸奶、果汁和饮品中。这些含gos食品中的一些被日本消费者事务局(consumer affairs agency)认证为“特定保健用食品(food for specified health uses)”，并且gos被美国食品药品监督管理局(u.s.food and drug administration)认证为公认安全(gras)物质(gras公告：grn 233、236、285、286、334、484、489、495、518和569)。
4.gos常规地通过将含乳糖饲料与β-半乳糖苷酶接触来制备。所得的gos是具有不同聚合度(dp)的低聚半乳糖的混合物，包含乳糖。全世界3岁以上的人口中有很大一部分患有乳糖不耐受，在食用含乳糖组合物后可能会导致腹痛、胃气胀、腹泻、胀气和恶心。常规的gos包含乳糖，并且因此可能会导致这些症状。
5.因此，需要生产不含乳糖的gos。通过从常规的gos中去除乳糖来解决这个问题不是切实可行的选择，因为去除乳糖需要使用乳糖水解酶(乳糖酶)，它不仅会水解乳糖，而且会水解其他gos组分，导致gos功能丧失。
6.用于生产常规的gos的β-半乳糖苷酶是在许多微生物如环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、米曲霉(aspergillus oryzae)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)、独特掷孢酵母(sporobolomyces singularis)和发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)中生产的那些酶。β-半乳糖苷酶在其三维结构上不同，导致糖苷键的立体选择性和区域选择性的形成。例如，衍生自曲霉属(aspergillus)的真菌β-半乳糖苷酶主要生产β1-6键(从而产生主要包含β1-6键的gos制剂，其可以称为“6
’‑
gos”)，而衍生自环状芽孢杆菌的细菌β-半乳糖苷酶主要生产β1-4键(产生主要包含β1-4键的gos制剂，其也可以称为“4
’‑
gos”)。此外，由环状芽孢杆菌(b.circulans)生产的β-半乳糖苷酶具有特别强的转半乳糖基化活性。因此，由环状芽孢杆菌制备的gos销往世界各地。
7.自其进入市场(1999)以来，大约超过1亿的婴儿已食用含有由环状芽孢杆菌制备的gos的婴儿配方食品。它已被证明是安全成分，具有fda承认的gras状态。然而，在过去的几年中，东南亚报告了少量的非常罕见的gos相关过敏病例(约百万分之2)。研究已表明，存在于gos中的某些低聚糖结构可能使非常敏感的受试者产生过敏反应。
8.因此，本发明的目的是提供一种gos制剂，该gos制剂被患有乳糖不耐受的受试者以及具有对通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶或米曲霉β-半乳糖苷酶获得的常规的gos有过
敏反应的受试者良好耐受。
9.本发明已实现这一目的，本发明涉及通过将含乳果糖饲料与衍生自微生物土生蝶孢银耳(papiliotrema terrestris)的β-半乳糖苷酶接触来生产gos制剂。
10.微生物“土生蝶孢银耳”的曾用名是“土生隐球菌(cryptococcus papiliotrema terrestris)”。因此，名称“土生隐球菌(cryptococcus terrestris、c.terrestris)”和“土生蝶孢银耳(papiliotrema terrestris、p.terrestris)”是指相同生物体。
[0011]“衍生自土生蝶孢银耳的β-半乳糖苷酶”意指由被分类为土生蝶孢银耳的(野生型菌株或突变体菌株的)微生物产生的β-半乳糖苷酶，或者使用来自被分类为土生蝶孢银耳的(野生型菌株或突变体菌株的)微生物的β-半乳糖苷酶基因通过基因工程程序获得的β-半乳糖苷酶。因此，术语“衍生自土生蝶孢银耳的β-半乳糖苷酶”还涵盖由宿主微生物产生的重组酶，该宿主微生物中已引入获得自土生蝶孢银耳的β-半乳糖苷酶基因(或其经修饰的基因)。
[0012]
所得的gos制剂不同于由乳糖制成的常规的gos，因为它在还原端具有果糖而不是葡萄糖残基。因此，我们也将这种乳果糖衍生的gos称为fgos。
[0013]
