一种可诱导细胞巨泡式死亡的化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种可诱导细胞巨泡式死亡的化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病，目前临床上绝大多数化疗药物通过细胞凋亡机制杀死肿瘤细胞而起到治疗效果，但由于肿瘤异质性和肿瘤细胞在药物处理下不断的进化使得自身不断适应外部环境，逐渐对化疗药物产生耐药性，从而制约了化疗药物在肿瘤治疗中临床应用。巨泡式死亡(methuosis)是近年来发现的一种非凋亡细胞死亡的新形式，其主要特征是细胞质积累大量的透明空泡，但不具备细胞凋亡的一般特征。因此，开发诱导细胞巨泡式死亡的抗肿瘤药物，对提高恶性肿瘤化疗效果具有重要的科学意义和临床价值。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术，本发明提供一种可诱导细胞巨泡式死亡的化合物及其制备方法和应用，以解决现有凋亡机制杀死肿瘤细胞的化疗药物引起的耐药性问题。
4.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种可诱导细胞巨泡式死亡的化合物，为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺，其化学式为
[0005][0006]
本发明还提供了上述可诱导细胞巨泡式死亡的化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)于冰水浴中，将2-溴丙二醛和5-氨基吡唑依次加入乙醇中，并搅拌反应4～6min后，其后逐滴加入浓盐酸，再于室温下反应5～7h，其后过滤、洗涤滤饼、干燥，得浅棕色固体；
[0008]
(2)将步骤(1)所得浅棕色固体、4-氨基苯硼酸频哪醇酯、四(三苯基膦)钯和碳酸钾混合后，加入二氧六环/水混合液，于惰性气体保护下、70～90℃反应7～9h，再蒸发除去溶剂，残余物经萃取、洗涤、干燥后，再经纯化，得黄棕色固体；
[0009]
(3)将步骤(2)所得黄棕色固体溶于二氯甲烷中，再加入n,n-二异丙基乙胺于冰水浴冷却8～12min后，逐滴加入氯乙酰氯，并于惰性气体保护下室温反应1.5～2.5h，再经萃取、洗涤、干燥、纯化后，即得。
[0010]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0011]
进一步，浅棕色固体的化学式为黄棕色固体的化学式为
[0012]
进一步，2-溴丙二醛、5-氨基吡唑、乙醇和浓盐酸的用量比为30mol:30mol:36l:4ml，其中浓盐酸的浓度为12摩尔/升；浅棕色固体、4-氨基苯硼酸频哪醇酯、四(三苯基膦)钯、碳酸钾和二氧六环/水混合液的用量比为5mol:5mol:5mol:7.5mol:12ml，其中二氧六环/水混合液中二氧六环与水的体积比为5:1；黄棕色固体、二氯甲烷、n,n-二异丙基乙胺和氯乙酰氯的用量比为5mol:40l:6.5mol:6mol。
[0013]
进一步，步骤(1)中，洗涤为用饱和碳酸氢钠溶液、水、乙醇依次洗涤；干燥为于50～70℃真空干燥10～14h。
[0014]
进一步，步骤(2)中萃取的萃取剂为甲醇与二氯甲烷按体积比1:9混合的混合液；洗涤为用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤；干燥为用无水硫酸钠干燥；纯化为柱层析，所用溶剂为乙酸乙酯与正己烷按体积比1:3混合的混合液。
[0015]
进一步，步骤(3)中，萃取的萃取剂为二氯甲烷；洗涤为用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤；干燥为用无水硫酸钠干燥；纯化为柱层析，所用溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比1:49混合的混合液。
[0016]
本发明还提供了上述可诱导细胞巨泡式死亡的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0017]
进一步，肿瘤包括结肠癌、肺腺癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌和神经胶质瘤细胞。
[0018]
本发明的有益效果是：
[0019]
本发明的2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺具有诱导肿瘤细胞死亡的作用，这种细胞死亡是由该化合物诱导细胞内形成许多巨大空泡导致，称之为巨泡式死亡。该化合物具有较高的临床应用价值和良好的开发前景，可用于肿瘤疾病的治疗。本发明还提供了一种简便且适合大量合成化合物(2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺)的方法。
附图说明
[0020]
图1为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺诱导多种肿瘤细胞发生巨泡式死亡及对正常细胞hfc的作用图(其中肿瘤细胞包括：结肠癌细胞hct116、肺腺癌细胞h1975、宫颈癌细胞hela、肝癌细胞hep3b、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞u87mg和u251；coppa为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺)；
[0021]
图2为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)抑制乳腺癌细胞mda-mb-231的细胞增殖图；
