1.本技术涉及生物医药领域，特别涉及订书肽、其制备方法以及制药用途。
背景技术：
：：2.白介素-17a(il-17a)是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，其作用于炎症调控过程下游的多种细胞、介导不同的生理过程并产生相应的生物学效应。研究发现，il-17a与多种自身炎症性疾病(aid)和自身免疫性疾病(ad)(例如银屑病(pso)、强直性脊柱炎(as)、类风湿关节炎(ra)、银屑病关节炎(psa)、多发性硬化病(ms)和克罗恩病(cd))相关，可以作为治疗这些疾病的靶点。3.近年来，多肽药物成为药物行业里发展最快的领域之一。相比于小分子药物，多肽药物拥有更高的靶标亲和力和更低的系统毒性，但是多肽由于缺乏蛋白骨架支撑，更容易在溶液中失去天然的结构构象从而导致活性降低。此外，多肽相比于蛋白具有更小的尺寸，虽然使其获得了更高的生物膜穿透性，但是也带来了许多成药性上的阻碍，例如在循环系统中更容易被酶解和被肾小球过滤。4.发明概述5.本发明的目的之一，在于提供一种以il-17为靶点的多肽药物。发明人通过酰胺化反应在il-17a的亲和多肽hap上引入不同种类的氨基酸连接子，构建了一系列订书修饰的hap。相比于线性hap，所述订书修饰的hap在螺旋结构的稳定性、靶标亲和力和/或抗酶解能力等方面可以得到改善，有潜力成为靶向il-17的多肽抑制剂药物，由此提供了下述发明。6.在一个方面，本技术提供了一种订书肽，其包含选自以下的主链氨基酸序列：7.(a)如ihvtipadlwdwink(seqidno:1)所示的氨基酸序列；8.(b)与seqidno:1具有至少80％、86.7％或93％序列同一性的氨基酸序列；或9.(c)与seqidno:1相比具有1个、2个或3个氨基酸残基的添加或置换的氨基酸序列；10.其中所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基通过连接子偶联成环，所述连接子包含至少一个氨基酸；11.所述i为大于或等于1的整数，优选地为小于或等于8的整数。12.在另一个方面，本技术提供了制备所述订书肽的方法，其包括以下步骤：13.(1)提供所述连接子和所述订书肽的主链；14.(2)利用所述连接子将所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。15.在又一个方面，本技术提供了一种包含所述订书肽的药物组合物，其包含所述的订书肽。16.进一步地，本技术还提供了所述订书肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与il-17a过度表达相关的疾病。17.发明详述18.术语定义19.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。20.本发明中，“订书肽”是指订书策略修饰的多肽，“订书策略”指的是将多肽锚定残基的侧链与侧链或者侧链与端基交联成环，以类似订书钉形式的侧链环来“钉”住多肽骨架以稳定多肽的二级结构构象。订书策略能使得多肽预先形成稳定的螺旋构象从而减少靶标结合过程中的“熵罚”。21.本发明中，hap(highaffinityil-17apeptideantagonist)是一种可与il-17a结合的多肽。该多肽能够特异性地与il-17a结合，并抑制il-17a与其受体il-17ra的相互作用。hap的示例性氨基酸序列可如seqidno.1所示。本发明中，术语“hap”意欲包含hap的变体，所述“变体”是指这样的多肽，其氨基酸序列与hap的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1个、2个、3个或更多)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60％、70％、80％、86.7％、93％、96％或更高的同一性，并且其与hap具有相同的功能，所述“功能”可以是如下功能中的一个或者多个：i)与il-17a结合，ii)抑制il-17a与其受体il-17ra的相互作用。22.本发明中，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。23.本发明中，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。24.本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。在本技术中，除非明确指出或者根据上下文可以明确确定，否则在描述氨基酸残基的位置时，通常以hap的序列为参照。25.在本说明书中，除非特别说明，否则表示氨基酸序列中的氨基酸残基的位置的编号将n末端的氨基酸残基设为1而在c末端方向上依次分配。26.本发明中，术语“药学可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。27.本发明中，“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。28.对受试者给予的药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。29.本技术中，发明人通过酰胺化反应在hap的侧链上引入不同种类的氨基酸连接子，构建了一系列订书策略修饰的hap。修饰后的hap在靶标亲和力，生物膜穿透性和/或抗酶解能力等方面得到提高。30.在一个方面，本技术提供了一种订书肽，其包含选自以下的主链氨基酸序列：31.(a)如ihvtipadlwdwink(seqidno:1)所示的氨基酸序列；32.(b)与seqidno:1具有至少80％、86.7％或93％序列同一性的氨基酸序列；或33.(c)与seqidno:1相比具有1个、2个或3个氨基酸残基的添加或置换的氨基酸序列；34.其中所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基通过连接子偶联成环，所述连接子包含至少一个氨基酸；所述i为大于或等于1的整数，优选地为小于或等于8的整数。35.在一些实施方案中，i为7或10。36.本发明中，所述连接子包含的氨基酸可以是l-氨基酸，也可以是d-氨基酸，可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸。37.发明人推测，天然氨基酸作为多肽的合成子，它的手性取向决定着多肽的螺旋走向是右手螺旋还是左手螺旋。所以它相比于非天然的手性连接子拥有和多肽更高的结构和生物兼容度的匹配性。此外，天然氨基酸是商业可得的手性化合物，在做修饰的时候可以避免繁复的合成工作。因此，在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸是天然的α-氨基酸。38.进一步地，发明人发现，使用一些手性氨基酸构建的订书肽非对映异构体彼此之间存在螺旋度的显著差异，在化学生物学性质方面也可能存在差异。其中，l-氨基酸连接子修饰的多肽更能维持原始线性多肽序列的螺旋构象，具有更优越的提升订书肽类药性质的能力。因此，在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸是l-氨基酸。39.此外，可以使用各种类型的氨基酸形成连接子，例如极性氨基酸或非极性氨基酸，碱性氨基酸或酸性氨基酸，疏水性氨基酸或亲水性氨基酸，有侧链的氨基酸或没有侧链的氨基酸。所述连接子包含的氨基酸包括但不限于：40.非极性氨基酸(疏水氨基酸)：甘氨酸(gly)丙氨酸(ala)缬氨酸(val)亮氨酸(leu)异亮氨酸(ile)苯丙氨酸(phe)色氨酸(trp)甲硫氨酸(met)脯氨酸(pro)；41.极性氨基酸(亲水氨基酸)：42.1)极性不带电荷/极性中性氨基酸：苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、半胱氨酸(cys)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、酪氨酸(tyr)；43.2)碱性氨基酸(带正电氨基酸)赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)；44.3)酸性氨基酸(带负电氨基酸)天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)。45.进一步地，不同氨基酸连接子所带有的侧链的尺寸和性质不同，其中一些可以对多肽起着重要的调控作用，还能作为二次修饰的把手来进行进一步的功能化衍生。在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸选自glu、ala、lys、ser。46.在另一些实施方案中，可以使用不带侧链的氨基酸形成连接子。在一些实施方案中，所述连接子包含的氨基酸为gly。47.发明人发现，对hap序列上的一些位点进行突变，有利于消除订书肽侧链环本身对多肽螺旋构象的负面影响，可以提高靶标亲和力和抗酶解能力。48.在一些实施方案中，hap主链氨基酸序列与seqidno:1相比具有1、2或3个氨基酸残基的置换(例如保守置换或非保守置换)。在一些优选的实施方案中，所述置换位于第7位、第10位、第14位或其任意组合。49.在一些优选的实施方案中，所述置换选自：第7位的氨基酸残基被置换为glu，第10位的氨基酸残基被置换为ala，第14位的氨基酸残基被置换为lys，或其任意组合。50.在一些更为优选的实施方案中，所述置换选自：第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys。51.特别优选的置换包括但不限于：52.(1)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu；53.(2)第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala；54.(3)第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；55.(4)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，以及第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala；56.(5)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；57.(6)第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；58.(7)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；59.(8)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys，以及第1、2、3、4、5、6、10、11或12位的氨基酸残基被置换为ala。60.在一些特别优选的实施方案中，所述订书肽包含选自以下的主链氨基酸序列：61.ihvtipedlwdwikk(seqidno:2)62.ihvtipedladwikk(seqidno:3)63.ihvtipedlkdwink(seqidno:4)64.ihvtipadledwikk(seqidno:5)65.进一步地，还可以对本发明订书肽的主链的n端和/或c端进行修饰。在一些实施方案中，所述订书肽主链的n端被乙酰化修饰，从而减少多肽外切酶对其的水解作用，提高多肽半衰期。66.用于形成本发明订书肽的偶联反应可以是酰胺化反应。在一些实施方案中，订书肽所包含的的连接子通过肽键将所述订书肽主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。67.在一些实施方案中，所述订书肽主链的第i位的氨基酸残基的侧链可以包含游离羧基，所述订书肽主链的第i 3位、第i 4位或第i 7位的氨基酸残基的侧链可以包含游离氨基，所述连接子包含的氨基酸与所述游离羧基和所述游离氨基分别形成肽键。68.在另一些实施方案中，所述订书肽主链的第i位的氨基酸残基的侧链可以包含游离氨基，所述订书肽主链的第i 3位、第i 4位或第i 7位的氨基酸残基的侧链可以包含游离羧基，所述连接子包含的氨基酸与所述游离氨基和所述游离羧基分别形成肽键。69.本技术提供的订书肽包括但不限于以下各式所表示的订书肽：70.订书肽1a71.订书肽1b72.订书肽2a73.订书肽2b74.订书肽3a75.订书肽3b76.订书肽4a77.订书肽4b78.订书肽579.订书肽7a80.订书肽7b81.订书肽8a82.订书肽8b83.订书肽9a84.订书肽9b85.订书肽11a86.订书肽11b87.订书肽12a88.订书肽12b89.订书肽13a90.订书肽13b91.订书肽1492.订书肽1593.在一个方面，本技术提供了上述订书肽的制备方法，其包括以下步骤：94.(1)提供所述连接子和所述订书肽的主链；95.(2)利用所述连接子将所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。96.本发明的订书肽可以采用多肽合成仪，通过固相合成方法合成。可以使用合适的有机溶剂,例如dmf溶液；使用合适的脱保护试剂(例如含20％哌啶的dmf溶液)；使用过量氨基酸(例如4倍当量)和适当的缩合试剂(例如hatu/hobt)以及适量的碱(例如diea)进行适当时间的缩合反应进行多次合成。如有需要，在进行大位阻氨基酸如脯氨酸，异亮氨酸，苏氨酸和缬氨酸的缩合之后，之后一个氨基酸的缩合周期会被重复多次。可以使用α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸进行固相合成，例如fmoc-ala-oh,fmoc-asn(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-trp(boc)-oh,fmoc-val-oh,fmoc-glu(oall)-oh,fmoc-lys(dde)-oh.97.可以采用如下路线进行氨基酸连接子的合成：[0098][0099]示例性的合成方法包括：[0100]1)对α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸进行脱保护；[0101]2)使脱保护后的氨基酸与过量的氯甲酸烯丙酯进行反应，得到α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子。[0102]脱保护反应可以在室温、哌啶存在的条件下进行。合适的溶剂包括但不限于二氯甲烷。[0103]氨基酸与氯甲酸烯丙酯可以在碱(例如碳酸氢钠)存在的条件下进行。合适的溶剂包括但不限于四氢呋喃/水混合溶剂。[0104]在获得订书肽的主链和氨基酸连接子之后，可以通过酰胺化反应实现偶联成环。示例性的方法包括：[0105]1)将主链上一个锚定位点的氨基酸侧链上的氨基的保护基去除，例如可以使用水合肼将氨基的dde保护基去除，得到裸露的氨基；[0106]2)通过酰胺化反应，将α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子连接到上一步裸露出的氨基上；[0107]3)去除氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基，以得到裸露的氨基，并去除主链上另一锚定位点的氨基酸侧链上的羧基保护基，以得到裸露的羧基；[0108]例如：用四三苯基膦钯处理，以去除氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基，同时去除主链上另一锚定位点的氨基酸侧链上的烯丙基保护基；[0109]4)通过酰胺化反应使上一步反应中被裸露的氨基和羧基缩合，形成订书肽。[0110]任选地，所述方法还包括：将主链上的其他保护基去除，和/或对订书肽进行纯化。[0111]在一个方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含本发明的任意订书肽。任选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。可用于本发明的药用载体包括但不限于填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。[0112]本发明的药物组合物可被制成各种合适的剂型，包括但不限于：口服剂型、注射剂型(例如适于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的剂型)、吸入剂型、粘膜给药剂型或者局部给药剂型。在某些实施方案中，所述药物组合物被制成口服剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、口服混悬液、微丸剂或微片剂。[0113]在一个方面，本技术提供了本发明的订书肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与il-17a过度表达相关的疾病，例如自身炎症性疾病(aid)和自身免疫性疾病(ad)，例如强直性脊柱炎(as)、类风湿关节炎(ra)、银屑病(ps)、银屑病关节炎(psa)、多发性硬化病(ms)、克罗恩病(cd)。[0114]在一个方面，本技术提供了含有本发明的订书肽的制剂。在某些实施方案中，所述制剂用于与il-17a结合。[0115]在一个方面，本技术提供了本发明的订书肽在制备制剂中的用途，所述制剂用于与il-17a结合。[0116]本发明的制剂可于体内或者体外施用；例如，所述制剂被施用至受试者体内，以与受试者体内的il-17a结合，或者，所述制剂被施用至体外的il-17a，以与体外的il-17a结合。[0117]在一个方面，本技术提供了治疗和/或预防受试者的与il-17a过度表达相关的疾病的方法，包括给有此需要的受试者施予治疗和/或预防有效量的本发明的订书肽或药物组合物。所述受试者可以为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。[0118]有益效果[0119]本发明获得了具有类药性质订书肽，它们比线性的hap多肽具有更高的酶解稳定性和/或细胞活性，有潜力成为白介素17a的多肽抑制剂药物，用于治疗这一靶点相关的疾病，如自身炎症性疾病和自身免疫性疾病。