替格瑞洛相关呼吸困难基因型检测试剂或试剂盒

1.本发明涉及医学生物检测技术领域，涉及检测cyp3a5基因突变位点rs776746作为分子标志物在替格瑞洛相关呼吸困难基因型诊断中的应用，尤其涉及cyp3a5基因突变位点rs776746在制备替格瑞洛相关呼吸困难基因型诊断试剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

2.替格瑞洛是一种新型的p2y12二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，adp)受体拮抗剂，其本身是活性药物，不需肝药酶代谢，可直接、快速发挥抑制血小板聚集的作用
1.。欧美最新指南均推荐对acs患者优先使用替格瑞洛抗血小板治疗
[2,3]
。plato研究显示，虽然替格瑞洛组患者心血管死亡、心肌梗死及脑卒中的复合发生率低于氯吡格雷组，但非冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，cabg)相关的出血事件和呼吸困难发生率较高
[4]
。呼吸困难是替格瑞洛的常见并发症之一，其发生率超过10％，不少患者因此而不得不换药治疗，替格瑞洛相关的呼吸困难很大程度上影响了患者的依从性。但替格瑞洛相关呼吸困难的发生原因并不明确，luis等
[5]
的研究也不支持其与腺苷水平相关。而且临床上替格瑞洛相关呼吸困难常较难判断，这些因素都影响了替格瑞洛的临床应用。
[0003]
snp(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)主要指基因上由单个核苷酸的变异引起的dna序列多态性，包括单个碱基的转换，插入和缺失等变异形式。人体表型差异，药物反应及疾病发生发展过程都可能与snp的多态性有关。不同的snp使个体对药物治疗，环境暴露等产生不同反应，snp可能是引起个体对药物产生不同程度反应的遗传基础。因此，snp在药物筛选及药效评价方面具有独特的价值，能够推动我国个体化医疗的发展。
[0004]
细胞色素p450酶是一种肝脏中的代谢酶，对多种药物代谢具有重要作用，研究发现细胞色素p450酶系中很多成员在人群中呈现遗传多态性，使药物在人体内的清除效率在个体间存在差异，产生不同的血药浓度，清除率低引起体内药物蓄积可能是引起某些药物不良反应的关键原因。luis等
[5]
的研究同样发现替格瑞洛血药浓度及其活性代谢物ar-c124910xx的血药浓度均与替格瑞洛相关呼吸困难的发生存在显著相关性，替格瑞洛的体内代谢过程可能是替格瑞洛相关呼吸困难发生与否的关键影响因素。cyp3a5和cyp3a41*g是细胞色素p450酶系成员之一，且在替格瑞洛代谢为ar-c124910的过程中发挥重要作用，在人群中亦存在遗传多态性。rs776746和rs2242480分别被报道是cyp3a5和cyp3a41*g上与药物反应相关的一种snp，存在cc、ct及tt三种基因型。
[0005]
目前针对基因多态性的检测有多种方法。sanger测序法是传统的检测snp的一种方法，sanger测序法检测时从核苷酸某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以a、t、c、g结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得可见dna碱基序列，这种方法准确度高，但是该方法需要较强的设备支持，一般实验室难以具备此条件；与此对应的，荧光定量pcr法所依据的原理不同gc含量的dna片段，其tm值不同，从而根据熔解曲线判断包含snp位
点的dna片段的碱基组成类型，与sanger法相比，荧光定量pcr只需要pcr即可进行检测，大多数实验室均具备这样的条件。
[0006]
目前对由于服用替格瑞洛而引起的呼吸困难仍缺少一种简便、准确的检测方法，若能找到替格瑞洛引起呼吸困难相关的snp作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，必将有力地推动我国抗血小板治疗个体化的发展，为临床医生用药决策提供数据支持，提高患者的依从性和远期预后。


技术实现要素：

[0007]
本发明针对上述问题进行，第一目的在于提供一种引起替格瑞洛相关呼吸困难的基因突变；第二目的在于提供该基因突变的用途，具体作为替格瑞洛相关呼吸困难基因型检测的诊断标志物的用途；第三目的在于提供一种检测引起替格瑞洛相关呼吸困难的snp位点基因型的生物制剂；第四个目的在于提供替格瑞洛相关呼吸困难的检测试剂盒。
[0008]
发明人通过分离和研究服用替格瑞洛的患者外周血dna中的单核苷酸多态性，寻找一种与替格瑞洛呼吸困难高度相关的高特异性及敏感性的snp，并研制出便于临床应用的替格瑞洛相关呼吸困难的检测试剂盒，为临床医生判断呼吸困难是否由替格瑞洛引起提供数据支持，从而精准优化患者的抗血小板治疗方案。
[0009]
通过实验证实，cyp3a5基因上snp rs776746位点为cc或ct突变型为替格瑞洛相关呼吸困难的易感基因，进一步确认了所述rs776746可用于替格瑞洛相关呼吸困难的检测，为临床医生合理用药提供数据支持。
[0010]