这种fgos在临床上不含乳糖，这意味着除乳糖之外的低聚糖与乳糖的比率是至少10。优选地，通过本发明的工艺获得的fgos基本上不含乳糖，这意味着它不包含超过微量(即以干物质计不超过1wt％、优选不超过0.5wt％、并且最优选不超过0.1wt％)的乳糖。在一个最优选的实施例中，根据本发明获得的fgos不包含任何乳糖。
[0014]
此外，根据本发明的工艺允许获得fgos制剂，无需任何纯化或浓缩步骤以去除乳果糖或单糖，该fgos制剂包含以干物质计30-60wt％、优选40-60wt％的低聚半乳糖。这种低聚糖的内容物不包括乳果糖，但确实包括除乳果糖之外的dp2低聚糖。这种fgos制剂的其他成分主要由乳果糖和单糖(果糖、半乳糖、葡萄糖)组成。
[0015]
由乳果糖生产gos在现有技术中是已知的。例如，c.guerrero等人，food chemistry[食品化学]138(2013)2225-2232，披露了使用衍生自三种不同来源的β-半乳糖苷酶由乳糖和乳果糖生产gos。据发现，来自乳果糖的gos收率在米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶的情况下最高，而在环状芽孢杆菌衍生的β-半乳糖苷酶的情况下最低。当从乳糖开始时，则发现顺序相反：在环状芽孢杆菌衍生的β-半乳糖苷酶的情况下获得最高收率；在米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶的情况下获得最低收率。
[0016]
如以下实例所示，现已发现土生蝶孢银耳衍生的β-半乳糖苷酶甚至比米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶更适合用于从乳果糖生产gos。
[0017]
此外，用本发明的工艺获得的fgos制剂在受试者中具有降低的(ige介导的)过敏反应。换句话说，与由环状芽孢杆菌或米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶产生的gos制剂相比，当将这种fgos制剂施用于患有至少一种类型的gos相关过敏(即，由环状芽孢杆菌衍生的β-半乳糖苷酶产生的gos和/或由米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶产生的gos引起的过敏)的受试者时，其引起的过敏反应降低。更特别地，与通过环状芽孢杆菌或米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶获得的gos制剂相比，根据本发明的fgos制剂在受试者的皮肤点刺测试中和/或在对从受试者分离的血液样品进行的嗜碱性粒细胞活化测试中的得分降低。
[0018]
而且由于fgos制剂在临床上不含乳糖，因此患有乳糖不耐受的受试者也对它耐受良好。
[0019]
因此，本发明还涉及一种用于至少部分预防受试者对gos制剂的超敏反应的方法，该方法包括向所述受试者施用根据本发明的fgos制剂或包含所述fgos制剂的营养组合物。
[0020]
受试者是哺乳动物，特别是人类。虽然受试者可能有任何年龄，但受试者的年龄优选至少18个月、优选至少24个月、甚至更优选至少3岁(36个月)、并且最优选至少13岁。
[0021]
年龄在18个月或以下的受试者中尚未报告罕见的gos相关过敏，并且乳糖不耐受通常不会在2岁以下发生。
[0022]
考虑到在东南亚(例如新加坡、日本)4
’‑
gos和/或6
’‑
gos相关过敏的局部发生率以及在亚洲人群中大量的乳糖不耐受，受试者优选地是(东南)亚裔。
[0023]
用于制造fgos制剂的β-半乳糖苷酶本身可从专利申请us 2019-119662(源自pct/jp 2016/089001)中获知。
[0024]
在wo 2019/002304中，披露了使用这种酶来生产低过敏原性gos。所述低过敏原性gos获得自常规的乳糖饲料，因此可能会导致乳糖不耐受受试者的健康问题。
[0025]
fgos制剂能以营养组合物的形式施用于受试者。这种营养组合物包含(i)可通过本发明的工艺获得的fgos制剂和(ii)至少一种另外的成分，该至少一种另外的成分选自由蛋白质来源、益生菌、脂质来源和碳水化合物组成的组。
[0026]
如本文所用，营养组合物是指出于营养目的进入消化道的任何组合物或配制品，无论是固态、液态或气态。因此，营养组合物可以是食品类或饮品类。根据本发明的营养组合物的实例是婴儿配方食品、成长奶粉(gum)、乳杆菌发酵饮料、酸奶、食品补充剂和营养增强剂。
