一种检测PCDHB6基因表达丰度的试剂在制备卵巢癌干性诊断试剂中的应用

和seq id no.8所示。
12.本发明优选的，所述检测pcdhb6基因蛋白丰度的试剂所采用的方法包括western blot、免疫组化和/或质谱。
13.本发明优选的，所述卵巢癌干性指原位卵巢癌组织细胞、卵巢癌腹水中的卵巢癌细胞、卵巢癌腹膜上的卵巢癌细胞、卵巢癌转移于其它人体部位的卵巢癌组织和细胞、原代培养卵巢癌细胞、卵巢癌细胞系细胞的干性程度。
14.本发明优选的，所述卵巢癌干性对临床的诊断意义为卵巢癌干性高应代表卵巢癌恶性程度高。
15.本发明优选的，所述卵巢癌干性对临床的诊断意义为卵巢癌干性高应代表卵巢癌患者生存期短。
16.本发明优选的，所述卵巢癌干性的标志物为cd44和cd133,cd44和cd133在卵巢癌细胞中的表达丰度应随卵巢癌细胞干性程度的提高而升高。
17.本发明的有益效果在于：本发明首次公开了检测pcdhb6基因表达丰度的试剂可用于制备卵巢癌干性诊断试剂的用途。检测pcdhb6基因mrna丰度的试剂所采用的方法包括探针法、qrt-pcr法和测序法。检测pcdhb6基因蛋白丰度的试剂所采用的方法包括western blot、免疫组化、质谱。本发明试剂可实现原位卵巢癌组织细胞、卵巢癌腹水中的卵巢癌细胞、卵巢癌腹膜上的卵巢癌细胞、卵巢癌转移于其它人体部位的卵巢癌组织和细胞、原代培养卵巢癌细胞、卵巢癌细胞系细胞的干性程度的检测，从而为临床卵巢癌干性检测方法提供新选择，为卵巢癌恶性程度的判断和患者生存的预测提供了新参考。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为tcga数据库中pcdhb6基因高表达和低表达卵巢癌组织中cd44和cd133基因表达水平的差异分析；
20.图2为外源过表达pcdhb6基因抑制卵巢癌干细胞干性标志物mrna水平的作用效果；
21.图3为外源过表达pcdhb6基因抑制卵巢癌干细胞微球形成能力的作用效果；
22.图4为pcdhb6基因在卵巢癌干细胞和分化卵巢癌细胞中的mrna水平差异分析结果；
23.图5为pcdhb6基因的低表达预示卵巢癌患者差预后的kaplan-meier分析结果；
24.图6为roc曲线分析pcdhb6基因的mrna表达水平诊断卵巢癌细胞系干性准确性的分析结果；
25.图7为roc曲线分析pcdhb6基因的mrna表达水平诊断卵巢癌组织干性准确性的分析结果。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，实施例中未注明具体条件实验方法，通常按照常规条件
或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例不作为对本发明的限定。
27.本发明中caov3卵巢癌干细胞和分化caov3卵巢癌细胞参见：jingshu liu，jiangfengqiu,zhiqi zhang,lei zhou,yunzhe li,dongyan ding,yang zhang,dongling zou,dongwang,qi zhou,tingyuan lang，sox4 maintains the stemness of cancer cells via transcriptionallyenhancing hdac1 revealed by comparative proteomics study.cell biosci.2021 jan 22。
28.实施例1、pcdhb6表达高低与卵巢癌组织中cd44和cd133基因表达水平分析
29.自tcga(the cancer genome atlas)数据库中下载卵巢癌患者mrna、mirna表达数据，从中提取pcdhb6、cd44、cd133的表达数据，对数据进行清洗和预处理，将样本分为 pcdhb6基因低表达和高表达两组，检测两组中cd44、cd133的表达差异。如图1所示， pcdhb6基因低表达和高表达两组组织中，cd44、cd133的表达有显著差异，表明pcdhb6 基因与卵巢癌细胞的干性有关。
30.实施例2、在卵巢癌细胞中外源过表达pcdhb6基因抑制卵巢癌细胞的干性
31.(1)卵巢癌细胞的培养
32.实验用人卵巢癌细胞系caov-3购自美国类型培养物保藏中心(atcc)，在含有10％胎牛血清的改良eagle培养基(dmem)中，置于37℃、含有5％co2的孵箱中使用常规贴壁培养皿培养。
33.(2)卵巢癌干细胞的培养
34.使用超低吸附培养皿，在含有10ng/ml fgf和20ng/ml egf的dmem/f-12的无血清培养基悬浮培养，得到微球后，进行离心，得到卵巢癌干细胞，可进行下一步传代或实验。
35.(3)建立pcdhb6基因过表达卵巢癌干细胞与对照组
