一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂的制作方法

1.本发明涉及对虾疾病技术领域，具体是一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂。


背景技术：

2.对虾属于节肢动物门，其身体长而侧扁，雌雄异体，对虾中含有丰富的镁，并且对虾的通乳作用较强，同时富含磷、钙，对小儿和孕妇有补益功效，而在对虾养殖过程中其会受到肝肠胞虫的侵害，尤其是在转肝期一个月的时候，对虾的外表看不出任何变化，也不会引起重视，在30天左右其病症就会显露，虽然在表面上看对虾没有很明显的问题，但是就是不长个，偶尔还伴随有白便，所以需要进行检测，通过检测可得出对虾是否受到肝肠胞虫的侵害进而进行治疗。
3.但是，目前对虾在进行检测时其检测试检测效果较差，并且单一的检测方式容易使得数据准确性差，这样就会导致肝肠胞虫存留在对虾中进而发生扩散。因此，本领域技术人员提供了一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂以解决上述背景技术中提出的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂包括，如下步骤：包括dna聚合酶、反应缓冲液、dntps,dh2o,耐热聚合酶，恒温荧光法反应液，荧光探针，阳性对照品和阴性对照品，所述恒温荧光法反应液各组成为：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为0.5-0.7μm，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为0.3-0.4μm，引物ehp—ptp2-f1.2-1.4μm，引物ehp—ptp2-r1.1-1.3μm，引物ehp—ssu-f0.4-0.6μm，引物ehp—ssu-r0.5-0.7μm。
7.作为本发明再进一步的方案：所述引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为gcagcactcaaggaatggc，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为tttcgttaggcttaccctgtga，引物ehp—ptp2-f为atgagtctttataagcactg，引物ehp—ptp2-r为
8.ttattcgttggatgttaatg，引物ehp—ssu-f为gatggctcccacgtccaagg，引物ehp—ssu-r为gaacagggacacattcacaa。
9.作为本发明再进一步的方案：所述阳性对照品为带有虾肠孢子虫基因的质粒，所述阴性对照品为ph值为7.5的超纯水。
10.作为本发明再进一步的方案：所述荧光探针的一端分别为荧光集团，所述荧光基团为fam、hex、joe中的一种或多种荧光基团。
11.作为本发明再进一步的方案：所述dntps与dh2o的比例为1:1.5，且dntps的ph值为7.5。
12.作为本发明再进一步的方案：所述反应缓冲剂为磷酸、柠檬酸、碳酸中的一种或两
种以上，所述耐热聚合酶为taq dna聚合酶。
13.作为本发明再进一步的方案：所述反应缓冲剂的制备步骤包括以下：
14.s1、首先选定一个弱酸(磷酸或柠檬酸)，它的pkaφ尽可能接近所需配制的缓冲溶液的ph值；
15.s2、计算酸与碱的浓度比，根据此浓度比便可配制所需要的缓冲溶液。
16.作为本发明再进一步的方案：所述引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为与引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为的比例为0.9：1，所述引物ehp—ptp2-f与引物ehp—ptp2-r的比例为1：1，所述引物ehp—ssu-f与引物ehp—ssu-r的比例为1：0.9。
17.作为本发明再进一步的方案：所述检测试剂还包括镁离子和氯化钾，所述镁离子和氯化钾的比例为1：1.2。
18.作为本发明再进一步的方案：所述在检测时通过与阳性对照品和阴性对照品进行对比检测，若出现扩增曲线则结果为阳性，若出现平滑直线则说明为阴性。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对对虾的dna聚合酶进行提取，并通过荧光探针和恒温荧光法反应液两种方式对提取的dna聚合酶进行荧光试剂检测，即荧光探针所检测的肝肠胞虫不会对没有感染的虾苗进行扩增，这样就能够分辨感染的虾苗和未感染的虾苗，同时很稳荧光法反应液也能够根据聚合酶的反应序列来检测对虾是否感染，通过两种方式的试剂检测能够使得检测的数据更加准确，快捷、使得具有良好的前景。
具体实施方式
20.本发明实施例一中，一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂，包括dna聚合酶、反应缓冲液、dntps,dh2o,耐热聚合酶，恒温荧光法反应液，荧光探针，阳性对照品和阴性对照品，恒温荧光法反应液各组成为：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为0.5μm，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为0.3μm，引物ehp—ptp2-f1.2μm，引物ehp—ptp2-r1.1μm，引物ehp—ssu-f0.4μm，引物ehp—ssu-r0.5μm。
21.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为gcagcactcaaggaatggc，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为tttcgttaggcttaccctgtga，引物ehp—ptp2-f为atgagtctttataagcactg，引物ehp—ptp2-r为ttattcgttggatgttaatg，引物ehp—ssu-f为gatggctcccacgtccaagg，引物ehp—ssu-r为gaacagggacacattcacaa。
22.优选的：阳性对照品为带有虾肠孢子虫基因的质粒，阴性对照品为ph值为7.5的超纯水。
23.优选的：荧光探针的一端分别为荧光集团，荧光基团为fam、hex、joe中的一种或多种荧光基团。
24.优选的：dntps与dh2o的比例为1:1.5，且dntps的ph值为7.5。
25.优选的：反应缓冲剂为磷酸、柠檬酸、碳酸中的一种或两种以上，耐热聚合酶为taq dna聚合酶。
26.优选的：反应缓冲剂的制备步骤包括以下：