[0027]
可存在于营养组合物中的蛋白质来源的实例包括乳清蛋白(例如乳清蛋白浓缩物或乳清蛋白分离物)、酪蛋白(例如胶束酪蛋白分离物)、乳蛋白浓缩物或分离物、和/或植物蛋白(例如大豆蛋白)。在一个优选的实施例中，蛋白质来源是低过敏原性或非过敏原性蛋白质来源。这包括可施用于对膳食蛋白质(更特别地是牛乳蛋白)不耐受的受试者而不会诱导过敏反应的蛋白质水解物。这样的蛋白质水解物的实例是包含分子量低于10,000da的水解残基的水解乳清蛋白和具有最大3000da的肽的酪蛋白水解物。
[0028]
可存在于营养组合物中的碳水化合物来源的实例是二糖(例如蔗糖)、单糖(例如葡萄糖)、和麦芽糖糊精、淀粉以及具有益生元效应的碳水化合物来源。乳糖的存在显然是不希望的。
[0029]
可存在于营养组合物中的脂质来源的实例是甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、磷脂、鞘脂、脂肪酸、及其酯或盐。脂质可以具有动物、植物、微生物或合成源。特别令人感兴趣的是多不饱和脂肪酸(pufa)，例如γ-亚麻酸(gla)、二高γ-亚麻酸(dhgla)、花生四烯酸(aa)、十八碳四烯酸(sa)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸(dpa)和共轭亚油酸(cla)。cla在保护儿童免于湿疹和呼吸道疾病方面很重要。这特别涉及cla的顺式9、反式11和顺式12异构体。合适的植物脂质来源的实例包括葵花油、高油酸葵花油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、大豆油等。动物源的合适的脂质来源的实例包括乳脂，例如无水乳脂(amf)、奶油等。在一个优选的实施例中，使用乳脂和植物源的脂质的组合。
[0030]
营养组合物可进一步包含益生菌。在本发明的上下文中，术语“益生菌”是指益生细菌的菌株。益生细菌是本领域已知的。合适地，益生细菌不经基因修饰。合适的益生细菌包括双歧杆菌属(例如，短双歧杆菌(b.breve)、长双歧杆菌(b.longum)、婴儿双歧杆菌
(b.infantis)、两歧双歧杆菌(b.bifidum))的细菌，乳杆菌属(例如，嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、类干酪乳杆菌(l.paracasei)、约氏乳杆菌(l.johnsonii)、植物乳杆菌(l.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、干酪乳杆菌(l.casei)、乳酸乳杆菌(l.lactis))的细菌，以及链球菌属(例如，嗜热链球菌(s.thermophilus))的细菌。短双歧杆菌和长双歧杆菌是尤其合适的益生菌。可以例如从健康的人乳喂养的婴儿的粪便中分离合适的短双歧杆菌菌株。益生元和益生菌的组合也称为“合生元”。在本发明的上下文中，益生菌能以任何合适的浓度，合适地以治疗有效量或“有效治疗量”存在于组合物中。合适地，益生菌以10
2-10e
13 cfu/g组合物干重、合适地10
5-10
12
cfu/g、最合适地10
7-10
10
cfu/g的量包括在本发明的组合物中。
[0031]
此外，营养组合物可含有一种或多种常规的微量成分，例如维生素、抗氧化剂、矿物质、游离氨基酸、核苷酸、牛磺酸、肉碱和多胺。合适的抗氧化剂的实例是bht、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素e、α和β胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素和磷脂。
[0032]
本发明的工艺中使用的β-半乳糖苷酶已经在wo 2019/002304中广泛披露。它可以从土生蝶孢银耳菌株mm13-f2171或其突变体菌株m2和m6中获得。突变体菌株(m2和m6)可通过用uv处理进行诱变的方式从土生蝶孢银耳菌株mm13-f2171中获得。土生蝶孢银耳菌株mm13-f2171和m2已按如下所述保藏在保藏机构，并且易于获得。
[0033]
《土生蝶孢银耳菌株mm13-f2171》
[0034]