[0022]
图3为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)抑制乳腺癌细胞mda-mb-231皮下肿瘤生长及对动物体重的影响(其中图(a)为coppa抑制乳腺癌细胞mda-mb-231皮下肿瘤照片；图(b)为coppa抑制乳腺癌细胞mda-mb-231皮下肿瘤重量统计图；图
(c)为coppa对balb/c-nu小鼠体重的影响图)；
[0023]
图4为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)的制备流程图；
[0024]
图5～6依次为本发明实施例中步骤(2)、(3)中的质谱图；
[0025]
图7～9为2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺的核磁谱图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0027]
实施例1
[0028]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)于冰水浴中，将30mmol 2-溴丙二醛和30mmol 5-氨基吡唑依次加入36ml乙醇中，并搅拌反应5min后，其后逐滴加入4ml 12mmol/ml的浓盐酸，再于室温下反应6h，其后过滤，再用20ml饱和碳酸氢钠溶液、20ml水、6ml乙醇依次洗涤滤饼并重复1次、再于60℃真空干燥12h，得浅棕色固体5.70g(收率：96％)。
[0030]
(2)将5mmol步骤(1)所得浅棕色固体、5mmol 4-氨基苯硼酸频哪醇酯、5mmol四(三苯基膦)钯和7.5mmol碳酸钾混合后，加入12ml二氧六环/水混合液(其中二氧六环与水的体积比为5:1)，再于氮气保护下、80℃反应8h，再蒸发(40℃，0.5h)除去溶剂，残余物经80ml甲醇/二氯甲烷混合液(其中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:9)萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80毫升饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为乙酸乙酯与正己烷按体积比1:3混合的混合液1.2l)纯化，得黄棕色固体0.86g(收率：82％)；1h nmr(400mhz,dmso)δ9.21(d,j＝2.2hz,1h),8.84(d,j＝2.2hz,1h),8.17(d,j＝2.3hz,1h),7.60(d,j＝2.7hz,1h),7.51(d,j＝8.4hz,2h),6.68(d,j＝8.8hz,2h),5.38(s,2h)ppm.ms(esi,m/z):211[m h]

,252[m ch3cn h]

。
[0031]
(3)将5mmol步骤(2)所得黄棕色固体溶于40ml二氯甲烷中，再加入6.5mmol n,n-二异丙基乙胺于冰水浴冷却10min后，逐滴加入6mmol氯乙酰氯，并于氮气保护下室温反应2h，再经80ml二氯甲烷萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80ml饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比1:49混合的混合液1.5l)纯化后，即得浅黄色固体1.26克(收率：88％)。1h nmr(400mhz,dmso)δ10.48(s,1h),9.44(s,1h),8.94(s,1h),8.25(s,1h),7.84(d,j＝8.2hz,2h),7.73(d,j＝8.2hz,2h),6.77(s,1h),4.30(s,2h)ppm.
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.87,149.19,146.93,145.30,138.65,131.98,128.88,127.39,120.91,119.88,96.12,43.65ppm.ms(esi,m/z):287[m h]

,328[m ch3cn h]

。
[0032]
实施例2
[0033]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0034]
(1)于冰水浴中，将30mmol 2-溴丙二醛和30mmol 5-氨基吡唑依次加入36ml乙醇中，并搅拌反应4min后，其后逐滴加入4ml 12mmol/ml的浓盐酸，再于室温下反应5h，其后过滤，再用20ml饱和碳酸氢钠溶液、20ml水、6ml乙醇依次洗涤滤饼并重复1次、再于50℃真空干燥14h，得浅棕色固体；
[0035]
(2)将5mmol步骤(1)所得浅棕色固体、5mmol 4-氨基苯硼酸频哪醇酯、5mmol四(三苯基膦)钯和7.5mmol碳酸钾混合后，加入12ml二氧六环/水混合液(其中二氧六环与水的体积比为5:1)，再于氮气保护下、70℃反应9h，再蒸发(40℃，0.5h)除去溶剂，残余物经80ml甲
醇/二氯甲烷混合液(其中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:9)萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80毫升饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为乙酸乙酯与正己烷按体积比1:3混合的混合液1.2l)纯化，得黄棕色固体；
[0036]