27.s1、首先选定一个弱酸(磷酸或柠檬酸)，它的pkaφ尽可能接近所需配制的缓冲溶液的ph值；
28.s2、计算酸与碱的浓度比，根据此浓度比便可配制所需要的缓冲溶液。
29.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为与引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为的比例为0.9：1，引物ehp—ptp2-f与引物ehp—ptp2-r的比例为1：1，引物ehp—ssu-f与引物ehp—ssu-r的比例为1：0.9。
30.优选的：检测试剂还包括镁离子和氯化钾，镁离子和氯化钾的比例为1：1.2。
31.优选的：在检测时通过与阳性对照品和阴性对照品进行对比检测，若出现扩增曲线则结果为阳性，若出现平滑直线则说明为阴性。
32.实施例二
33.一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂，包括dna聚合酶、反应缓冲液、dntps,dh2o,耐热聚合酶，恒温荧光法反应液，荧光探针，阳性对照品和阴性对照品，恒温荧光法反应液各组成为：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为0.6μm，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为0.3μm，引物ehp—ptp2-f1.3μm，引物ehp—ptp2-r1.2μm，引物ehp—ssu-f0.5μm，引物ehp—ssu-r0.6μm。
34.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为gcagcactcaaggaatggc，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为tttcgttaggcttaccctgtga，引物ehp—ptp2-f为atgagtctttataagcactg，引物ehp—ptp2r为ttattcgttggatgttaatg，引物ehp—ssu-f为gatggctcccacgtccaagg，引物ehp—ssu-r为gaacagggacacattcacaa。
35.优选的：阳性对照品为带有虾肠孢子虫基因的质粒，阴性对照品为ph值为7.5的超纯水。
36.优选的：荧光探针的一端分别为荧光集团，所述荧光基团为fam、hex、joe中的一种或多种荧光基团。
37.优选的：dntps与dh2o的比例为1:1.5，且dntps的ph值为7.5。
38.优选的：反应缓冲剂为磷酸、柠檬酸、碳酸中的一种或两种以上，耐热聚合酶为taq dna聚合酶。
39.优选的：反应缓冲剂的制备步骤包括以下：
40.s1、首先选定一个弱酸(磷酸或柠檬酸)，它的pkaφ尽可能接近所需配制的缓冲溶液的ph值；
41.s2、计算酸与碱的浓度比，根据此浓度比便可配制所需要的缓冲溶液。
42.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为与引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为的比例为0.9：1，引物ehp—ptp2-f与引物ehp—ptp2-r的比例为1：1，引物ehp—ssu-f与引物ehp—ssu-r的比例为1：0.9。
43.优选的：检测试剂还包括镁离子和氯化钾，镁离子和氯化钾的比例为1：1.2。
44.优选的：在检测时通过与阳性对照品和阴性对照品进行对比检测，若出现扩增曲线则结果为阳性，若出现平滑直线则说明为阴性。
45.实施例三
46.一种对虾虾肝肠孢虫检测的荧光检测试剂，包括dna聚合酶、反应缓冲液、dntps,dh2o,耐热聚合酶，恒温荧光法反应液，荧光探针，阳性对照品和阴性对照品，恒温荧光法反应液各组成为：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为0.7μm，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为0.4μm，引物ehp—ptp2-f1.4μm，引物ehp—ptp2-r1.3μm，引物ehp—ssu-f0.6μm，引
物ehp—ssu-r0.7μm。
47.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为gcagcactcaaggaatggc，引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为tttcgttaggcttaccctgtga，引物ehp—ptp2-f为atgagtctttataagcactg，引物ehp—ptp2r为ttattcgttggatgttaatg，引物ehp—ssu-f为gatggctcccacgtccaagg，引物ehp—ssu-r为gaacagggacacattcacaa。
48.优选的：阳性对照品为带有虾肠孢子虫基因的质粒，阴性对照品为ph值为7.5的超纯水。
49.优选的：荧光探针的一端分别为荧光集团，所述荧光基团为fam、hex、joe中的一种或多种荧光基团。
50.优选的：dntps与dh2o的比例为1:1.5，且dntps的ph值为7.5。
51.优选的：反应缓冲剂为磷酸、柠檬酸、碳酸中的一种或两种以上，耐热聚合酶为taq dna聚合酶。
52.优选的：反应缓冲剂的制备步骤包括以下：
53.s1、首先选定一个弱酸(磷酸或柠檬酸)，它的pkaφ尽可能接近所需配制的缓冲溶液的ph值；
54.s2、计算酸与碱的浓度比，根据此浓度比便可配制所需要的缓冲溶液。
55.优选的：引物ehp—ptp2-f实时荧光定量pcr为与引物ehp—ptp2-r实时荧光定量pcr为的比例为0.9：1，引物ehp—ptp2-f与引物ehp—ptp2-r的比例为1：1，引物ehp—ssu-f与引物ehp—ssu-r的比例为1：0.9。
56.优选的：检测试剂还包括镁离子和氯化钾，镁离子和氯化钾的比例为1：1.2。
57.优选的：在检测时通过与阳性对照品和阴性对照品进行对比检测，若出现扩增曲线则结果为阳性，若出现平滑直线则说明为阴性。
58.本发明通过对对虾的dna聚合酶进行提取，并通过荧光探针和恒温荧光法反应液两种方式对提取的dna聚合酶进行荧光试剂检测，即荧光探针所检测的肝肠胞虫不会对没有感染的虾苗进行扩增，这样就能够分辨感染的虾苗和未感染的虾苗，同时很稳荧光法反应液也能够根据聚合酶的反应序列来检测对虾是否感染，通过两种方式的试剂检测能够使得检测的数据更加准确，快捷、使得具有良好的前景。
59.以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。