保藏机构：国立技术与评估研究院专利微生物保藏机构(patent microorganisms depositary,national institute of technology and evaluation)(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8，122室，292-0818(room 122,2-5-8kazusa kamatari,kisarazu-shi,chiba,292-0818,japan))。鉴别参考：土生隐球菌mm13-f2171。保藏日期：2015年12月10日。保藏号：nite bp-02177；
[0035]
《土生蝶孢银耳菌株m2》
[0036]
保藏机构：国立技术与评估研究院专利微生物保藏机构(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8，122室，292-0818)。鉴别参考：土生隐球菌apc-6431。保藏日期：2015年12月10日。保藏号：nite bp-02178因此，在一个实施例中，用于本发明的酶衍生自土生蝶孢银耳菌株mm13-f2171(保藏号：nite bp-02177)或apc-6431(保藏号：nite bp-02178)。
[0037]
在另外的实施例中，酶包含根据seq id no:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列，或者与seq id no:1、2、3或4中任一项具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％同一性的氨基酸序列。
[0038]
us 2019-119662描述了由衍生自蝶孢银耳属微生物的突变体菌株(突变体菌株酶1、2和3)产生的三种类别的β-半乳糖苷酶，并确定了它们的氨基酸序列。发现这三种β-半乳糖苷酶具有野生型菌株酶(该野生型菌株酶如seq id no:1所示)的全长氨基酸序列的部分序列，该部分序列是从其基因序列推导的。特别地，这些突变体酶是如下酶：具有其中缺失野生型菌株酶的全长氨基酸序列的n末端130个氨基酸残基的氨基酸序列的酶，出于描述的目的，该酶被称为“突变体菌株酶1”(参见seq id no:2)；具有其中缺失野生型菌株酶的全长氨基酸序列的n末端136个氨基酸残基的氨基酸序列的酶(参见seq id no:3)，出于描述的目的，该酶被称为“突变体菌株酶2”；以及具有其中缺失野生型菌株酶的全长氨基酸序列的n末端141个氨基酸残基的氨基酸序列的酶(参见seq id no:4)，该酶被称为“突变体菌株
酶3”。
[0039]
在这种情况下，术语“等效氨基酸序列”意指与参考氨基酸序列(即seq id no:1至4中任一项的氨基酸序列)部分不同的氨基酸序列，但该差异基本上不影响该蛋白质的功能(β-半乳糖苷酶活性)。因此，具有该等效氨基酸序列的多肽链的酶显示β-半乳糖苷酶活性。
[0040]
术语“氨基酸序列中的部分差异”通常意指由构成该氨基酸序列的一个至多个(例如，最多3、5、7或10个)氨基酸的缺失或取代，或一个至多个(例如，最多3、5、7或10个)氨基酸的添加、插入或其组合引起的氨基酸序列中的突变(改变)。只要维持β-半乳糖苷酶活性(该活性会在一定程度上变化)，氨基酸序列的差异就是可接受的。只要满足条件，氨基酸序列的差异的位置就没有特别限制，并且该差异可出现在多个位置。术语“多个”意指例如对应于总氨基酸的小于约20％、优选小于约15％、更优选小于约10％、甚至更优选小于约5％、并且最优选小于约1％的数目。更特别地，等效蛋白质与参考氨基酸序列具有例如约80％或更多、优选约85％或更多、更优选约90％或更多、非常优选约95％或更多、甚至更优选约97％或更多、并且最优选约99％或更多的同一性。
[0041]
氨基酸序列的差异可出现在多个位置。优选地，通过在对于β-半乳糖苷酶活性不是必需的氨基酸残基中进行保守的氨基酸取代来获得等效蛋白质。术语“保守的氨基酸取代”意指一个氨基酸残基被具有类似特性的侧链的另一个氨基酸残基取代。
[0042]
氨基酸残基根据其侧链分为几个家族，如碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。保守的氨基酸取代优选地是在一个家族中氨基酸残基之间的取代。
[0043]
