一种凡尔纳对虾分子标记及其引物和应用的制作方法

1.本发明属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种凡尔纳对虾分子标记及其引物和应用。


背景技术：

2.凡纳滨对虾(penaeus vannamei)又称南美白对虾、太平洋白虾，隶属于节肢动物门(arthropoda)、甲壳纲(crustaeea)、十足目(deeapoda)、对虾科(penaeidae)、对虾属(penaeus)，是我国和世界养殖产量最高的对虾种类，也是单一产值最高的水产养殖种类之一。2020年我国养殖产量超过180万吨，产值超过700亿元，约占世界总产量的40％。我国每年种虾需求量超过100万对，苗种需求量超过1.5万亿尾。凡纳滨对虾具有产卵量高，可多次产卵的特性。然而在苗种生产中，雌虾的繁殖能力存在巨大个体差异。在一个生产周期中，部分雌虾从未产卵，而有的雌虾能够多次产卵。培育高繁殖力(产卵和产卵量)新品种，对于提高育苗效率，节省生产成本具有重要意义。繁殖性状属中低遗传力性状，传统的育种方法进展缓慢，借助分子标记辅助育种技术可有效加快选育进程。
3.作为第三代分子标记，单核苷酸多态性标记(snp)具有丰富度高、密度大、稳定性强、共显性等特点，成为目前虾、蟹等经济甲壳动物中应用最广泛的分子标记技术。目前，有关凡纳滨对虾繁殖相关snp标记的开发较少，并且产业中缺乏可应用于分子标记辅助育种的标记。因此，开发高繁殖力的分子标记对凡纳滨对虾的新品种培育具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种凡尔纳对虾分子标记及其引物和应用。分子标记7w2能够用于凡纳滨对虾高繁殖力群体的筛选中，其鉴定效率及准确率高。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明提供了一种凡尔纳对虾分子标记7w2，所述分子标记7w2的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步的，在凡纳滨对虾高繁殖力群体中，所述分子标记7w2的第301位碱基为c。
8.进一步的，所述分子标记7w2的碱基c在凡纳滨对虾高繁殖力群体中的等位基因频率》7％。
9.优选的，所述分子标记7w2的碱基c在凡纳滨对虾高繁殖力群体中的等位基因频率≥7.14％。
10.本发明还提供了所述的分子标记7w2的引物，所述引物包括核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示的扩增引物以及核苷酸序列如seq id no.4所示的延伸引物。
11.本发明还提供了所述的分子标记7w2或者所述的分子标记7w2的引物在用于筛选具有高繁殖力的凡纳滨对虾群体中的应用。
12.进一步的，筛选具有高繁殖力的凡纳滨对虾群体的具体步骤为：提取凡纳滨对虾群体内(家系、品系或地理群体)测试样品的dna，并将其作为模板，利用所述引物进行飞行
质谱分型，若分型结果中分子标记的第300位的碱基为c，且等位基因频率》7％，则选择该凡纳滨对虾群体作为培育凡纳滨对虾高繁殖力的亲本。
13.进一步的，所述凡纳滨对虾群体测试样品的数量在30尾以上。
14.进一步的，在飞行质谱分型中，pcr扩增的条件为预变性94℃3min；变性94℃30s，退火56℃25s，延伸72℃30s，共重复40个循环；最后延伸72℃4min；4℃保存。
15.进一步的，在飞行质谱分型中，延伸反应的条件为预变性94℃ 30s；变性94℃ 5s，退火52℃ 5s，延伸80℃ 5s，共重复40个循环；最后延伸72℃ 3min；4℃保存。
16.本发明还提供了所述的分子标记7w2在凡纳滨对虾遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。
17.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
18.1、本发明提供的凡纳滨对虾高繁殖力分子标记7w2可以不受生长阶段的限制，能够用于凡纳滨对虾早期选育，快速选育出繁殖性状优良的亲本群体，促进凡纳滨对虾高繁殖力新品种的选育进程。