[0120]以下，适当地参照附图详细说明具体公开了本技术的实施方式。但是会有省略不必要的详细说明的情况。例如，有省略对已众所周知的事项的详细说明、实际相同结构的重复说明的情况。这是为了避免以下的说明不必要地变得冗长，便于本领域技术人员的理解。此外，附图及以下说明是为了本领域技术人员充分理解本技术而提供的，并不旨在限定权利要求书所记载的主题。附图说明[0121]图1为多肽1a(图1a)和多肽1b(图1b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0122]图2为多肽2a(图2a)和多肽2b(图2b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0123]图3为多肽3a(图3a)和多肽3b(图3b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0124]图4为多肽4a(图4a)和多肽4b(图4b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0125]图5为多肽5的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0126]图6为多肽6的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0127]图7为多肽7a(图7a)和多肽7b(图7b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0128]图8为多肽8a(图8a)和多肽8b(图8b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0129]图9为多肽9a(图9a)和多肽9b(图9b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0130]图10为多肽10的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0131]图11为多肽11a(图11a)和多肽11b(图11b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0132]图12为多肽12a(图12a)和多肽12b(图12b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0133]图13为多肽13a(图13a)和多肽13b(图13b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0134]图14为多肽14的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0135]图15为多肽15的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0136]图16显示了多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构表征结果，其中，图16a为多肽的圆二色谱结构(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图16b为多肽的螺旋度柱状图(inh2o，ph＝7.0at20℃)。[0137]图17显示了多肽4a/b和6的表征和测试结果，其中，图17a为多肽6的spr曲线图，图17b为多肽4a的spr曲线图，图17c显示了多肽6,4a/b对4ng/ml白介素17a与1ng/mltnf-α协同刺激正常人成纤维细胞所产生的白介素6的抑制作用，图17d显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的降解程度，图17e显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的半衰期。[0138]图18显示了多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构表征结果，其中，图18a为多肽的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图18b为多肽7-9a/b和10的椭圆率对比图。[0139]图19显示了多肽7a/b和6的表征和测试结果，其中，图19a为多肽6的spr曲线图，图19b为多肽7a的spr曲线图，图19c显示了多肽6,7a/b对白介素17a介导nhdf细胞产生的白介素6的抑制结果，图19d显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的降解程度，图19e显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的半衰期。[0140]图20显示了多肽11a、11b、12a、12b、13a、13b、14、15的螺旋结构的表征结果，其中，图20a为多肽11-13a/b，14,15的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图20b为多肽11-13a/b，14,15的椭圆率对比图。具体实施方式[0141]i.材料与方法[0142]所有商业可得的试剂(来自aldrich,glbiochem,tci,acros,j&k,等公司)在使用前均未进行进一步的纯化。所有的溶剂均为试剂级或高效液相色谱(hplc)级(来自fisher,sigma,acros,oceanpak公司)。无水的四氢呋喃(thf),二氯甲烷(dcm)，乙醚，甲苯和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)均是通过pure溶剂纯化系统(innovativetechnology,inc.)进oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-trp(boc)-oh,fmoc-val-oh,fmoc-glu(oall)-oh,fmoc-lys(dde)-oh.[0154]用于spps的rinkamide树脂(0.336mmol/g)购自glbiochem公司。[0155]3.2圆二色光谱(cd)表征订书肽[0156]多肽样品被以50μm的浓度溶解在水中。相应的cd光谱数据通过jasco公司的j-810圆二色光谱分光偏振计使用1毫米厚的比色皿测得。实验在室温下进行。数据通过在190纳米到250纳米之间以0.5纳米为间隔，200纳米每分钟的速度检测，平行重复三次测得。光谱结果通过在同样条件下检测水获得的基线求平均值和归一化。[0157]3.3表面等离子共振(spr)[0158]将hap多肽以及其订书肽衍生物与白介素17a蛋白结合后通过biacoret200表面等离子共振检测仪检测。白介素17a蛋白被溶解于10mm的醋酸溶液中(ph5.0,来自gehealthcare公司),并在有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(来自gehealthcare公司)活化剂的条件下被固定在cm5传感器芯片上。乙醇胺-盐酸溶液(1.0m,ph8.5,来自cytiva公司)被用于掩蔽芯片上未与蛋白质发生反应的位点。溶解在pbs(ph7.4)溶液中的不同浓度的订书肽分别流过芯片。芯片通过10mm的甘氨酸-盐酸溶液(ph2.0,来自gehealthcare公司)来进行每次进样后的再生。亲和力数据kd值通过biacoret200evaluationsoftware评估软件计算得到。[0159]3.4蛋白酶解实验[0160]订书肽以200μm的浓度被溶解在pbs溶液中。由pichiapastoris中表达的重组蛋白酶k(来自merck公司–cb539480–≥30u/mg)也被以0.2μm的浓度溶解在pbs溶液中。多肽和蛋白酶溶液各150微升以1:1的比例混合在一个1.5毫升的ep管中，ep管在37度下通过恒温摇床孵育。在每个选定的时间点，取出20微升的溶液，并加入12倍体积的乙腈/水从溶液终止反应以防止蛋白酶在hplc分析过程中仍有活性。平均值和标准偏差值(n＝3)已被计算并列出。[0161]3.5使用正常成人皮肤成纤维细胞(nhdf)的细胞实验[0162]培养在fgm-2培养基(来自lonza公司)的nhdf细胞(来自lonza公司,4×104个细胞每毫升)被以每孔1×104个细胞(250微升)的数量铺到48孔板中，并培养过夜(37℃,5％co2)。每孔中加入50微升用fgm-2培养基溶解的1ng/mltnf-α(来自peprotech公司)和4ng/mlil-17aprotein(来自novoprotein公司),8个溶解在fgm-2培养基中的浓度范围在1×10-11至1×10-4m的订书肽被加入孔中(每个浓度3个重复，200微升每孔)并继续培养48小时。收集细胞上清液并用il-6的elisa试剂盒(来自diaclone公司)进行检测以评估炎性细胞因子诱导的抑制活性。用biotek公司的synergyneo2酶标仪检测450纳米下平板吸光度。il-6浓度的计算以及图表绘制是通过graphpadprism7软件完成的。[0163]iv.氨基酸连接子的合成与鉴定[0164]通用步骤4.1[0165][0166]向圆底烧瓶中加入α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸(1倍当量)并用无水二氯甲烷溶解。搅拌溶液，并用注射器向其中滴加哌啶(5倍当量)。在常温下搅拌反应5小时。通过tlc确定反应物消耗殆尽后，用水萃取反应溶液3次，合并水层，并通过减压蒸馏除去液相，即可在无须纯化的情况下得到脱去α-氨基的9-芴基甲氧基羰基保护基的反应中间体。随后，向烧瓶中加入碳酸氢钠(1.2倍当量)水溶液，并搅拌混匀溶液。氯甲酸烯丙酯(1.2倍当量)的四氢呋喃(thf)溶液被滴加入溶液，搅拌后得到浅色溶液。12小时后，通过tlc监控反应是否完成。通过少量1m的氢氧化钠溶液碱化反应体系，并用乙酸乙酯(ea)洗涤三次。将水层用1m盐酸酸化至ph值等于3直到得到白色混悬液。使用ea萃取三次，合并有机层并用饱和食盐水洗涤一次，用无水硫酸镁干燥，并用砂芯漏斗抽滤。过滤后的溶液进行减压蒸馏以获得纯净的产品s1-s9(粘稠的淡黄色液体)。[0167]以下列出化合物5.1-5.4a/b和5.5的化学结构式以及核磁表征数据：[0168]n2-((allyloxy)carbonyl)-n6-(tert-butoxycarbonyl)-l-lysine(5.1a)[0169][0170]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.88(s,1h),6.29(s,1h),5.97–5.82(m,1h),5.67(s,1h),5.29(dd,j＝17.2,1.7hz,1h),5.19(dd,j＝10.4,1.5hz,1h),4.56(d,j＝5.7hz,2h),4.43–4.30(m,1h),3.18–2.94(m,2h),1.90–1.71(m,2h),1.51–1.36(m,13h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.98,156.20,132.63,117.81,79.49,65.87,53.63,40.05,31.83,29.49,28.39,22.29.[0171]n2-((allyloxy)carbonyl)-n6-(tert-butoxycarbonyl)-d-lysine(5.1b)[0172][0173]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(s,1h),6.34–6.10(m,1h),5.96–5.81(m,1h),5.76–5.60(m,1h),5.29(d,j＝17.1hz,1h),5.19(d,j＝10.5hz,1h),4.63–4.50(m,2h),4.43–4.28(m,1h),3.19–2.98(m,1h),1.95–1.68(m,2h),1.48–1.31(m,13h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.80,156.22,132.63,117.81,79.49,65.87,53.62,31.83,28.39,22.29.[0174]((allyloxy)carbonyl)-l-alanine(5.2a)[0175][0176]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,1h),6.71(s,1h),6.08–5.69(m,1h),5.30(dd,j＝17.3,1.7hz,1h),5.21(d,j＝9.9hz,1h),4.62–4.54(m,2h),4.45–4.32(m,1h),1.46(d,j＝7.2hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ177.42,155.81,132.45,118.00,65.98,49.44,18.37.[0177]((allyloxy)carbonyl)-d-alanine(5.2b)[0178][0179]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.17(s,1h),6.73(s,1h),6.05–5.76(m,1h),5.30(dd,j＝17.2,1.6hz,1h),5.21(d,j＝10.4hz,1h),4.66–4.53(m,2h),4.45–4.23(m,1h),1.45(d,j＝7.2hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ177.50,155.83,132.45,117.99,65.98,49.44,18.36.[0180](s)-2-(((allyloxy)carbonyl)amino)-5-(tert-butoxy)-5-oxopentanoicacid(5.3a)[0181][0182]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.96–5.82(m,1h),5.64–5.57(m,1h),5.30(d,j＝17.2hz,1h),5.20(d,j＝10.4hz,1h),4.56(d,j＝5.6hz,2h),4.36(s,1h),2.49–2.30(m,2h),2.26–1.89(m,2h),1.43(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ187.37,172.58,156.20,132.46,117.94,81.21,66.03,53.48,31.61,28.02,27.33.[0183](r)-2-(((allyloxy)carbonyl)amino)-5-(tert-butoxy)-5-oxopentanoicacid(5.3b)[0184][0185]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41(s,1h),5.99–5.80(m,1h),5.63–5.56(m,1h),5.29(dd,j＝17.2,1.7hz,1h),5.20(dd,j＝10.5,1.6hz,1h),4.69–4.50(m,2h),4.43–4.25(m,1h),2.46–2.29(m,2h),2.25–1.89(m,2h),1.43(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.76,172.55,156.16,132.45,117.95,81.21,66.03,53.33,31.60,28.02,27.31.[0186]n-((allyloxy)carbonyl)-o-(tert-butyl)-l-serine(5.4a)[0187][0188]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.42(s,1h),6.02–5.78(m,1h),5.62(d,j＝8.5hz,1h),5.31(d,j＝18.7hz,1h),5.21(d,j＝11.8hz,1h),4.58(d,j＝5.8hz,2h),4.51–4.29(m,1h),3.87(dd,j＝9.0,3.0hz,1h),3.58(dd,j＝9.0,4.0hz,1h),1.16(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.22,156.27,132.65,118.07,74.11,66.12,61.84,54.36,27.36.[0189]n-((allyloxy)carbonyl)-o-(tert-butyl)-d-serine(5.4b)[0190][0191]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.00–5.85(m,1h),5.59(d,j＝8.2hz,1h),5.32(d,j＝16.8hz,1h),5.23(dd,j＝10.5,1.5hz,1h),4.59(d,j＝5.6hz,2h),4.49–4.42(m,1h),3.89(dd,j＝8.8,3.3hz,1h),3.57(dd,j＝8.9,4.7hz,1h),1.18(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.53,156.15,132.51,117.96,74.33,66.01,61.71,54.24,27.25.[0192]((allyloxy)carbonyl)glycine(5.5)[0193][0194]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(s,1h),6.03–5.80(m,1h),5.61(s,0h),5.31(d,j＝17.2hz,1h),5.22(d,j＝10.3hz,1h),4.59(d,j＝5.7hz,1h),4.00(d,j＝5.8hz,1h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.02,156.69,132.37,118.07,66.21,42.45.