两个氨基酸序列或两个核酸序列(下文中，术语“两个序列”用于表示两个序列中的任一个)之间的同一性(％)可以通过以下程序来确定。首先，对两个序列进行比对，以最佳地比较这两个序列(例如，可以将空位引入第一序列以优化相对于第二序列的比对)。当第一序列中特定位置处的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中对应位置处的分子彼此相同时，将这些位置处的分子定义为是相同的。两个序列之间的同一性是由这两个序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性(％)＝100
×
相同位置的数目/位置的总数)。优选地，考虑优化这两个序列的比对所需的空位的数目和大小。有关确定两个序列之间的同一性的更多信息，参见wo 2019/002304，第17页第11行至第18页第7行。
[0044]
具有上述氨基酸序列的用于在本发明的工艺中使用的酶也可以通过基因工程技术来制备。例如，通过编码本发明的酶的dna转化适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌(escherichia coli))，并收集在转化体中表达的蛋白质，从而制备本发明的酶。根据预期用途对收集的蛋白质进行适当处理。可对由此获得的作为重组蛋白质的酶进行多种修饰。例如，可以通过使用载体产生重组蛋白质来获得由与任何肽或蛋白质连接的重组蛋白质组成的酶，该载体中已插入编码该酶的dna连同其他适当的dna。另外，可以进行修饰以引起糖链和/或脂质的添加，或者n末端或c末端处理。这些修饰允许例如提取重组蛋白质、简化纯化或添加生物学功能。
[0045]
如在us 2019-119662中所述的，用于在本发明的工艺中使用的酶有利地通过转化
体产生，该转化体中引入了编码衍生自土生蝶孢银耳的β-半乳糖苷酶(ec 3.2.1.23)的重组dna，使得该基因作为外源分子存在。优选地，使用上述载体通过转染或转化制备该转化体。只要可以表达本发明的酶，宿主细胞就没有特别限制，并且它可以选自例如，芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、环状芽孢杆菌等)，乳酸菌(例如乳球菌(lactococcus)、乳杆菌、链球菌(streptococcus)、明串珠菌(leuconostoc)、双歧杆菌等)，其他细菌(例如埃希氏菌(escherichia)、链霉菌(streptomyces)等)，酵母(例如酵母菌(saccharomyces)、克鲁维酵母菌(kluyveromyces)、念珠菌(candida)、圆酵母菌(torula)、球拟酵母菌(torulopsis)、毕赤酵母菌(pichia)、裂殖酵母菌(schizosaccharomyces)等)，以及丝状真菌(真菌纲)(例如曲霉属真菌如米曲霉和黑曲霉(aspergillus niger)、青霉属真菌、木霉属真菌、镰刀菌属真菌等)。
[0046]
根据本发明的工艺涉及在约50℃-75℃、更优选约63℃-73℃、更优选约65℃-70℃的优选温度下将含乳果糖饲料与β-半乳糖苷酶接触。
[0047]
含乳果糖饲料优选地是含水乳果糖糖浆，该糖浆包含40-58wt.％乳果糖、更优选45-55wt.％乳果糖、最优选50-55wt％乳果糖。
[0048]
含乳果糖饲料的ph范围优选是3.5-6.5、更优选4.5-6.0、并且最优选5-5.5。ph可通过食品级缓冲液(例如优选浓度为0.5mm-10mm的柠檬酸盐缓冲液)调节。
[0049]
酶的优选使用浓度为1-20lu/克的乳果糖、更优选1-10lu/克的乳果糖、甚至更优选2-8lu/克的乳果糖、并且最优选3-6lu/克的乳果糖。根据反应温度和反应时间，也可以使用更低或更高的浓度：更高的反应温度和/或更长的反应时间允许更低的酶浓度。
[0050]
酶能以粉末形式(例如，经冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥)或液体形式(例如，溶于磷酸缓冲溶液、三乙醇胺缓冲溶液、三盐酸缓冲溶液或good缓冲溶液中)使用。
[0051]
在一个特定的实施例中，酶以固定化形式使用。酶固定化的各种方法在本领域是已知的。它们通常包含多孔运载体，β-半乳糖苷酶通过共价结合、通过物理吸收(电荷-电荷或范德瓦耳斯相互作用(van der waals interaction))、通过凝胶封装或其组合固定化在该多孔运载体上。此外，还可以应用不含运载体的固定化酶，例如clec(交联酶晶体)或clea(交联酶聚集体)。