36.利用慢病毒转染制备pcdhb6基因过表达卵巢癌干细胞细胞株和空载体对照细胞株。 pcdhb6基因过表达慢病毒载体为pcslenti-cmv-pcdhb6-3xflag-pgk-puro-wpre，由pcdhb6基因连入pcslenti-cmv-mcs-3xflag-pgk-puro-wpre的mcs而得，对照组由 pcslenti-cmv-mcs-3xflag-pgk-puro-wpre包装空载体感染。提取实验组与对照组细胞的mrna，使用qrt-pcr法检测实验组及对照组的卵巢癌干细胞标志物cd44、cd133 mrna 表达量，cd44的检测引物为f:5
’‑
ctgccgctttgcaggtgta-3’(seq id no.1)，r: 5
’‑
cattgtgggcaaggtgctatt-3’(seq id no.2)；cd133的检测引物为f:5
’‑
ttcttgaccgactgagaccca-3
’ꢀ
(seq id no.3)，r:5
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tcatgttctccaacgcctctt-3’(seq id no.4)；内参gapdh的检测引物为 f:5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’(seq id no.5)，r:5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seq idno.6)，如图2所示，实验组cd44、cd133 mrna表达明显下降，说明pcdhb6基因对卵巢癌干细胞的干性有抑制作用。将实验组与对照组接种于超低吸附六孔板中，每孔接种3,000 个细胞，培养两周后观察统计微球数目，student's t-test检验统计学意义，p＜0.05结果有统计学意义，结果如图3所示，实验组细胞微球数目显著低于对照组，表明pcdhb6基因对卵巢癌干细胞成微球能力有抑制作用。
37.实施例3、pcdhb6基因mrna在卵巢癌干细胞中的表达低于已分化的卵巢癌细胞
38.将caov-3细胞分别进行贴壁培养和悬浮培养，得到已分化的卵巢癌细胞和卵巢癌干细胞，分别提取mrna，使用qrt-pcr法检测其pcdhb6 mrna表达水平，student's t-test检验统计学意义，p＜0.05结果有统计学意义。pcdhb6的检测引物为f:5
’‑
agccgtgtgtgctacctttc-3
’ꢀ
(seq id no.7)，r:5
’‑
ccggtgtctaaatcgtgtgc-3’(seq id no.8)；内参gapdh的检测引物为f:5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’(seq id no.5)，r:5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seq idno.6)。悬浮培养的卵巢癌干细胞中pcdhb6表达水平明显低于贴壁培养的已分化卵巢癌细胞，如图4所示，表明检测pcdhb6的表达水平可用于判断卵巢癌干性程度，pcdhb6的表达丰度与卵巢癌干细胞干性程度呈负相关。
39.实施例4、pcdhb6基因低表达预示卵巢癌病人不良预后
40.自tcga(the cancer genome atlas)数据库中下载卵巢癌患者mrna、mirna表达数据及随访数据，提取pcdhb6基因的表达数据及患者生存数据，根据pcdhb6 mrna的表达水平将患者分为两组，进行数据清洗和处理，去除混杂因素后，通过kaplan-meier方法分析 pcdhb6的表达与患者长期生存的相关性，结果如图5所示，pcdhb6的低表达与患者的预后差相关(p＜0.05)。
41.实施例5、roc曲线分析pcdhb6基因mrna表达水平诊断体外培养的卵巢癌细胞系干性准确性
42.实验选用10个人卵巢癌细胞系caov-3、sk-ov-3、a2780、ovcar3、h08910、ovca420、coc1、cov504、hey、cp70均购自美国类型培养物保藏中心(atcc)，分别进行贴壁培养及悬浮培养，提取细胞mrna，使用qrt-pcr法检测其pcdhb6 mrna表达水平，以 gapdh为内参，计算δct
pcdhb6-δct
gapdh
的值并记录，绘制roc曲线，如图6所示，cut-off 值为8.729，其检测卵巢癌干性程度灵敏度为60％，特异性93.33％。同时，将tcga数据库中cd44、cd133 mrna均高表达和cd44、cd133 mrna均低表达的两组患者的pcdhbmrna表达量提取，经过数据清洗和与处理后,绘制roc曲线，结果如图7所示，cut-off值为-0.09761时，灵敏度为61.97％，特异性66.67％。验证了pcdhb6表达水平作为检测卵巢癌干性程度的新标志物的可行性。
43.因此，pcdhb6可以作为卵巢癌干性程度的标志物，通过检测pcdhb6 mrna水平和检测isyna1蛋白水平判断卵巢癌的干性程度，pcdhb6 mrna水平和pcdhb6蛋白水平与卵巢癌干细胞干性程度呈负相关低表达。即低表达表明卵巢癌干性程度高，卵巢癌患者的不良预后。
44.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。