[0195]v.订书肽的制备与鉴定[0196]通用步骤5.1[0197][0198]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，fmoc-lys(dde)-oh,fmoc-glu(oall)-oh以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，第14位赖氨酸侧链氨基的dde保护基经2％的水合肼dmf溶液处理2次，每次5分钟后被完全脱除。之后，α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子被通过酰胺化反应连接到上一步裸露出的氨基上。之后用四三苯基膦钯处理以同时脱去氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基和7位谷氨酸侧链上的烯丙基保护基。最后通过酰胺化反应使上一步反应中被裸露的氨基和羧基缩合，最终形成订书肽。[0199]之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去其他保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽产物。[0200]合成步骤5.2[0201][0202]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，使用dmf/醋酸酐/diea(8/1/1，v/v/v)的溶液处理2次，每次5分钟从而保护多肽裸露的n端氨基，之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽原料。将多肽原料溶解在加入了1/5体积乙腈的20mm碳酸氢铵溶液中(大约5mg/ml)，加入多肽原料1.5倍当量的tcep，并在室温下搅拌1小时以破坏二硫键，随后加入10倍当量的1,9-二溴壬烷，并在80℃下加热反应30分钟，随后用3倍体积的乙腈稀释反应体系，并通过反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽产物。[0203]合成步骤5.3[0204][0205]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，使用dmf/醋酸酐/diea(8/1/1，v/v/v)的溶液处理2次，每次5分钟从而保护多肽裸露的n端氨基，之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽原料。将多肽原料溶解在dmf中(约5mg/ml)，随后加入150微升含有100μm十氟联苯的dmf溶液(约2倍当量)，和1.5毫升含有50mmtris的dmf溶液，然后搅拌4.5小时。使用反相高效液相色谱(rp-hplc)确认反应完全后，减压蒸馏除去dmf，并将得到的多肽粗品用5毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。[0206]实施例1[0207]多肽1a的合成[0208][0209]多肽1a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.0-19.0分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽1a(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0210]图1a为多肽1a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝18.45分钟)；下：质谱数据，计算得到c99h150n24o23的相对分子质量:2044.43da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.22,[m 3h]3 m/z＝682.48；检测结果:1022.91,682.15.[0211]多肽1b的合成[0212][0213]多肽1b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.00-15.80分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽1b(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0214]图1b为多肽1b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.41分钟)；下：质谱数据，计算得到c99h150n24o23的相对分子质量:2044.43da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.22,[m 3h]3 m/z＝682.48；检测结果:1022.91,682.15.[0215]实施例2[0216]多肽2a的合成[0217][0218]多肽2a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.00-20.90分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽2a(21毫克,总产率21.2％)，产物为蓬松的固体。[0219]图2a为多肽2a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.33分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o23的相对分子质量:1987.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝994.57；检测结果:994.08.[0220]多肽2b的合成[0221][0222]多肽2b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-20.00分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽2b(18毫克,总产率18.2％)，产物为蓬松的固体。[0223]图2b为多肽2b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝18.48分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o23的相对分子质量:1987.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝994.57；检测结果:994.42.[0224]实施例3[0225]多肽3a的合成[0226][0227]多肽3a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.75-21.20分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽3a(22毫克,总产率21.9％)，产物为蓬松的固体。[0228]图3a为多肽3a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.15分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o24的相对分子质量:2003.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1002.67；检测结果:1002.37.[0229]多肽3b的合成[0230][0231]多肽3b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-18.60分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽3b(23毫克,总产率22.9％)，产物为蓬松的固体。[0232]图3b为多肽3b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.63分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o24的相对分子质量:2003.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1002.67；检测结果:1002.37.[0233]实施例4[0234]多肽4a的合成[0235][0236]多肽4a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.00-21.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽4a(15毫克,总产率14.7％)，产物为蓬松的固体。[0237]图4a为多肽4a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.45分钟)；下：质谱数据，计算得到c98h145n23o25的相对分子质量:2045.37da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.69；检测结果:1023.39.[0238]多肽4b的合成[0239][0240]多肽4b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为22.50-23.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽4b(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0241]图4b为多肽4b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝22.96分钟)；下：质谱数据，计算得到c98h145n23o25的相对分子质量:2045.37da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.69；检测结果:1023.39[0242]实施例5[0243]多肽5的合成[0244][0245]多肽5是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.75-21.00分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽5(14毫克,总产率14.2％)，产物为蓬松的固体。[0246]图5为多肽5的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝19.76分钟)；下：质谱数据，计算得到c95h141n23o23的相对分子质量:1973.31da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.66；检测结果:987.00[0247]实施例6[0248]多肽6的合成[0249][0250]多肽6是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.00-17.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽6(35毫克,总产率37.5％)，产物为蓬松的固体。[0251]图6为多肽6的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝16.46分钟)；下：质谱数据，计算得到c95h141n23o23的相对分子质量:1862.17da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝932.09；检测结果:931.44[0252]实施例7[0253]多肽7a的合成[0254][0255]多肽7a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.00-16.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽7a(12毫克,总产率12.4％)，产物为蓬松的固体。[0256]图7a为多肽7a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.85分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.30da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.65,[m 3h]2 m/z＝644.10；检测结果:965.38,643.86.[0257]多肽7b的合成[0258][0259]多肽7b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.00-13.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽7b(8毫克,总产率8.3％)，产物为蓬松的固体。[0260]图7b为多肽7b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.06分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.30da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.65,[m 3h]2 m/z＝644.10；检测结果:965.11,643.86.[0261]实施例8[0262]多肽8a的合成[0263][0264]多肽8a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.50-17.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽8a(11毫克,总产率11.8％)，产物为蓬松的固体。[0265]图8a为多肽8a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.11分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o23的相对分子质量:1872.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝937.10；检测结果:936.48.[0266]多肽8b的合成[0267][0268]多肽8b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为14.00-15.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽8b(13毫克,总产率13.9％)，产物为蓬松的固体。[0269]图8b为多肽8b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝14.90分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o23的相对分子质量:1872.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝937.10；检测结果:936.54.[0270]实施例9[0271]多肽9a的合成[0272][0273]多肽9a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.25-15.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽9a(16毫克,总产率16.0％)，产物为蓬松的固体。[0274]图9a为多肽9a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.43分钟)；下：质谱数据，计算得到c90h140n22o25的相对分子质量:1930.24da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝966.12；检测结果:965.45.[0275]多肽9b的合成[0276][0277]多肽9b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为13.25-15.15分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽9b(14毫克,总产率14.5％)，产物为蓬松的固体。[0278]图9b为多肽9b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝14.83分钟)；下：质谱数据，计算得到c90h140n22o25的相对分子质量:1930.24da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝966.12；检测结果:965.51.[0279]实施例10[0280]多肽10的合成[0281][0282]多肽10是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为11.50-12.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽10(21毫克,总产率23.1％)，产物为蓬松的固体。[0283]图10为多肽10的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝12.05分钟)；下：质谱数据，计算得到c85h135n21o23的相对分子质量:1819.14da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝910.57,[m 3h]2 m/z＝607.38；检测结果:910.02,607.14.