(3)将5mmol步骤(2)所得黄棕色固体溶于40ml二氯甲烷中，再加入6.5mmol n,n-二异丙基乙胺于冰水浴冷却8min后，逐滴加入6mmol氯乙酰氯，并于氮气保护下室温反应1.5h，再经80ml二氯甲烷萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80ml饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比1:49混合的混合液1.5l)纯化后，即得浅黄色固体。
[0037]
实施例3
[0038]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0039]
(1)于冰水浴中，将30mmol 2-溴丙二醛和30mmol 5-氨基吡唑依次加入36ml乙醇中，并搅拌反应6min后，其后逐滴加入4ml 12mmol/ml的浓盐酸，再于室温下反应7h，其后过滤，再用20ml饱和碳酸氢钠溶液、20ml水、6ml乙醇依次洗涤滤饼并重复1次、再于70℃真空干燥10h，得浅棕色固体；
[0040]
(2)将5mmol步骤(1)所得浅棕色固体、5mmol 4-氨基苯硼酸频哪醇酯、5mmol四(三苯基膦)钯和7.5mmol碳酸钾混合后，加入12ml二氧六环/水混合液(其中二氧六环与水的体积比为5:1)，再于氮气保护下、90℃反应7h，再蒸发(40℃，0.5h)除去溶剂，残余物经80ml甲醇/二氯甲烷混合液(其中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:9)萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80毫升饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为乙酸乙酯与正己烷按体积比1:3混合的混合液1.2l)纯化，得黄棕色固体；
[0041]
(3)将5mmol步骤(2)所得黄棕色固体溶于40ml二氯甲烷中，再加入6.5mmol n,n-二异丙基乙胺于冰水浴冷却12min后，逐滴加入6mmol氯乙酰氯，并于氮气保护下室温反应2.5h，再经80ml二氯甲烷萃取、80ml饱和碳酸氢钠溶液和80ml饱和食盐水洗涤、6g无水硫酸钠干燥后，再经柱层析(溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比1:49混合的混合液1.5l)纯化后，即得浅黄色固体。
[0042]
实验例1
[0043]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡：
[0044]
分别将培养好的结肠癌细胞hct116、肺腺癌细胞h1975、宫颈癌细胞hela、肝癌细胞hep3b、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞u87mg和u251及正常结肠细胞fhc按3000个/孔接种于96孔板中，将细胞置于co2培养箱中(37℃、5％co2)培养过夜。然后，向不同肿瘤细胞中加入coppa，使其终浓度为1μm，对照孔中加入等体积dmso，将细胞继续培养12小时。最后用高内涵拍照系统拍照，观察细胞内空泡形成及细胞死亡情况。结果如图1所示，红色箭头表示细胞内形成的巨大空泡。1μm coppa诱导肿瘤细胞胞内形成大量的空泡，并诱导细胞发生巨泡式死亡；而对正常结肠fhc细胞没有任何作用。
[0045]
实验例2
[0046]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)抑制乳腺癌细胞mda-mb-231增殖作用：
[0047]
将乳腺癌细胞mda-mb-231按3000个/孔接种于96孔板中，将细胞置于co2培养箱中
(37℃、5％co2)培养过夜。实验组加入2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)使其终浓度为0.5、1、2、5、10、20、40μm，对照组加入相应体积的dmso。继续培养48小时后每孔加入10μl mtt溶液继续孵育4小时，吸弃培养基并加入200μl dmso试剂，摇床(300rpm振摇10min)；使用酶标仪(biotek cytation5)读取570nm处od值，细胞生长抑制率＝(1-od实验/od对照)
×
100％，并利用graphpad prism 8计算ic50值。结果显示，2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)处理48h时对乳腺癌细胞mda-mb-231的ic50值为6.4
±
0.3μm。
[0048]
实验例3
[0049]
2-氯-n-(4-(吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)苯基)乙酰胺(coppa)抑制乳腺癌细胞mda-mb-231皮下肿瘤生长：
[0050]
将4周龄大的balb/c-nu雌性小鼠饲养于spf级动物房内，并在小鼠左上前肢皮下接种107个mda-mb-231细胞，待肿瘤大小约100mm3时，将小鼠分为：对照组、coppa 20mg/kg组和coppa 40mg/kg组，并进行给药。给药方式：腹腔给药；给药体积：100μl；给药频率：3天/次；给药次数：10次。并在给药同时，记录小鼠体重。最后处死小鼠，取出肿瘤进行拍照，并称重。实验结果如图3所示，coppa能抑制mda-mb-231皮下肿瘤的生长，具有显著的抗肿瘤活性，通过体重显示，coppa无明显毒副作用。
[0051]
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。