[0052]
可以促进酶的直接共价结合的运载体是优选的，因为它们易于操作并且不会渗漏到反应混合物中。固体运载体的实例是活化的丙烯酸聚合物、优选官能化的聚甲基丙烯酸酯基质。例如，可以使用六亚甲基氨基官能化的聚甲基丙烯酸酯基质(sepabeads)或微孔丙烯酸环氧活化的树脂，如eupergit c 250l。
[0053]
固定化酶的使用允许重复分批操作系统，该系统涉及几个连续批次(“周期”)的gos合成。它还允许酶的回收利用，从而实现酶的半连续操作和多次重复使用。
[0054]
从本发明的工艺获得的fgos可以使用常规的方法分离和纯化，例如使用纳米过滤或顺序式模拟移动床(sequential simulated moving bed，ssmb)。
[0055]
实例
[0056]
实验中使用以下来源的β-半乳糖苷酶：
[0057]
米曲霉(乳糖酶14ds，购自天野酶公司(amano enzyme))，
[0058]
米曲霉(tolerase 100，购自dsm公司)
[0059]
米曲霉(生物乳糖酶f，购自凯瑞生化科技公司(kerry bioscience))
[0060]
土生蝶孢银耳(β-半乳糖苷酶pt，购自天野酶公司)
[0061]
一般反应条件如下：将35克乳果糖添加至35克0.01m柠檬酸钠缓冲液中，ph 6.5。随后，将酶溶于10ml水中并且添加以启动反应。在大多数酶中，使用20乳糖单位(lu)/克乳果糖。然而，在200乳糖单位(lu)/克乳果糖的浓度中使用乳糖酶14ds和tolerase 100，因为它们在使用的一般反应条件下活性低。
[0062]
将反应混合物置于具有定轨摇床的水浴中，用恒温器控制在50℃。反应48小时后，通过添加1.5％1m hcl淬灭反应，随后在95℃下加热30分钟。
[0063]
基于单个糖的峰面积百分比，通过hplc(赛默飞世尔科技戴安公司(thermofisher scientific dionex)，型号ics 3000)分析反应混合物中的fgos含量。fgos含量通过以下公式计算：
[0064]
fgos含量(％，ds)＝100％-半乳糖％-葡萄糖％-乳糖％-乳果糖％-果糖％。
[0065]
使用不同酶获得的fgos含量总结在表1中。表1示出了从土生蝶孢银耳获得的酶的收率远高于从米曲霉获得的β-半乳糖苷酶的收率；根据c.guerrero等人认为是最好的酶。
[0066]
乳果糖的两种结构单元(即果糖和半乳糖)之间的比率被用作酶性能的指标。当比率≤1时，表明通过延长反应时间不能再增加所达到的fgos含量，因为它只能水解底物或形成的fgos，米曲霉衍生的β-半乳糖苷酶也是如此。对于土生蝶孢银耳衍生的β-半乳糖苷酶，果糖/半乳糖的比率大于2，表明fgos收率可以通过延长反应时间进一步优化。
[0067]
表1-通过不同的β-半乳糖苷酶形成的fgos组合物
[0068][0069]
*通过单糖和剩余底物的峰百分比所估计。
[0070]
hplc色谱图示出了与由米曲霉衍生的酶产生的fgos相比，由土生蝶孢银耳衍生的酶产生的fgos的峰要多得多。低聚糖的结构多样性对于满足肠道中不同双歧杆菌的营养需求和结合病原体的诱饵功能(decoy function)非常重要。因此，从本发明的工艺衍生的fgos似乎具有更高的营养价值。
[0071]
由不同酶形成的fgos的聚合度(dp)总结在表2中。由于无法将乳果糖与由乳果糖形成的其他dp2 fgos组分区分开来，因此给出了每种酶的总fgos 乳果糖含量。由于乳果糖本身是不可消化的(益生元)糖，因此无需将其与fgos分开。
[0072]
在使用土生蝶孢银耳酶的实验中，fgos 乳果糖含量在85％左右。相比之下，从米
曲霉酶获得的fgos 乳果糖低于35％，这可能是由于它们固有的高水解活性，如其高单糖含量所示。
[0073]
表2-通过不同的β-半乳糖苷酶形成的fgos的dp组合物
[0074][0075]
用乳糖作为底物重复用土生蝶孢银耳的实验。结果示于表3中。它示出了fgos(从乳果糖获得)的dp2含量显著高于从乳糖获得的gos的dp2含量。
[0076]
这种高dp2 fgos组分可以对婴儿肠道微生物区系构成优势，因为可以选择性地促进婴儿结肠中婴儿型双歧杆菌(如短双歧杆菌)的生长。
[0077]
表3-由土生蝶孢银耳β-半乳糖苷酶形成的乳糖gos和乳果糖gos的对比
[0078]