[0284]实施例11[0285]多肽11a的合成[0286][0287]多肽11a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.50-16.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽11a(5.62毫克,总产率11.4％)，产物为蓬松的固体。[0288]图11a为多肽11a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.71分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h146n24o24的相对分子质量:1972.32da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.16,[m 3h]2 m/z＝658.44；检测结果:1972.42,986.87,658.07.[0289]多肽11b的合成[0290][0291]多肽11b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.50-13.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽11b(3.86毫克,总产率7.8％)，产物为蓬松的固体。[0292]图11b为多肽11b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.18分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h146n24o24的相对分子质量:1972.32da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.16,[m 3h]2 m/z＝658.44；检测结果:1972.49,986.87,658.14.[0293]实施例12[0294]多肽12a的合成[0295][0296]多肽12a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.50-13.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽12a(4.40毫克,总产率7.5％)，产物为蓬松的固体。[0297]图12a是多肽12a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.31分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.38da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.69,[m 3h]2 m/z＝644.13；检测结果:1929.38,965.31,643.79.[0298]多肽12b的合成[0299][0300]多肽12b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为21.50-22.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽12b(4.88毫克,总产率10.1％)，产物为蓬松的固体。[0301]图12b是多肽12b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为10-70％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝22.35分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.38da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.69,[m 3h]2 m/z＝644.13；检测结果:965.31,643.79.[0302]实施例13[0303]多肽13a的合成[0304][0305]多肽13a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.50-21.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽13a(5.02毫克,总产率10.6％)，产物为蓬松的固体。[0306]图13a是多肽13a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.83分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o24的相对分子质量:1888.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝945.10；检测结果:1888.38,944.84.[0307]多肽13b的合成[0308][0309]多肽13b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-18.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽13b(5.20毫克,总产率11.0％)，产物为蓬松的固体。[0310]图13b是多肽13b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.75分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o24的相对分子质量:1888.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝945.10；检测结果:1888.38,944.50.[0311]实施例14[0312]多肽14的合成[0313][0314]多肽14是通过步骤3.1&5.2制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为50-90％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为11.50-12.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽14(0.22毫克,总产率1.3％)，产物为蓬松的固体。[0315]图14是多肽14的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为50-90％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝11.63分钟)；下：质谱数据，计算得到c89h142n20o21s2的相对分子质量:1892.35da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝947.18；检测结果:946.74.[0316]多肽15的合成[0317][0318]多肽15是通过步骤3.1&5.3制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为27.50-28.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽15(0.35毫克,总产率3.0％)，产物为蓬松的固体。[0319]图15是多肽15的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为10-70％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝28.11分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h124f8n20o21s2的相对分子质量:2062.23da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1032.12；检测结果:1031.75.[0320]实验例1对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构的表征[0321]对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构进行表征，结果如表1和图16所示。表1为多肽的特征性的摩尔椭圆率。图16a为多肽的圆二色谱结构(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图16b为多肽的螺旋度柱状图(inh2o，ph＝7.0at20℃)。[0322]表1[0323][0324]从图16可以看出，带有l-lys的多肽1a的螺旋度显著高于带有d-lys连接子的多肽1b,这结果表明氨基酸连接子的l和d构型在调节订书肽的二级结构中起着重要的作用。相比于线性多肽6来说，多肽1-4a的螺旋度在修饰后能够保留甚至提升，然而多肽1-4b则降低。值得注意的是，连接子没有侧链的订书肽5也展现了略有降低的螺旋度。这说明对hap序列所采用的这种侧链环化策略，即便在没有连接子侧链参与的情况下，本身也会导致多肽的螺旋度有所下降。[0325]实验例2-4对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的生物学性质进行评价。[0326]实验例2[0327]本实验通过表面等离子共振技术(spr)评估多肽和其靶标蛋白白介素17a之间的亲和力。多肽的kd值展示在表2中。[0328]表2[0329][0330]可以看到，多肽非对映异构体1-4a的亲和力明显高于多肽5，而1-4b低于多肽5，可能的原因是l-连接子或许能帮助缓解侧链环对多肽二级结构的负面影响从而导致亲和力损失降低，而d-连接子则与其相反，加重了这种负面影响。[0331]图17a和图17b分别为多肽6和4a的spr曲线图。多肽以浓度梯度与固定在cm5芯片上的人白介素17a结合。动力学参数k(ka,kd)经由“globalfit”计算所得.kd值由下示等式计算所得,kd＝kd/ka。结果表明，尽管野生型的线性hap多肽的亲和力始终高于所有修饰过的多肽，但是从多肽6和4a的spr的拟合曲线来看,它们的结合速率和解离速率均差距较小。[0332]实验例3[0333]本实验利用膜表面表达有白介素17a受体的正常人成纤维细胞(nhdf)研究了多肽1a/1b和6的细胞活性。白介素17a和tnf-α单独使用均可以刺激细胞产生多种炎性因子，例如白介素6。当它们同时使用的时候，则可以协同作用来提高各自的效应，导致炎症的发生。本实验通过评估在不同订书肽作用浓度下，外加白介素17a在成纤维细胞中介导的促炎因子白介素6的产生浓度，从而在细胞层面上评价订书肽对白介素17a的抑制作用。图17c和表3展示了多肽6,4a/b对4ng/ml白介素17a与1ng/mltnf-α协同刺激正常人成纤维细胞所产生的白介素6的抑制作用，数据采用tukey多重比较检验的单因素方差分析，以mean±sd形式呈现。[0334]表3[0335][0336]从结果可以看出，三条肽都能抑制白介素6的产生(图17c)。4a(79nm)的ic50和原型肽6(69nm)差距不大，但是1b(158nm)的抑制能力却显著降低(表3)。这证明氨基酸连接子也可以通过改变螺旋结构来调控多肽细胞的活性。值得注意的是，由tnf-α单独刺激产生的白介素6并没有受到hap多肽的抑制，表面hap多肽及其类似物具有抑制选择性。这种药学的选择性可以在抑制白介素17a产生的炎症病程的同时，保留tnf-α的抗感染免疫应答效应。[0337]实验例4[0338]本实验利用蛋白酶k检测了所构建的订书肽的半衰期。蛋白酶k是一种具有广谱酶切位点的丝氨酸蛋白酶，它可以优先水解多肽中的脂肪族和芳香族残基形成的肽键。由于hap多肽序列中有着很高丰度的脂肪族和芳香族残基，因此蛋白酶k非常适合本发明的hap多肽片段的水解。[0339]对多肽进行体外蛋白酶降解实验，降解程度和半衰期分别如图17d和17e所示(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)。如图17d中所见，线性多肽6在一小时内就被完全降解，而订书肽1a/b-4a/b在此时均保持原样(除了订书肽5)。其中最稳定的订书肽是1a，其半衰期能长达4小时。这预示着不同取代的氨基酸侧链也会对半衰期的延长做着不同的贡献。与此同时，所有的l-连接子环化的多肽1a-4a的半衰期均长于它们各自对应的非对映异构体肽1b-4b(图17e)。[0340]实验例5对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构的表征[0341]对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构进行表征，结果如表4和图18所示。表4为多肽的特征性的摩尔椭圆率。图18a为环化和非环化的十五肽7-9a/b和10的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图18b为多肽7-9a/b和10的椭圆率对比图。[0342]表4[0343][0344]如表4和图18所示，所有的非对映异构体多肽对中，7-9a展示出了比多肽7-9b更高的螺旋度。并且，所有的突变订书肽相比于线性多肽10都获得了螺旋度的增长。这表明消除上述多肽骨架的10位残基与订书肽侧链环的排斥作用能降低侧链环对多肽消极的扭曲力。[0345]实验例6-8对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的生物学性质进行评价。[0346]实验例6[0347]本实验用表面等离子共振技术(spr)测得了多肽对白介素17a的亲和力情况。多肽的kd值展示在表5中。[0348]表5[0349][0350]从表5可以看出，多肽7-9a展现了比线性突变多肽10甚至是野生型hap多肽6更高的亲和力，其中带有l-lys连接子的多肽7a相比于带其他类型l-氨基酸连接子的多肽表现出了更大的亲和力提升。[0351]图19a和图19b分别为多肽6和7a的spr曲线图。每条曲线显示，随着时间变化，对应浓度的多肽对白介素17a的响应信号情况。从图中可以看出，多肽7a的结合速率(kon)和6没有显著的差异，但是它的解离速率是比6更慢的，这使得7a的kd值更小而亲和力更高。原因可能在于，在经过突变之后，订书肽获得了更高的螺旋度和更稳定的螺旋结构，减缓了它从白介素17a上解离下来的过程。另外，d-氨基酸连接的订书肽似乎并没有从突变的修饰中获得亲和力的提升，依旧显著低于其对应的l-氨基酸连接子修饰的订书肽。这表明，d-氨基酸连接子的手性取向与多肽骨架的排斥作用对多肽的亲和力起着主要的负面影响。[0352]实验例7[0353]基于体外亲和力的数据，本实验选取7a/b来评价其突变后细胞活性的变化，同时多肽6作为对照。[0354]图19c和表6展示了多肽6,7a/b对由白介素17a介导nhdf细胞产生的白介素6的抑制结果。[0355]表6[0356][0357]从图19c和表6可以看出，三条多肽都能以浓度梯度的方式抑制由白介素17a刺激细胞产生的白介素6。7a(37nm)的ic50值不仅高于它的非对映异构肽7b(169nm)，甚至超过了野生型多肽6(80nm)。结果表明，针对订书肽的突变优化可以将其由于订书修饰而损失的亲和力和细胞活性挽救回来。[0358]实验例8[0359]参考实验例4的方法，对多肽进行体外蛋白酶降解实验，降解程度和半衰期分别如图19d和图19e所示(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)。线性多肽6在1小时就完全降解了，而多肽7a/b-9a/b在3小时内还有50％剩余。最稳定的多肽9b拥有超过8小时的半衰期。[0360]进一步地，发明人还对以下订书肽的特征摩尔椭圆率、kd值、螺旋度和圆二色光谱(cd)进行表征。[0361]表7[0362][0363]备注：peptide14[0364]peptide15[0365]实验例9[0366]对多肽11a、11b、12a、12b、13a、13b、14、15的螺旋结构的表征结果如图20所示。图20a为表7中多肽的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图20b为多肽11-13a/b，14,15的椭圆率对比图。[0367]如图20所示，所有的非对映异构体多肽对中，11-13a展示出了比多肽11-13b更高的螺旋度。但是通过非天然连接子壬烷基以及十氟联苯基成环的订书肽14和15则失去了原有的螺旋结构，变成无序状态。进一步说明了我们所采用的氨基酸连接子订书修饰策略的结构兼容性。[0368]实验例10[0369]本实验用表面等离子共振技术(spr)测得了多肽对白介素17a的亲和力情况。多肽的kd值展示在表8中。[0370]表8[0371][0372]从表8可以看出，多肽11-13a展现了比11-13b更高的亲和力，说明在不同于i 7的i 3,i 4的订书模式中也存在上述规律。突变多肽在其他类型的氨基酸中也存在上述的规律。但是非天然连接子修饰的多肽14和15对白介素17a的亲和力则大大降低。[0373]需要说明的是，本技术不限定于上述实施方式。上述实施方式仅为示例，在本技术的技术方案范围内具有与技术思想实质相同的构成、发挥相同作用效果的实施方式均包含在本技术的技术范围内。此外，在不脱离本技术主旨的范围内，对实施方式施加本领域技术人员能够想到的各种变形、将实施方式中的一部分构成要素加以组合而构筑的其它方式也包含在本技术的范围内。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.白介素-17a(il-17a)是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，其作用于炎症调控过程下游的多种细胞、介导不同的生理过程并产生相应的生物学效应。