19.2、利用本发明提供的分子标记7w2检测凡纳滨对虾繁殖性状，方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出高繁殖力群体，辅助早期育种，增加优良品质的凡纳滨对虾亲虾的使用效率，提高苗种产量，促进凡纳滨对虾的健康繁育，对凡纳滨对虾的健康养殖与发展具有重要的意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
20.图1为本发明中在验证群体中进行飞行质谱分型验证结果。
具体实施方式
21.以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
22.本发明所用凡纳滨对虾均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所合作基地邦普种业科技有限公司。将来自57个家系的10月龄健康雌性种虾进行单侧眼柄切除以促进卵巢同步成熟，8～10尾/家系，共604尾，体重50
±
5g。切眼柄后的雌虾放入6个16m3大池，密度6～7尾/m2。雄性亲虾来自相同家系，8～9尾/家系，共500尾，体重45
±
5g。雄虾以家系为单位放入3m3水泥池，密度2～3尾/m2。亲虾每天投喂3餐沙蚕和2餐鱿鱼进行营养强化，每日投喂总量达亲虾总体重的20％，每天分5次投喂，保证沙蚕24小时可见。强化期间保持水温28～29℃，盐度30～31
‰
，ph 7.8～8.2，持续供氧，日换水量80％。强化20天后，挑选卵巢发育饱满，颜色橘红的雌虾放入雄虾池进行自然交尾，交配时避免近亲交配。记录30天内所有雌虾的产卵次数及每次产卵量。建立雌虾繁殖力选择指数，计算公式如下：
23.yi＝0.5*(a
elfi-μ
elf
)*σ
elf-1
0.5*(a
aeni-μ
aen
)*σ
aen-1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
24.式中，yi是第i尾雌虾的繁殖力指数；a
elfi
和a
aeni
分别是第i尾雌虾的产卵频次和产卵量；μ
elf
和μ
aen
是全部雌虾产卵频次和产卵量的平均值；σ
elf
和σ
aen
是全部雌虾的产卵频次和产卵量的标准误差。
25.选择指数最高的30尾雌虾认为是高繁殖力组，选择指数最低的30尾雌虾(从未发现性腺成熟)认为是低繁殖力组。选择高繁殖力和低繁殖力雌虾各30尾组建繁殖力差异群体。解剖取肌肉组织于冻存管中，液氮保存。
26.实施例1
27.一、雌虾繁殖力相关候选分子标记筛选
28.1、测序数据过滤和比对
29.采用ctab法进行凡纳滨对虾肌肉dna提取。ctab法全称是十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide)。在1.5ml无菌酶离心管中加入1ml 1
×
ctab；取约20mg样本加入离心管中，研磨仪60hz打磨4min；65℃水浴锅中孵育60min；常温高速离心机，8000xg，离心5min；取离心后样本上清900μl到新的2ml无菌酶离心管中；向上清液中加入450μl氯仿；盖紧管盖颠倒混匀样本30s，直至溶液完全乳化成白色；常温高速离心机，13000xg，离心10min；转移800μl上清液至新的1.5ml无菌无酶离心管中；beckman agencourt ampure xp beads，室温避光平衡30min；加入上清液体积0.6倍混合均匀的beads，用移液器轻轻吹打混匀10次以上，室温静置5min；置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并弃除上清；保持上述1.5ml离心管固定在磁力架上，向管内加入200μl新鲜配置的80％乙醇，室温静置30s后，弃除上清，注意不要扰动磁珠；80％乙醇重复清洗一次；保持1.5ml离心管固定于磁力架上，室温干燥磁珠2～5min；将1.5ml离心管从磁力架上取下，加入50μl 10mm tris hcl洗脱液，用移液器轻轻吹打混匀，室温静置5min；将1.5ml离心管置于磁力架上，室温静置5min至溶液澄清，小心吸取上清液约50μl转移到对应的新的样本保存管中，即得到纯化后的dna。通过琼脂糖凝胶电泳分析dna的纯度和完整性；利用nanodrop检测dna的纯度(od260/280比值)，利用qubit对dna浓度进行精确定量。