本发明的第一方面，提供了检测cyp3a5基因突变位点rs776746的试剂在制备检测替格瑞洛相关呼吸困难基因型的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
[0011]
优选的，所述的诊断试剂为检测生物样品中cyp3a5基因突变位点rs776746基因型的试剂；所述的诊断试剂盒包含了检测生物样品中cyp3a5基因突变位点rs776746基因型的试剂。
[0012]
该检测生物样品中cyp3a5基因突变位点rs776746含量的试剂选自对cyp3a5基因具有检测特异性的pcr引物，检测的是cyp3a5基因的rs776746位点多态性。引物的序列如下表1所示：
[0013]
表1 cyp3a5基因突变位点rs776746特异性检测引物
[0014][0015]
优选的，生物样品获自对象的外周血。
[0016]
本发明的第二方面，提供了一种检测替格瑞洛相关呼吸困难基因型的生物制剂，包括用于检测cyp3a5基因的引物对、预混定量pcr反应液、阳性质控品、阴性质控品。
[0017]
本发明的第三方面，提供了一种检测替格瑞洛相关呼吸困难基因型的试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中cyp3a5基因突变位点rs776746基因型的试剂，具体是由引物系统、扩增系统(预混定量pcr反应液)及阳性和阴性质控品组成。
[0018]
上述生物制剂或检测试剂盒中：
[0019]
引物序列如上表1所示，纯化方式为hplc纯化。
[0020]
预混定量pcr反应液(2
×
sybr green)包含定量pcr反应所需缓冲液、镁离子、dntp、sybr green等物质，可通过市场购买。
[0021]
阳性质控品的获取方法为，根据ncbi数据库公布的rs776746位点的序列信息，进行质粒构建合成，获得基因分型为cc或tt的纯合dna序列，即为cc型阳性质控品和tt型阳性质控品。
[0022]
阴性质控品为depc处理的去离子水。
[0023]
本发明的第四方面，提供了采用上述生物检测制剂或检测试剂盒进行替格瑞洛相关呼吸困难诊断的方法，如下：
[0024]
a.全血dna样本的提取：采用市场标准化的全血dna提取试剂盒进行基因组dna的提取；
[0025]
b.采用实时荧光定量pcr技术对cyp3a5基因突变位点rs776746的拷贝数进行定量检测，检测过程中所用引物如seq id no.1～2所示；
[0026]
c、结果判读
[0027]
反应结束后调取阳性质控品和待测样品的熔解曲线，进行结果的判读。阳性质控品cc(图1)及阳性质控品tt(图2)等溶解曲线特征为单峰曲线。杂合型的基因型为ct，其熔解曲线特征为双峰(图3)，以此为判读要点可通过与阳性质控品对比而将ct型判读出来(图4、图5)，cc与tt型的判读要点为cc型的tm值大于tt型的tm值。
[0028]
本发明的有益保障及效果如下：
[0029]
发明人从工作单位医院取得了大量的大量例因急性冠脉综合征接受经皮冠状动脉介入治疗术后需长期抗血小板治疗而服用替格瑞洛的患者血液样本，为本发明的研究提供了有力的保障。
[0030]
目前，对于替格瑞洛相关呼吸困难发生的原因尚不十分清楚，一定程度上影响了替格瑞洛的应用，本发明通过大量数据验证，发现本试剂盒所检测的snp位点与替格瑞洛相关呼吸困难的发生高度相关，故而能够提供一种判断替格瑞洛相关呼吸困难的依据，帮助临床医生个性化判断，优化抗血小板治疗方案，提高患者依从性。
[0031]
就技术而言，cyp3a5基因突变位点rs776746的检测本质上是一种血液基因组的定量pcr检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。检测实验室只需具备常用的定量pcr扩增仪器就可进行检测，相比sanger测序而言，方便快捷，且能够较快地获得检测结果。
附图说明
[0032]
图1为cc型阳性质控品的熔解曲线；
[0033]
图2为tt型阳性质控品的熔解曲线；
[0034]
图3为ct型阳性质控品的熔解曲线；
[0035]
图4为cc型与ct型熔解曲线的对比，二者形态明显不同；
[0036]
图5为ct型与tt型熔解曲线的对比，二者熔解曲线形态不同且tm(tt)＜tm(ct)；
[0037]
图6为cc型与tt型熔解曲线的对比，二者tm值不同，tm(tt)＜tm(cc)。
具体实施方式
[0038]
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0039]
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0040]
实施例一cyp3a5基因突变位点rs776746确定
[0041]
一、样本的收集和样本资料整理
[0042]
发明人于2019年1月至2020年10月在海军军医大学第一附属医院采集了大量例因急性冠脉综合征接受经皮冠状动脉介入治疗术后需长期抗血小板治疗而服用替格瑞洛的患者血液样本，并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
[0043]
研究样本选择标准如下：
[0044]