研究发现，il-17a与多种自身炎症性疾病(aid)和自身免疫性疾病(ad)(例如银屑病(pso)、强直性脊柱炎(as)、类风湿关节炎(ra)、银屑病关节炎(psa)、多发性硬化病(ms)和克罗恩病(cd))相关，可以作为治疗这些疾病的靶点。3.近年来，多肽药物成为药物行业里发展最快的领域之一。相比于小分子药物，多肽药物拥有更高的靶标亲和力和更低的系统毒性，但是多肽由于缺乏蛋白骨架支撑，更容易在溶液中失去天然的结构构象从而导致活性降低。此外，多肽相比于蛋白具有更小的尺寸，虽然使其获得了更高的生物膜穿透性，但是也带来了许多成药性上的阻碍，例如在循环系统中更容易被酶解和被肾小球过滤。4.发明概述5.本发明的目的之一，在于提供一种以il-17为靶点的多肽药物。发明人通过酰胺化反应在il-17a的亲和多肽hap上引入不同种类的氨基酸连接子，构建了一系列订书修饰的hap。相比于线性hap，所述订书修饰的hap在螺旋结构的稳定性、靶标亲和力和/或抗酶解能力等方面可以得到改善，有潜力成为靶向il-17的多肽抑制剂药物，由此提供了下述发明。6.在一个方面，本技术提供了一种订书肽，其包含选自以下的主链氨基酸序列：7.(a)如ihvtipadlwdwink(seqidno:1)所示的氨基酸序列；8.(b)与seqidno:1具有至少80％、86.7％或93％序列同一性的氨基酸序列；或9.(c)与seqidno:1相比具有1个、2个或3个氨基酸残基的添加或置换的氨基酸序列；10.其中所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基通过连接子偶联成环，所述连接子包含至少一个氨基酸；11.所述i为大于或等于1的整数，优选地为小于或等于8的整数。12.在另一个方面，本技术提供了制备所述订书肽的方法，其包括以下步骤：13.(1)提供所述连接子和所述订书肽的主链；14.(2)利用所述连接子将所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。15.在又一个方面，本技术提供了一种包含所述订书肽的药物组合物，其包含所述的订书肽。16.进一步地，本技术还提供了所述订书肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与il-17a过度表达相关的疾病。17.发明详述18.术语定义19.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。20.本发明中，“订书肽”是指订书策略修饰的多肽，“订书策略”指的是将多肽锚定残基的侧链与侧链或者侧链与端基交联成环，以类似订书钉形式的侧链环来“钉”住多肽骨架以稳定多肽的二级结构构象。订书策略能使得多肽预先形成稳定的螺旋构象从而减少靶标结合过程中的“熵罚”。21.本发明中，hap(highaffinityil-17apeptideantagonist)是一种可与il-17a结合的多肽。该多肽能够特异性地与il-17a结合，并抑制il-17a与其受体il-17ra的相互作用。hap的示例性氨基酸序列可如seqidno.1所示。本发明中，术语“hap”意欲包含hap的变体，所述“变体”是指这样的多肽，其氨基酸序列与hap的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1个、2个、3个或更多)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60％、70％、80％、86.7％、93％、96％或更高的同一性，并且其与hap具有相同的功能，所述“功能”可以是如下功能中的一个或者多个：i)与il-17a结合，ii)抑制il-17a与其受体il-17ra的相互作用。22.本发明中，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。23.本发明中，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。24.本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。在本技术中，除非明确指出或者根据上下文可以明确确定，否则在描述氨基酸残基的位置时，通常以hap的序列为参照。25.在本说明书中，除非特别说明，否则表示氨基酸序列中的氨基酸残基的位置的编号将n末端的氨基酸残基设为1而在c末端方向上依次分配。26.本发明中，术语“药学可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。27.本发明中，“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。28.对受试者给予的药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。29.本技术中，发明人通过酰胺化反应在hap的侧链上引入不同种类的氨基酸连接子，构建了一系列订书策略修饰的hap。修饰后的hap在靶标亲和力，生物膜穿透性和/或抗酶解能力等方面得到提高。30.在一个方面，本技术提供了一种订书肽，其包含选自以下的主链氨基酸序列：31.(a)如ihvtipadlwdwink(seqidno:1)所示的氨基酸序列；32.(b)与seqidno:1具有至少80％、86.7％或93％序列同一性的氨基酸序列；或33.(c)与seqidno:1相比具有1个、2个或3个氨基酸残基的添加或置换的氨基酸序列；34.其中所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基通过连接子偶联成环，所述连接子包含至少一个氨基酸；所述i为大于或等于1的整数，优选地为小于或等于8的整数。35.在一些实施方案中，i为7或10。36.本发明中，所述连接子包含的氨基酸可以是l-氨基酸，也可以是d-氨基酸，可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸。37.发明人推测，天然氨基酸作为多肽的合成子，它的手性取向决定着多肽的螺旋走向是右手螺旋还是左手螺旋。所以它相比于非天然的手性连接子拥有和多肽更高的结构和生物兼容度的匹配性。此外，天然氨基酸是商业可得的手性化合物，在做修饰的时候可以避免繁复的合成工作。因此，在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸是天然的α-氨基酸。38.进一步地，发明人发现，使用一些手性氨基酸构建的订书肽非对映异构体彼此之间存在螺旋度的显著差异，在化学生物学性质方面也可能存在差异。其中，l-氨基酸连接子修饰的多肽更能维持原始线性多肽序列的螺旋构象，具有更优越的提升订书肽类药性质的能力。因此，在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸是l-氨基酸。39.此外，可以使用各种类型的氨基酸形成连接子，例如极性氨基酸或非极性氨基酸，碱性氨基酸或酸性氨基酸，疏水性氨基酸或亲水性氨基酸，有侧链的氨基酸或没有侧链的氨基酸。所述连接子包含的氨基酸包括但不限于：40.非极性氨基酸(疏水氨基酸)：甘氨酸(gly)丙氨酸(ala)缬氨酸(val)亮氨酸(leu)异亮氨酸(ile)苯丙氨酸(phe)色氨酸(trp)甲硫氨酸(met)脯氨酸(pro)；41.极性氨基酸(亲水氨基酸)：42.1)极性不带电荷/极性中性氨基酸：苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、半胱氨酸(cys)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、酪氨酸(tyr)；43.2)碱性氨基酸(带正电氨基酸)赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)；44.3)酸性氨基酸(带负电氨基酸)天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)。45.进一步地，不同氨基酸连接子所带有的侧链的尺寸和性质不同，其中一些可以对多肽起着重要的调控作用，还能作为二次修饰的把手来进行进一步的功能化衍生。在一些优选的实施方案中，所述连接子包含的氨基酸选自glu、ala、lys、ser。46.在另一些实施方案中，可以使用不带侧链的氨基酸形成连接子。在一些实施方案中，所述连接子包含的氨基酸为gly。47.发明人发现，对hap序列上的一些位点进行突变，有利于消除订书肽侧链环本身对多肽螺旋构象的负面影响，可以提高靶标亲和力和抗酶解能力。48.在一些实施方案中，hap主链氨基酸序列与seqidno:1相比具有1、2或3个氨基酸残基的置换(例如保守置换或非保守置换)。在一些优选的实施方案中，所述置换位于第7位、第10位、第14位或其任意组合。49.在一些优选的实施方案中，所述置换选自：第7位的氨基酸残基被置换为glu，第10位的氨基酸残基被置换为ala，第14位的氨基酸残基被置换为lys，或其任意组合。50.在一些更为优选的实施方案中，所述置换选自：第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys。51.特别优选的置换包括但不限于：52.(1)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu；53.(2)第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala；54.(3)第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；55.(4)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，以及第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala；56.(5)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；57.(6)第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；58.(7)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第10位的氨基酸残基由trp被置换为ala，以及第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys；59.(8)第7位的氨基酸残基由ala被置换为glu，第14位的氨基酸残基由asn被置换为lys，以及第1、2、3、4、5、6、10、11或12位的氨基酸残基被置换为ala。60.在一些特别优选的实施方案中，所述订书肽包含选自以下的主链氨基酸序列：61.ihvtipedlwdwikk(seqidno:2)62.ihvtipedladwikk(seqidno:3)63.ihvtipedlkdwink(seqidno:4)64.ihvtipadledwikk(seqidno:5)65.进一步地，还可以对本发明订书肽的主链的n端和/或c端进行修饰。在一些实施方案中，所述订书肽主链的n端被乙酰化修饰，从而减少多肽外切酶对其的水解作用，提高多肽半衰期。66.用于形成本发明订书肽的偶联反应可以是酰胺化反应。在一些实施方案中，订书肽所包含的的连接子通过肽键将所述订书肽主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。67.在一些实施方案中，所述订书肽主链的第i位的氨基酸残基的侧链可以包含游离羧基，所述订书肽主链的第i 3位、第i 4位或第i 7位的氨基酸残基的侧链可以包含游离氨基，所述连接子包含的氨基酸与所述游离羧基和所述游离氨基分别形成肽键。68.在另一些实施方案中，所述订书肽主链的第i位的氨基酸残基的侧链可以包含游离氨基，所述订书肽主链的第i 3位、第i 4位或第i 7位的氨基酸残基的侧链可以包含游离羧基，所述连接子包含的氨基酸与所述游离氨基和所述游离羧基分别形成肽键。69.本技术提供的订书肽包括但不限于以下各式所表示的订书肽：70.订书肽1a71.订书肽1b72.订书肽2a73.订书肽2b74.订书肽3a75.订书肽3b76.订书肽4a77.订书肽4b78.订书肽579.订书肽7a80.订书肽7b81.订书肽8a82.订书肽8b83.订书肽9a84.订书肽9b85.订书肽11a86.订书肽11b87.订书肽12a88.订书肽12b89.订书肽13a90.订书肽13b91.订书肽1492.订书肽1593.在一个方面，本技术提供了上述订书肽的制备方法，其包括以下步骤：94.(1)提供所述连接子和所述订书肽的主链；95.(2)利用所述连接子将所述订书肽的主链的第i位与第i 3位的氨基酸残基、或第i位与第i 4位的氨基酸残基、或第i位与第i 7位的氨基酸残基偶联成环。96.本发明的订书肽可以采用多肽合成仪，通过固相合成方法合成。可以使用合适的有机溶剂,例如dmf溶液；使用合适的脱保护试剂(例如含20％哌啶的dmf溶液)；使用过量氨基酸(例如4倍当量)和适当的缩合试剂(例如hatu/hobt)以及适量的碱(例如diea)进行适当时间的缩合反应进行多次合成。如有需要，在进行大位阻氨基酸如脯氨酸，异亮氨酸，苏氨酸和缬氨酸的缩合之后，之后一个氨基酸的缩合周期会被重复多次。可以使用α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸进行固相合成，例如fmoc-ala-oh,fmoc-asn(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-trp(boc)-oh,fmoc-val-oh,fmoc-glu(oall)-oh,fmoc-lys(dde)-oh.97.可以采用如下路线进行氨基酸连接子的合成：[0098][0099]示例性的合成方法包括：[0100]1)对α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸进行脱保护；[0101]2)使脱保护后的氨基酸与过量的氯甲酸烯丙酯进行反应，得到α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子。[0102]脱保护反应可以在室温、哌啶存在的条件下进行。合适的溶剂包括但不限于二氯甲烷。[0103]氨基酸与氯甲酸烯丙酯可以在碱(例如碳酸氢钠)存在的条件下进行。合适的溶剂包括但不限于四氢呋喃/水混合溶剂。[0104]在获得订书肽的主链和氨基酸连接子之后，可以通过酰胺化反应实现偶联成环。示例性的方法包括：[0105]1)将主链上一个锚定位点的氨基酸侧链上的氨基的保护基去除，例如可以使用水合肼将氨基的dde保护基去除，得到裸露的氨基；[0106]2)通过酰胺化反应，将α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子连接到上一步裸露出的氨基上；[0107]3)去除氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基，以得到裸露的氨基，并去除主链上另一锚定位点的氨基酸侧链上的羧基保护基，以得到裸露的羧基；[0108]例如：用四三苯基膦钯处理，以去除氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基，同时去除主链上另一锚定位点的氨基酸侧链上的烯丙基保护基；[0109]4)通过酰胺化反应使上一步反应中被裸露的氨基和羧基缩合，形成订书肽。[0110]任选地，所述方法还包括：将主链上的其他保护基去除，和/或对订书肽进行纯化。[0111]在一个方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含本发明的任意订书肽。任选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。可用于本发明的药用载体包括但不限于填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。[0112]本发明的药物组合物可被制成各种合适的剂型，包括但不限于：口服剂型、注射剂型(例如适于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的剂型)、吸入剂型、粘膜给药剂型或者局部给药剂型。在某些实施方案中，所述药物组合物被制成口服剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、口服混悬液、微丸剂或微片剂。[0113]在一个方面，本技术提供了本发明的订书肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与il-17a过度表达相关的疾病，例如自身炎症性疾病(aid)和自身免疫性疾病(ad)，例如强直性脊柱炎(as)、类风湿关节炎(ra)、银屑病(ps)、银屑病关节炎(psa)、多发性硬化病(ms)、克罗恩病(cd)。[0114]在一个方面，本技术提供了含有本发明的订书肽的制剂。在某些实施方案中，所述制剂用于与il-17a结合。[0115]在一个方面，本技术提供了本发明的订书肽在制备制剂中的用途，所述制剂用于与il-17a结合。[0116]本发明的制剂可于体内或者体外施用；例如，所述制剂被施用至受试者体内，以与受试者体内的il-17a结合，或者，所述制剂被施用至体外的il-17a，以与体外的il-17a结合。[0117]在一个方面，本技术提供了治疗和/或预防受试者的与il-17a过度表达相关的疾病的方法，包括给有此需要的受试者施予治疗和/或预防有效量的本发明的订书肽或药物组合物。所述受试者可以为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。[0118]有益效果[0119]本发明获得了具有类药性质订书肽，它们比线性的hap多肽具有更高的酶解稳定性和/或细胞活性，有潜力成为白介素17a的多肽抑制剂药物，用于治疗这一靶点相关的疾病，如自身炎症性疾病和自身免疫性疾病。[0120]以下，适当地参照附图详细说明具体公开了本技术的实施方式。但是会有省略不必要的详细说明的情况。