30.将检验合格的dna样品等量混合为两个混合池，分别命名为高繁殖力dna混合池(he)和低繁殖力dna混合池(le)。混合dna样品通过covariss2/e210破碎机随机打断成长度为500bp的片段，dna片段经末端修复、加ploya尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illuminahiseq 2500进行测序，测序模式为pe150。对测序得到的raw reads进行过滤，得到clean reads，用于后续分析，测序数据结果见表1。
31.表1测序数据质控总览
[0032][0033]
过滤后的有效数据通过burrows-wheeler alignment tool(bwa)软件进行比对，比对结果经samtools软件去除pcr重复。平均测序深度在30x以上，可用于后续分析。
[0034]
2、基因组差异区域筛选
[0035]
以滑窗策略选择不同基因组区域：以50kb为单位窗口，25kb为滑动步长。针对所选特定基因组区域计算两个分离群间的核苷酸多样性差异倍数(π-ratio，取比值方式为π高繁殖力群/π低繁殖力群，)以及固定指数(fixation index,fst)，结合fst，π-ratio的结果，各自按群体间差异p《0.01筛选显著区域，交集部分为可靠的候选区间。
[0036]
3、标记检测及注释
[0037]
通过genome analysis toolkit(gatk)软件中的unified genotyper模块检测候
选区间的snp和indel，过滤参数设置为：-window 4，-filter"qd《2.0||fs》60.0||mq《40.0"，-g_filter"gq《20"。最终筛选出繁殖力差异群体的基因组差异区间内snp标记总数为64,046个，indel标记总数为20,295个。
[0038]
4、snp频率差异分析
[0039]
分别计算两个群体混池在每个位点的snp-index和indel-index，同时计算snp和indel的频率差异分布，方向如下：
△
(index)＝index(高繁殖力性状)-index(低繁殖力性状)。
[0040]
5、标记筛选
[0041]
对候选的snp和indel标记进行筛选，挑选位点在两个群体中
△
index接近1或者接近-1的位点作为下一步验证的优先选择位点。筛选标准如下：
[0042]
(1)根据snp位点的注释信息，再根据
│△
index
│
进行从高到低排序的基础上，优先选择同义、非同义突变或者上下游区域的位点；
[0043]
(2)根据indel位点的注释信息，再根据
│△
index
│
进行从高到低排序的基础上，优先选择插入或缺失碱基大于5个的位点。
[0044]
最终筛选出繁殖力分离群体频率差异较大的标记，共筛选出374个snp标记和26个indel标记。
[0045]
表2 snps和indel检测与注释统计结果
[0046][0047][0048]
二、繁殖力相关分子标记验证
[0049]
采用飞行时间质谱法在高繁殖力和低繁殖力群体中对产卵性状相关候选分子标记进行验证，具体的操作步骤如下：
[0050]
(1)pcr扩增：在标记位点侧翼序列设计引物，扩增出含有检测靶标的dna序列；
[0051]
(2)单碱基延伸：pcr扩增产物中加入snp序列特异延伸引物，通过iplex技术进行单碱基延伸。针对检测靶标，不同基因型只有延伸的末端目标碱基一个碱基的差异；
[0052]
(3)质谱检测：将单碱基延伸后的产物进行纯化，移到spectrochip芯片上，进行质谱检测。dna被激光照射带正电，在检测的真空管中飞行，飞行速度与各个延伸产物的质量成反比，最后通过出峰的位置，判断碱基类型，从而实现基因分型。
[0053]
(4)根据质谱检测结果统计每个个体的突变标记，并通过spss软件分析标记与繁殖力性状是否相关。
[0054]
具体的操作步骤如下：
[0055]
1、引物设计
[0056]
设计引物软件用sequenom公司genotyping tools及massarray assay design软件设计待测位点的pcr扩增引物及单碱基延伸引物。
[0057]
2、pcr扩增
[0058]
本发明中的pcr体系为：模板(10～30ng/μl)1μl，正向引物(10μm)0.25μl，反向引物(10μm)0.25μl，buffer 0.5μl，dntps(25mm)0.1μl，mgcl2(25mm)0.4μl，hotstar taq(5u/μl)0.1μl，ddh2o 2.4μl。
[0059]