(1)存在明确的心肌缺血症状，心电图st段改变》1mm，肌钙蛋白明显升高，lvef》50％，经冠脉造影明确诊断的急性冠脉综合征病例200例；
[0045]
(2)排除依存性差、不能规律服药，或存在易引起呼吸困难的其他基础疾病如心衰、copd、房颤、睡眠呼吸暂停综合征等，以及因治疗需要服用易引起呼吸困难相似症状的其他药物如acei类、阿片类、茶碱及细胞色素p450抑制剂等。
[0046]
二、外周血基因组dna的提取和纯化：
[0047]
1、血液样本处理
[0048]
(1)使用含有edta抗凝剂的采血管采集外周静脉血1-2ml，血液样品保存要点为4℃不超过一周，-20℃以下不超过3个月；
[0049]
(2)向15ml林新馆加入15μlproteinase k(20mg/ml)溶液，加入1ml血液样本，混匀；
[0050]
(3)向装有血液样本的离心管中加入2.4ml缓冲液ge，震荡30sec混匀；
[0051]
(4)65℃放置10min，每隔3min震荡一次，以助裂解，简短离心收集管盖内壁水珠。
[0052]
(5)向样本中加入2ml无水乙醇，混匀；
[0053]
(6)将上一步所得溶液转移至吸附柱cb5中，3000rpm离心3min，弃废液；
[0054]
(7)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液gd，5000rpm离心1min，弃废液；
[0055]
(8)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液pw，5000rpm离心1min，弃废液；
[0056]
(9)向吸附柱cb5中加入2ml缓冲液pw，5000rpm离心15min，弃收集管，将吸附柱cb5放入新的15ml离心管中；
[0057]
(10)向吸附膜中间部位悬空滴加300μl洗脱缓冲液tb，室温放置5min，5000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0058]
2、全血dna提取
[0059]
使用市场标准化的全血dna提取试剂盒tianamp blood dnakit(tiangen)进行基因组dna的提取。需要明确的，为了保证试剂盒的检出率和准确率，所得基因组dna浓度应当不低于1ng/μl，且od260/280应该介于1.7-1.9之间。推荐使用的dna浓度为100-500ng/μl。
[0060]
3、rs776746和rs2242480的基因分型检测
[0061]
(1)取受试者dna样本；
[0062]
(2)设计单个snp的特异性扩增引物；
[0063]
(3)进行pcr反应，回收产物进行sanger测序；
[0064]
(4)结合临床资料比较发生呼吸困难病例及未发生呼吸困难病例中不同rs776746和rs2242480基因型的分布差异。
[0065]
表2和表3为200例患者rs776746及rs2242480基因型及呼吸困难发生情况：
[0066]
表2 rs776746基因型及呼吸困难发生情况汇总
[0067][0068]
表3 rs2242480基因型及呼吸困难发生情况汇总
[0069][0070]
经统计学检验，rs776746基因型为cc的病人与ct的病人服用替格瑞洛后呼吸困难的发生率之间无统计学差异(p＝0.573)，而这两组病人与碱基对为tt的病人服用替格瑞洛后呼吸困难的发生率存在显著差异(rs776746基因型cc与tt：p＝0.024，ct与tt：p＝0.029)。rs2242480三种基因型的病人服用替格瑞洛后呼吸困难发生率均无统计学差异(rs2242480基因型cc与ct：p＝0.431；cc与tt：p＝0.624，ct与tt：p＝0.632)。
[0071]
上述实验证明了cyp3a5基因上snp rs776746基因型为cc或ct突变型为替格瑞洛相关呼吸困难的易感基因，而cyp3a41*g基因上snp rs2242480与替格瑞洛相关呼吸困难无关。进一步确认了所述rs776746可用于替格瑞洛相关呼吸困难的检测，为临床医生合理用药提供数据支持。
[0072]
实施例2替格瑞洛相关呼吸困难基因型检测
[0073]
一、全血dna样本的提取
[0074]
提取步骤同实施例一。
[0075]
二、定量pcr反应
[0076]
1、pcr反应体系配置
[0077]
按照如下表4所示标准配置实时荧光定量pcr反应体系：
[0078]
表4实时荧光定量pcr反应体系
its association with clinical outcomes[j].eur heart j,2011,32(23):2945-2953.
[0093]
[5]ortega-paz l,brugaletta s,ariotti s,et al.adenosine and ticagrelor plasma levels in patients with and without ticagrelor-related dyspnea[j].circulation,2018,138(6):646-648.
[0094]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
[0095]