例如，有省略对已众所周知的事项的详细说明、实际相同结构的重复说明的情况。这是为了避免以下的说明不必要地变得冗长，便于本领域技术人员的理解。此外，附图及以下说明是为了本领域技术人员充分理解本技术而提供的，并不旨在限定权利要求书所记载的主题。附图说明[0121]图1为多肽1a(图1a)和多肽1b(图1b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0122]图2为多肽2a(图2a)和多肽2b(图2b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0123]图3为多肽3a(图3a)和多肽3b(图3b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0124]图4为多肽4a(图4a)和多肽4b(图4b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0125]图5为多肽5的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0126]图6为多肽6的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0127]图7为多肽7a(图7a)和多肽7b(图7b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0128]图8为多肽8a(图8a)和多肽8b(图8b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0129]图9为多肽9a(图9a)和多肽9b(图9b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0130]图10为多肽10的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0131]图11为多肽11a(图11a)和多肽11b(图11b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0132]图12为多肽12a(图12a)和多肽12b(图12b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0133]图13为多肽13a(图13a)和多肽13b(图13b)的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0134]图14为多肽14的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0135]图15为多肽15的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。[0136]图16显示了多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构表征结果，其中，图16a为多肽的圆二色谱结构(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图16b为多肽的螺旋度柱状图(inh2o，ph＝7.0at20℃)。[0137]图17显示了多肽4a/b和6的表征和测试结果，其中，图17a为多肽6的spr曲线图，图17b为多肽4a的spr曲线图，图17c显示了多肽6,4a/b对4ng/ml白介素17a与1ng/mltnf-α协同刺激正常人成纤维细胞所产生的白介素6的抑制作用，图17d显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的降解程度，图17e显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的半衰期。[0138]图18显示了多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构表征结果，其中，图18a为多肽的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图18b为多肽7-9a/b和10的椭圆率对比图。[0139]图19显示了多肽7a/b和6的表征和测试结果，其中，图19a为多肽6的spr曲线图，图19b为多肽7a的spr曲线图，图19c显示了多肽6,7a/b对白介素17a介导nhdf细胞产生的白介素6的抑制结果，图19d显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的降解程度，图19e显示了体外蛋白酶降解实验中，多肽的半衰期。[0140]图20显示了多肽11a、11b、12a、12b、13a、13b、14、15的螺旋结构的表征结果，其中，图20a为多肽11-13a/b，14,15的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)，图20b为多肽11-13a/b，14,15的椭圆率对比图。具体实施方式[0141]i.材料与方法[0142]所有商业可得的试剂(来自aldrich,glbiochem,tci,acros,j&k,等公司)在使用前均未进行进一步的纯化。所有的溶剂均为试剂级或高效液相色谱(hplc)级(来自fisher,sigma,acros,oceanpak公司)。无水的四氢呋喃(thf),二氯甲烷(dcm)，乙醚，甲苯和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)均是通过pure溶剂纯化系统(innovativetechnology,inc.)进oh,fmoc-lys(boc)-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-trp(boc)-oh,fmoc-val-oh,fmoc-glu(oall)-oh,fmoc-lys(dde)-oh.[0154]用于spps的rinkamide树脂(0.336mmol/g)购自glbiochem公司。[0155]3.2圆二色光谱(cd)表征订书肽[0156]多肽样品被以50μm的浓度溶解在水中。相应的cd光谱数据通过jasco公司的j-810圆二色光谱分光偏振计使用1毫米厚的比色皿测得。实验在室温下进行。数据通过在190纳米到250纳米之间以0.5纳米为间隔，200纳米每分钟的速度检测，平行重复三次测得。光谱结果通过在同样条件下检测水获得的基线求平均值和归一化。[0157]3.3表面等离子共振(spr)[0158]将hap多肽以及其订书肽衍生物与白介素17a蛋白结合后通过biacoret200表面等离子共振检测仪检测。白介素17a蛋白被溶解于10mm的醋酸溶液中(ph5.0,来自gehealthcare公司),并在有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(来自gehealthcare公司)活化剂的条件下被固定在cm5传感器芯片上。乙醇胺-盐酸溶液(1.0m,ph8.5,来自cytiva公司)被用于掩蔽芯片上未与蛋白质发生反应的位点。溶解在pbs(ph7.4)溶液中的不同浓度的订书肽分别流过芯片。芯片通过10mm的甘氨酸-盐酸溶液(ph2.0,来自gehealthcare公司)来进行每次进样后的再生。亲和力数据kd值通过biacoret200evaluationsoftware评估软件计算得到。[0159]3.4蛋白酶解实验[0160]订书肽以200μm的浓度被溶解在pbs溶液中。由pichiapastoris中表达的重组蛋白酶k(来自merck公司–cb539480–≥30u/mg)也被以0.2μm的浓度溶解在pbs溶液中。多肽和蛋白酶溶液各150微升以1:1的比例混合在一个1.5毫升的ep管中，ep管在37度下通过恒温摇床孵育。在每个选定的时间点，取出20微升的溶液，并加入12倍体积的乙腈/水从溶液终止反应以防止蛋白酶在hplc分析过程中仍有活性。平均值和标准偏差值(n＝3)已被计算并列出。[0161]3.5使用正常成人皮肤成纤维细胞(nhdf)的细胞实验[0162]培养在fgm-2培养基(来自lonza公司)的nhdf细胞(来自lonza公司,4×104个细胞每毫升)被以每孔1×104个细胞(250微升)的数量铺到48孔板中，并培养过夜(37℃,5％co2)。每孔中加入50微升用fgm-2培养基溶解的1ng/mltnf-α(来自peprotech公司)和4ng/mlil-17aprotein(来自novoprotein公司),8个溶解在fgm-2培养基中的浓度范围在1×10-11至1×10-4m的订书肽被加入孔中(每个浓度3个重复，200微升每孔)并继续培养48小时。收集细胞上清液并用il-6的elisa试剂盒(来自diaclone公司)进行检测以评估炎性细胞因子诱导的抑制活性。用biotek公司的synergyneo2酶标仪检测450纳米下平板吸光度。il-6浓度的计算以及图表绘制是通过graphpadprism7软件完成的。[0163]iv.氨基酸连接子的合成与鉴定[0164]通用步骤4.1[0165][0166]向圆底烧瓶中加入α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸(1倍当量)并用无水二氯甲烷溶解。搅拌溶液，并用注射器向其中滴加哌啶(5倍当量)。在常温下搅拌反应5小时。通过tlc确定反应物消耗殆尽后，用水萃取反应溶液3次，合并水层，并通过减压蒸馏除去液相，即可在无须纯化的情况下得到脱去α-氨基的9-芴基甲氧基羰基保护基的反应中间体。随后，向烧瓶中加入碳酸氢钠(1.2倍当量)水溶液，并搅拌混匀溶液。氯甲酸烯丙酯(1.2倍当量)的四氢呋喃(thf)溶液被滴加入溶液，搅拌后得到浅色溶液。12小时后，通过tlc监控反应是否完成。通过少量1m的氢氧化钠溶液碱化反应体系，并用乙酸乙酯(ea)洗涤三次。将水层用1m盐酸酸化至ph值等于3直到得到白色混悬液。使用ea萃取三次，合并有机层并用饱和食盐水洗涤一次，用无水硫酸镁干燥，并用砂芯漏斗抽滤。过滤后的溶液进行减压蒸馏以获得纯净的产品s1-s9(粘稠的淡黄色液体)。[0167]以下列出化合物5.1-5.4a/b和5.5的化学结构式以及核磁表征数据：[0168]n2-((allyloxy)carbonyl)-n6-(tert-butoxycarbonyl)-l-lysine(5.1a)[0169][0170]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.88(s,1h),6.29(s,1h),5.97–5.82(m,1h),5.67(s,1h),5.29(dd,j＝17.2,1.7hz,1h),5.19(dd,j＝10.4,1.5hz,1h),4.56(d,j＝5.7hz,2h),4.43–4.30(m,1h),3.18–2.94(m,2h),1.90–1.71(m,2h),1.51–1.36(m,13h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.98,156.20,132.63,117.81,79.49,65.87,53.63,40.05,31.83,29.49,28.39,22.29.[0171]n2-((allyloxy)carbonyl)-n6-(tert-butoxycarbonyl)-d-lysine(5.1b)[0172][0173]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(s,1h),6.34–6.10(m,1h),5.96–5.81(m,1h),5.76–5.60(m,1h),5.29(d,j＝17.1hz,1h),5.19(d,j＝10.5hz,1h),4.63–4.50(m,2h),4.43–4.28(m,1h),3.19–2.98(m,1h),1.95–1.68(m,2h),1.48–1.31(m,13h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.80,156.22,132.63,117.81,79.49,65.87,53.62,31.83,28.39,22.29.[0174]((allyloxy)carbonyl)-l-alanine(5.2a)[0175][0176]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,1h),6.71(s,1h),6.08–5.69(m,1h),5.30(dd,j＝17.3,1.7hz,1h),5.21(d,j＝9.9hz,1h),4.62–4.54(m,2h),4.45–4.32(m,1h),1.46(d,j＝7.2hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ177.42,155.81,132.45,118.00,65.98,49.44,18.37.[0177]((allyloxy)carbonyl)-d-alanine(5.2b)[0178][0179]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.17(s,1h),6.73(s,1h),6.05–5.76(m,1h),5.30(dd,j＝17.2,1.6hz,1h),5.21(d,j＝10.4hz,1h),4.66–4.53(m,2h),4.45–4.23(m,1h),1.45(d,j＝7.2hz,2h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ177.50,155.83,132.45,117.99,65.98,49.44,18.36.[0180](s)-2-(((allyloxy)carbonyl)amino)-5-(tert-butoxy)-5-oxopentanoicacid(5.3a)[0181][0182]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.96–5.82(m,1h),5.64–5.57(m,1h),5.30(d,j＝17.2hz,1h),5.20(d,j＝10.4hz,1h),4.56(d,j＝5.6hz,2h),4.36(s,1h),2.49–2.30(m,2h),2.26–1.89(m,2h),1.43(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ187.37,172.58,156.20,132.46,117.94,81.21,66.03,53.48,31.61,28.02,27.33.[0183](r)-2-(((allyloxy)carbonyl)amino)-5-(tert-butoxy)-5-oxopentanoicacid(5.3b)[0184][0185]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41(s,1h),5.99–5.80(m,1h),5.63–5.56(m,1h),5.29(dd,j＝17.2,1.7hz,1h),5.20(dd,j＝10.5,1.6hz,1h),4.69–4.50(m,2h),4.43–4.25(m,1h),2.46–2.29(m,2h),2.25–1.89(m,2h),1.43(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.76,172.55,156.16,132.45,117.95,81.21,66.03,53.33,31.60,28.02,27.31.[0186]n-((allyloxy)carbonyl)-o-(tert-butyl)-l-serine(5.4a)[0187][0188]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.42(s,1h),6.02–5.78(m,1h),5.62(d,j＝8.5hz,1h),5.31(d,j＝18.7hz,1h),5.21(d,j＝11.8hz,1h),4.58(d,j＝5.8hz,2h),4.51–4.29(m,1h),3.87(dd,j＝9.0,3.0hz,1h),3.58(dd,j＝9.0,4.0hz,1h),1.16(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ175.22,156.27,132.65,118.07,74.11,66.12,61.84,54.36,27.36.[0189]n-((allyloxy)carbonyl)-o-(tert-butyl)-d-serine(5.4b)[0190][0191]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.00–5.85(m,1h),5.59(d,j＝8.2hz,1h),5.32(d,j＝16.8hz,1h),5.23(dd,j＝10.5,1.5hz,1h),4.59(d,j＝5.6hz,2h),4.49–4.42(m,1h),3.89(dd,j＝8.8,3.3hz,1h),3.57(dd,j＝8.9,4.7hz,1h),1.18(s,9h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ176.53,156.15,132.51,117.96,74.33,66.01,61.71,54.24,27.25.[0192]((allyloxy)carbonyl)glycine(5.5)[0193][0194]1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(s,1h),6.03–5.80(m,1h),5.61(s,0h),5.31(d,j＝17.2hz,1h),5.22(d,j＝10.3hz,1h),4.59(d,j＝5.7hz,1h),4.00(d,j＝5.8hz,1h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.02,156.69,132.37,118.07,66.21,42.45.[0195]v.