按照上述体系加入样品后，再按照如下的反应条件进行pcr扩增：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火56℃25s，延伸72℃30s，共重复40个循环；最后延伸72℃4min；4℃保存。
[0060]
3、pcr产物碱性磷酸酶处理
[0061]
(1)pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimp alikaiine phosphtase虾碱性硫酸酶)处理，除去反应中的dntps。sap反应液配方如下(以单个样本为例)：sap buffer 0.17μl，sap enzyme(1.7u/μl)0.3μl，ddh2o 1.53μl。
[0062]
(2)用移液枪将sap反应液加入pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。
[0063]
(3)将已加入sap反应液的pcr反应板放入pcr仪中，运行如下反应程序：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。
[0064]
(4)反应结束，将pcr反应板取出短暂离心备用。
[0065]
4、延伸反应
[0066]
(1)配制iplex反应试剂(以单个样本为例)：iplex buffer(10x)0.12μl，iplex termination mix(10x)0.2μl，iplex enzyme(2u/μl)0.041μl，sap enzyme(1.7u/μl)0.3μl，引物使用液10μm 0.804μl，ddh2o 0.755μl；
[0067]
(2)用移液枪将iplex反应液加入pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心；
[0068]
(3)将pcr反应板放入pcr仪中，按照如下的反应条件进行pcr扩增：预变性94℃ 30s；变性94℃ 5s，退火52℃ 5s，延伸80℃ 5s，共重复40个循环；最后延伸72℃ 3min；4℃保存。
[0069]
5、产物纯化
[0070]
(1)树脂刮板上均匀覆盖树脂，放置20min。
[0071]
(2)将反应结束的pcr反应板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在pcr反应板上，敲击使树脂落入pcr反应板，封膜。
[0072]
(3)以pcr反应板的长轴为轴心，翻转pcr反应板20min，3500rpm、5分钟离心后备用。
[0073]
6、质谱检测
[0074]
(1)nanodispenser spectrochip芯片点样，将检测样品从pcr反应板转移到表面覆盖基质的massarray spectrochip芯片；
[0075]
(2)massarray analyzer compac质谱检测；
[0076]
(3)typer软件分析实验结果，获得分型数据。
[0077]
7、统计分析
[0078]
本发明得到一个分子标记7w2，其核苷酸序列如seq id no.1所示。根据表3和图1
所示，可以看出在7w2中第301位碱基c在高繁殖力组中等位基因频率为7.14％，而在低繁殖力组中碱基c的等位基因频率为0％，碱基c的占比在繁殖力分离群体中具有显著差异性(p《0.05)，因此可认为在该位点碱基c的等位基因频率≥7.14％为高繁殖力型群体，且该碱基仅在凡纳滨对虾高繁殖力群体中存在。其中开发分子标记7w2的扩增引物如seq id no.2和seq id no.3所示(表4)，延伸引物如seq id no.4所示(表4)。
[0079]
表3 7w2分子标记的分型结果
[0080][0081]
表4分子标记的引物
[0082][0083]
本发明获得的分子标记7w2能够用来辅助选择高繁殖力群体(家系、品系或地理群体)，应用步骤具体为：提取凡纳滨对虾群体内30尾以上测试样品的dna并将其作为模板，使用分子标记7w2的扩增引物7w2-f和7w2-r和延伸引物7w2-e进行飞行质谱分型，如果分型结果中7w2位点在群体内的第301位的碱基为c，且其等位基因频率≥7.14％，则该群体可以选择作为培育凡纳滨对虾高繁殖力的亲本。除此之外，分子标记7w2还能够用来分析凡纳滨对虾的传多样性、种质鉴定以及构建凡纳滨对虾的遗传图谱。
[0084]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。