订书肽的制备与鉴定[0196]通用步骤5.1[0197][0198]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，fmoc-lys(dde)-oh,fmoc-glu(oall)-oh以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，第14位赖氨酸侧链氨基的dde保护基经2％的水合肼dmf溶液处理2次，每次5分钟后被完全脱除。之后，α氨基被烯丙氧羰基保护的氨基酸连接子被通过酰胺化反应连接到上一步裸露出的氨基上。之后用四三苯基膦钯处理以同时脱去氨基酸连接子上的烯丙氧羰基保护基和7位谷氨酸侧链上的烯丙基保护基。最后通过酰胺化反应使上一步反应中被裸露的氨基和羧基缩合，最终形成订书肽。[0199]之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去其他保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽产物。[0200]合成步骤5.2[0201][0202]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，使用dmf/醋酸酐/diea(8/1/1，v/v/v)的溶液处理2次，每次5分钟从而保护多肽裸露的n端氨基，之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽原料。将多肽原料溶解在加入了1/5体积乙腈的20mm碳酸氢铵溶液中(大约5mg/ml)，加入多肽原料1.5倍当量的tcep，并在室温下搅拌1小时以破坏二硫键，随后加入10倍当量的1,9-二溴壬烷，并在80℃下加热反应30分钟，随后用3倍体积的乙腈稀释反应体系，并通过反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽产物。[0203]合成步骤5.3[0204][0205]订书肽是通过通用步骤3.1中使用的rinkamide树脂(每克树脂负载0.336毫摩尔氨基)，以及其他通用的α-氨基被9-芴基甲氧基羰基保护基保护(αn-fmoc)的氨基酸制备的。通过固相多肽合成(spps)成功制备多肽后，使用dmf/醋酸酐/diea(8/1/1，v/v/v)的溶液处理2次，每次5分钟从而保护多肽裸露的n端氨基，之后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95/2.5/2.5,v/v/v)的混酸脱去保护基，并用28毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解多肽粗品，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物部分被收集后通过低压冻干除去溶剂，并得到蓬松的固态多肽原料。将多肽原料溶解在dmf中(约5mg/ml)，随后加入150微升含有100μm十氟联苯的dmf溶液(约2倍当量)，和1.5毫升含有50mmtris的dmf溶液，然后搅拌4.5小时。使用反相高效液相色谱(rp-hplc)确认反应完全后，减压蒸馏除去dmf，并将得到的多肽粗品用5毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液溶解，并用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。[0206]实施例1[0207]多肽1a的合成[0208][0209]多肽1a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.0-19.0分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽1a(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0210]图1a为多肽1a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝18.45分钟)；下：质谱数据，计算得到c99h150n24o23的相对分子质量:2044.43da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.22,[m 3h]3 m/z＝682.48；检测结果:1022.91,682.15.[0211]多肽1b的合成[0212][0213]多肽1b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.00-15.80分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽1b(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0214]图1b为多肽1b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.41分钟)；下：质谱数据，计算得到c99h150n24o23的相对分子质量:2044.43da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.22,[m 3h]3 m/z＝682.48；检测结果:1022.91,682.15.[0215]实施例2[0216]多肽2a的合成[0217][0218]多肽2a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.00-20.90分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽2a(21毫克,总产率21.2％)，产物为蓬松的固体。[0219]图2a为多肽2a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.33分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o23的相对分子质量:1987.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝994.57；检测结果:994.08.[0220]多肽2b的合成[0221][0222]多肽2b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-20.00分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽2b(18毫克,总产率18.2％)，产物为蓬松的固体。[0223]图2b为多肽2b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝18.48分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o23的相对分子质量:1987.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝994.57；检测结果:994.42.[0224]实施例3[0225]多肽3a的合成[0226][0227]多肽3a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.75-21.20分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽3a(22毫克,总产率21.9％)，产物为蓬松的固体。[0228]图3a为多肽3a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.15分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o24的相对分子质量:2003.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1002.67；检测结果:1002.37.[0229]多肽3b的合成[0230][0231]多肽3b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-18.60分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽3b(23毫克,总产率22.9％)，产物为蓬松的固体。[0232]图3b为多肽3b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.63分钟)；下：质谱数据，计算得到c96h143n23o24的相对分子质量:2003.34da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1002.67；检测结果:1002.37.[0233]实施例4[0234]多肽4a的合成[0235][0236]多肽4a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.00-21.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽4a(15毫克,总产率14.7％)，产物为蓬松的固体。[0237]图4a为多肽4a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.45分钟)；下：质谱数据，计算得到c98h145n23o25的相对分子质量:2045.37da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.69；检测结果:1023.39.[0238]多肽4b的合成[0239][0240]多肽4b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为22.50-23.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽4b(16毫克,总产率15.6％)，产物为蓬松的固体。[0241]图4b为多肽4b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝22.96分钟)；下：质谱数据，计算得到c98h145n23o25的相对分子质量:2045.37da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1023.69；检测结果:1023.39[0242]实施例5[0243]多肽5的合成[0244][0245]多肽5是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为18.75-21.00分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽5(14毫克,总产率14.2％)，产物为蓬松的固体。[0246]图5为多肽5的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝19.76分钟)；下：质谱数据，计算得到c95h141n23o23的相对分子质量:1973.31da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.66；检测结果:987.00[0247]实施例6[0248]多肽6的合成[0249][0250]多肽6是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.00-17.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽6(35毫克,总产率37.5％)，产物为蓬松的固体。[0251]图6为多肽6的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝16.46分钟)；下：质谱数据，计算得到c95h141n23o23的相对分子质量:1862.17da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝932.09；检测结果:931.44[0252]实施例7[0253]多肽7a的合成[0254][0255]多肽7a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.00-16.25分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽7a(12毫克,总产率12.4％)，产物为蓬松的固体。[0256]图7a为多肽7a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.85分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.30da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.65,[m 3h]2 m/z＝644.10；检测结果:965.38,643.86.[0257]多肽7b的合成[0258][0259]多肽7b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.00-13.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽7b(8毫克,总产率8.3％)，产物为蓬松的固体。[0260]图7b为多肽7b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.06分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.30da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.65,[m 3h]2 m/z＝644.10；检测结果:965.11,643.86.[0261]实施例8[0262]多肽8a的合成[0263][0264]多肽8a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.50-17.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽8a(11毫克,总产率11.8％)，产物为蓬松的固体。[0265]图8a为多肽8a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.11分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o23的相对分子质量:1872.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝937.10；检测结果:936.48.[0266]多肽8b的合成[0267][0268]多肽8b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为14.00-15.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽8b(13毫克,总产率13.9％)，产物为蓬松的固体。[0269]图8b为多肽8b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝14.90分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o23的相对分子质量:1872.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝937.10；检测结果:936.54.[0270]实施例9[0271]多肽9a的合成[0272][0273]多肽9a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为16.25-15.75分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽9a(16毫克,总产率16.0％)，产物为蓬松的固体。[0274]图9a为多肽9a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.43分钟)；下：质谱数据，计算得到c90h140n22o25的相对分子质量:1930.24da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝966.12；检测结果:965.45.[0275]多肽9b的合成[0276][0277]多肽9b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为13.25-15.15分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽9b(14毫克,总产率14.5％)，产物为蓬松的固体。[0278]图9b为多肽9b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝14.83分钟)；下：质谱数据，计算得到c90h140n22o25的相对分子质量:1930.24da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝966.12；检测结果:965.51.[0279]实施例10[0280]多肽10的合成[0281][0282]多肽10是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为11.50-12.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽10(21毫克,总产率23.1％)，产物为蓬松的固体。[0283]图10为多肽10的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝12.05分钟)；下：质谱数据，计算得到c85h135n21o23的相对分子质量:1819.14da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝910.57,[m 3h]2 m/z＝607.38；检测结果:910.02,607.14.[0284]实施例11[0285]多肽11a的合成[0286][0287]多肽11a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为15.50-16.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽11a(5.62毫克,总产率11.4％)，产物为蓬松的固体。[0288]图11a为多肽11a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝15.71分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h146n24o24的相对分子质量:1972.32da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.16,[m 3h]2 m/z＝658.44；检测结果:1972.42,986.87,658.07.[0289]多肽11b的合成[0290][0291]多肽11b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.50-13.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽11b(3.86毫克,总产率7.8％)，产物为蓬松的固体。[0292]图11b为多肽11b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.18分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h146n24o24的相对分子质量:1972.32da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝987.16,[m 3h]2 m/z＝658.44；检测结果:1972.49,986.87,658.14.[0293]实施例12[0294]多肽12a的合成[0295][0296]多肽12a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为12.50-13.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽12a(4.40毫克,总产率7.5％)，产物为蓬松的固体。[0297]图12a是多肽12a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝13.31分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.38da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.69,[m 3h]2 m/z＝644.13；检测结果:1929.38,965.31,643.79.[0298]多肽12b的合成[0299][0300]多肽12b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为21.50-22.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽12b(4.88毫克,总产率10.1％)，产物为蓬松的固体。[0301]图12b是多肽12b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为10-70％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝22.35分钟)；下：质谱数据，计算得到c91h145n23o23的相对分子质量:1929.38da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝965.69,[m 3h]2 m/z＝644.13；检测结果:965.31,643.79.[0302]实施例13[0303]多肽13a的合成[0304][0305]多肽13a是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为20.50-21.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽13a(5.02毫克,总产率10.6％)，产物为蓬松的固体。[0306]图13a是多肽13a的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝20.83分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o24的相对分子质量:1888.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝945.10；检测结果:1888.38,944.84.[0307]多肽13b的合成[0308][0309]多肽13b是通过步骤3.1&5.1制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为30-55％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为17.50-18.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽13b(5.20毫克,总产率11.0％)，产物为蓬松的固体。[0310]图13b是多肽13b的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为30-55％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝17.75分钟)；下：质谱数据，计算得到c88h138n22o24的相对分子质量:1888.20da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝945.10；检测结果:1888.38,944.50.[0311]实施例14[0312]多肽14的合成[0313][0314]多肽14是通过步骤3.1&5.2制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为50-90％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为11.50-12.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽14(0.22毫克,总产率1.3％)，产物为蓬松的固体。[0315]图14是多肽14的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为50-90％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝11.63分钟)；下：质谱数据，计算得到c89h142n20o21s2的相对分子质量:1892.35da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝947.18；检测结果:946.74.[0316]多肽15的合成[0317][0318]多肽15是通过步骤3.1&5.3制备的。脱去保护基后，粗品多肽被溶解在16毫升的乙腈/水(50/50,v/v)溶液中并用反向高效液相色谱(rp-hplc)纯化(流动相b的线性浓度梯度为10-70％，使用exsilpure300c18色谱柱)。产物的保留时间为27.50-28.50分钟。产物部分被收集并减压冻干得到多肽15(0.35毫克,总产率3.0％)，产物为蓬松的固体。[0319]图15是多肽15的高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)分析结果。上、中：uvtrace(流动相b的在30分钟内的线性浓度梯度为10-70％，使用agilentc18色谱柱)，tr＝28.11分钟)；下：质谱数据，计算得到c92h124f8n20o21s2的相对分子质量:2062.23da(同位素平均),[m 2h]2 m/z＝1032.12；检测结果:1031.75.[0320]实验例1对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构的表征[0321]对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的螺旋结构进行表征，结果如表1和图16所示。表1为多肽的特征性的摩尔椭圆率。图16a为多肽的圆二色谱结构(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图16b为多肽的螺旋度柱状图(inh2o，ph＝7.0at20℃)。[0322]表1[0323][0324]从图16可以看出，带有l-lys的多肽1a的螺旋度显著高于带有d-lys连接子的多肽1b,这结果表明氨基酸连接子的l和d构型在调节订书肽的二级结构中起着重要的作用。相比于线性多肽6来说，多肽1-4a的螺旋度在修饰后能够保留甚至提升，然而多肽1-4b则降低。值得注意的是，连接子没有侧链的订书肽5也展现了略有降低的螺旋度。这说明对hap序列所采用的这种侧链环化策略，即便在没有连接子侧链参与的情况下，本身也会导致多肽的螺旋度有所下降。[0325]实验例2-4对多肽1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6的生物学性质进行评价。[0326]实验例2[0327]本实验通过表面等离子共振技术(spr)评估多肽和其靶标蛋白白介素17a之间的亲和力。多肽的kd值展示在表2中。[0328]表2[0329][0330]可以看到，多肽非对映异构体1-4a的亲和力明显高于多肽5，而1-4b低于多肽5，可能的原因是l-连接子或许能帮助缓解侧链环对多肽二级结构的负面影响从而导致亲和力损失降低，而d-连接子则与其相反，加重了这种负面影响。[0331]图17a和图17b分别为多肽6和4a的spr曲线图。多肽以浓度梯度与固定在cm5芯片上的人白介素17a结合。动力学参数k(ka,kd)经由“globalfit”计算所得.kd值由下示等式计算所得,kd＝kd/ka。结果表明，尽管野生型的线性hap多肽的亲和力始终高于所有修饰过的多肽，但是从多肽6和4a的spr的拟合曲线来看,它们的结合速率和解离速率均差距较小。[0332]实验例3[0333]本实验利用膜表面表达有白介素17a受体的正常人成纤维细胞(nhdf)研究了多肽1a/1b和6的细胞活性。白介素17a和tnf-α单独使用均可以刺激细胞产生多种炎性因子，例如白介素6。当它们同时使用的时候，则可以协同作用来提高各自的效应，导致炎症的发生。本实验通过评估在不同订书肽作用浓度下，外加白介素17a在成纤维细胞中介导的促炎因子白介素6的产生浓度，从而在细胞层面上评价订书肽对白介素17a的抑制作用。图17c和表3展示了多肽6,4a/b对4ng/ml白介素17a与1ng/mltnf-α协同刺激正常人成纤维细胞所产生的白介素6的抑制作用，数据采用tukey多重比较检验的单因素方差分析，以mean±sd形式呈现。[0334]表3[0335][0336]从结果可以看出，三条肽都能抑制白介素6的产生(图17c)。4a(79nm)的ic50和原型肽6(69nm)差距不大，但是1b(158nm)的抑制能力却显著降低(表3)。这证明氨基酸连接子也可以通过改变螺旋结构来调控多肽细胞的活性。值得注意的是，由tnf-α单独刺激产生的白介素6并没有受到hap多肽的抑制，表面hap多肽及其类似物具有抑制选择性。这种药学的选择性可以在抑制白介素17a产生的炎症病程的同时，保留tnf-α的抗感染免疫应答效应。[0337]实验例4[0338]本实验利用蛋白酶k检测了所构建的订书肽的半衰期。蛋白酶k是一种具有广谱酶切位点的丝氨酸蛋白酶，它可以优先水解多肽中的脂肪族和芳香族残基形成的肽键。由于hap多肽序列中有着很高丰度的脂肪族和芳香族残基，因此蛋白酶k非常适合本发明的hap多肽片段的水解。[0339]对多肽进行体外蛋白酶降解实验，降解程度和半衰期分别如图17d和17e所示(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)。如图17d中所见，线性多肽6在一小时内就被完全降解，而订书肽1a/b-4a/b在此时均保持原样(除了订书肽5)。其中最稳定的订书肽是1a，其半衰期能长达4小时。这预示着不同取代的氨基酸侧链也会对半衰期的延长做着不同的贡献。与此同时，所有的l-连接子环化的多肽1a-4a的半衰期均长于它们各自对应的非对映异构体肽1b-4b(图17e)。[0340]实验例5对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构的表征[0341]对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的螺旋结构进行表征，结果如表4和图18所示。表4为多肽的特征性的摩尔椭圆率。图18a为环化和非环化的十五肽7-9a/b和10的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图18b为多肽7-9a/b和10的椭圆率对比图。[0342]表4[0343][0344]如表4和图18所示，所有的非对映异构体多肽对中，7-9a展示出了比多肽7-9b更高的螺旋度。并且，所有的突变订书肽相比于线性多肽10都获得了螺旋度的增长。这表明消除上述多肽骨架的10位残基与订书肽侧链环的排斥作用能降低侧链环对多肽消极的扭曲力。[0345]实验例6-8对多肽7a、7b、8a、8b、9a、9b、10的生物学性质进行评价。[0346]实验例6[0347]本实验用表面等离子共振技术(spr)测得了多肽对白介素17a的亲和力情况。多肽的kd值展示在表5中。[0348]表5[0349][0350]从表5可以看出，多肽7-9a展现了比线性突变多肽10甚至是野生型hap多肽6更高的亲和力，其中带有l-lys连接子的多肽7a相比于带其他类型l-氨基酸连接子的多肽表现出了更大的亲和力提升。[0351]图19a和图19b分别为多肽6和7a的spr曲线图。每条曲线显示，随着时间变化，对应浓度的多肽对白介素17a的响应信号情况。从图中可以看出，多肽7a的结合速率(kon)和6没有显著的差异，但是它的解离速率是比6更慢的，这使得7a的kd值更小而亲和力更高。原因可能在于，在经过突变之后，订书肽获得了更高的螺旋度和更稳定的螺旋结构，减缓了它从白介素17a上解离下来的过程。另外，d-氨基酸连接的订书肽似乎并没有从突变的修饰中获得亲和力的提升，依旧显著低于其对应的l-氨基酸连接子修饰的订书肽。这表明，d-氨基酸连接子的手性取向与多肽骨架的排斥作用对多肽的亲和力起着主要的负面影响。[0352]实验例7[0353]基于体外亲和力的数据，本实验选取7a/b来评价其突变后细胞活性的变化，同时多肽6作为对照。[0354]图19c和表6展示了多肽6,7a/b对由白介素17a介导nhdf细胞产生的白介素6的抑制结果。[0355]表6[0356][0357]从图19c和表6可以看出，三条多肽都能以浓度梯度的方式抑制由白介素17a刺激细胞产生的白介素6。7a(37nm)的ic50值不仅高于它的非对映异构肽7b(169nm)，甚至超过了野生型多肽6(80nm)。结果表明，针对订书肽的突变优化可以将其由于订书修饰而损失的亲和力和细胞活性挽救回来。[0358]实验例8[0359]参考实验例4的方法，对多肽进行体外蛋白酶降解实验，降解程度和半衰期分别如图19d和图19e所示(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)。线性多肽6在1小时就完全降解了，而多肽7a/b-9a/b在3小时内还有50％剩余。最稳定的多肽9b拥有超过8小时的半衰期。[0360]进一步地，发明人还对以下订书肽的特征摩尔椭圆率、kd值、螺旋度和圆二色光谱(cd)进行表征。[0361]表7[0362][0363]备注：peptide14[0364]peptide15[0365]实验例9[0366]对多肽11a、11b、12a、12b、13a、13b、14、15的螺旋结构的表征结果如图20所示。图20a为表7中多肽的圆二色谱曲线(inh2o,50μm,ph＝7.0at20℃)。图20b为多肽11-13a/b，14,15的椭圆率对比图。[0367]如图20所示，所有的非对映异构体多肽对中，11-13a展示出了比多肽11-13b更高的螺旋度。但是通过非天然连接子壬烷基以及十氟联苯基成环的订书肽14和15则失去了原有的螺旋结构，变成无序状态。进一步说明了我们所采用的氨基酸连接子订书修饰策略的结构兼容性。[0368]实验例10[0369]本实验用表面等离子共振技术(spr)测得了多肽对白介素17a的亲和力情况。多肽的kd值展示在表8中。[0370]表8[0371][0372]从表8可以看出，多肽11-13a展现了比11-13b更高的亲和力，说明在不同于i 7的i 3,i 4的订书模式中也存在上述规律。突变多肽在其他类型的氨基酸中也存在上述的规律。但是非天然连接子修饰的多肽14和15对白介素17a的亲和力则大大降低。[0373]需要说明的是，本技术不限定于上述实施方式。上述实施方式仅为示例，在本技术的技术方案范围内具有与技术思想实质相同的构成、发挥相同作用效果的实施方式均包含在本技术的技术范围内。此外，在不脱离本技术主旨的范围内，对实施方式施加本领域技术人员能够想到的各种变形、将实施方式中的一部分构成要素加以组合而构筑的其它方式也包含在本技术的范围内。当前第1页12当前第1页12
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